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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

Le but du présent protocole doit démontrer une méthode efficace pour decellularize et détartre limaçon souris pour utilisation comme échafaudages pour applications d’ingénierie tissulaire.

Abstract

Chez les mammifères, les cellules ciliées mécanosensoriels qui facilitent l’absence d’audience la capacité de régénération, qui a limité les traitements pour la perte auditive. Les stratégies actuelles de la médecine régénérative ont mis l’accent sur la transplantation de cellules souches ou manipulation génétique d’entourant les cellules de soutien dans l’oreille interne pour encourager le remplacement des cellules endommagées de tige pour corriger une perte auditive. Pourtant, la matrice extracellulaire (ECM) peut jouer un rôle vital dans l’induction et de maintien de la fonction des cellules ciliées et n’a pas été bien étudiée. À l’aide de la vis d’Archimède ECM comme un échafaudage à cultiver des cellules souches adultes peut-être fournir un aperçu unique Comment la composition et l’architecture de l’environnement extracellulaire aide les cellules à maintenir une fonction d’audition. Nous présentons ici une méthode pour isoler et decellularizing limaçon des souris à utiliser comme échafaudages acceptant les cellules souches adultes perfusés. Dans le protocole actuel, limaçon est isolés des souris euthanasiés, DECELLULARISE et détartré. Par la suite, les cellules de la gelée de Wharton humaine (hWJCs) qui ont été isolés dans le cordon ombilical ont été soigneusement perfusés dans chaque cochlée. Le limaçon servaient de bioréacteurs, et les cellules ont été cultivés pendant 30 jours avant de subir le traitement pour l’analyse. Limaçon DECELLULARISE conservé des structures extracellulaires identifiables, mais n’a pas révélé la présence de cellules ou des fragments d’ADN visibles. Les cellules perfusés dans la cochlée envahirent la plus grande partie de l’intérieur et l’extérieur de la cochlée et grandit sans incident pendant une durée de 30 jours. Ainsi, la méthode actuelle peut servir à étudier comment cochléaire ECM affecte le développement de cellules et de comportement.

Introduction

La cochlée est une structure complexe en spirale dans l’OS temporal. Il est composé d’un labyrinthe osseux externe et un labyrinthe membraneux concentriques, intérieure1. Le labyrinthe membraneux se compose de trois espaces fluides : Scala vestibulaire, Scala media et Scala timbales1. Les médias de scala abrite l’épithélium sensoriel, qui est composé d’une multitude de types de cellules, mais les cellules sensorielles de cheveux (HC), qui transmettre l’énergie mécanique en ondes sonores d’influx nerveux2, sont particulièrement intéressants. Exposition au traumatisme acoustique3,4,5, médicament6, maladie7,8et vieillissement,9 peut tous entraîner dysfonctionnement auditif par l’intermédiaire de la mort HC. Perte des cellules ciliées chez les mammifères est permanente, contrairement à aviaires HCs, qui peuvent se régénérer après blessure10.

Une variété de recherches contemporaines ont cherché à restaurer perdus HCs, bien que les approches expérimentales spécifiques varient. Manipulation de l’expression génique dans l’épithélium sensoriel et l’implantation de cellules souches différenciées en dehors du corps sont des approches dominantes dans le domaine, bien que les méthodes d’induction qui cherchent à différencier des cellules souches dans cochlear organoïdes ont été tentative de11,12,13. Chacune de ces approches est soit directement sur les cellules souches, ou les indices de développement utilisés par les cellules souches ; Cependant, une seconde partagé, et potentiellement critiques, élément est l’ECM de la cochlée elle-même14,15.

L’ECM propose non seulement un support physique des cellules et des tissus, ce qui inclut une surface pour l’adhésion cellulaire, la prolifération, la survie et la migration, mais joue également un rôle crucial dans le développement du HCs et la spirale ganglion15,16 ,,17. Naturellement présents ECM propose des signaux inductifs qui peuvent guider la détermination du phénotype cellulaire et/ou d’adhérence, la prolifération et la survie cellulaire18. Par conséquent, l’utilisation de la cochlée DECELLULARISE en combinaison avec des hWJCs cultivées offrent une occasion unique d’explorer le rôle de la régénération de l’ECM et HC. HWJCs sont un type de cellule facilement disponible, non sujettes à controverse isolé de cordons ombilicaux humains qui se comportent comme des cellules souches mésenchymateuses19. HWJCs ont démontré la capacité de différencier vers le bas de la cellule neurosensorielle lignées20,21. Ainsi, le protocole actuel en détail l’isolement, DÉCELLULARISATION et la perfusion du limaçon de carcasses de souris C57BL avec hWJCs pour l’ingénierie tissulaire oreille interne.

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Protocol

Toutes les procédures, y compris l’euthanasie animale, ont été effectuées selon le protocole institutionnel animalier et utilisation Comité (IACUC) approuvé (APUC #2014-2234) à l’Université du Kansas Medical Center (KUMC).

Remarque : HWJCs ont été isolées de cordons ombilicaux humains qui ont été donnés par les patients qui a donné son consentement éclairé et spécimens ont été utilisés conformément aux protocoles approuvés par le Comité de sujets humains Université du Kansas (KU-CISR #15402).

1. l’OS Temporal récolte et l’isolement de la cochlée

  1. Décapiter une souris convenablement euthanasiée, 15 semaines de coupe entre le crâne et la première vertèbre cervicale avec des ciseaux chirurgicaux aiguisés, puis vaporiser vers le bas de la tête avec l’éthanol à 70 % pour désinfecter (Figure 1 a).
  2. Coupent le crâne dans un plan longitudinal à l’aide de la même paire forte de ciseaux chirurgicaux (Figure 1 b-C, lignes pointillées).
  3. Retirez le tissu cérébral du crâne à l’aide d’une paire de pinces (Figure 1, flèche).
  4. Identifier l’OS temporal à travers la présence de l’auditif et les racines de nerf vestibulaire (Figure 1E-F, pointes de flèche) à l’intérieur du crâne et le conduit auditif de l’extérieur (Figure 1F, flèche). Découpez soigneusement à travers le crâne pour isoler l’OS temporal du reste du crâne (Figure 1).
    Remarque : Dans certains cas, il peut être possible de dégager délicatement l’OS environnants du crâne de l’OS temporal sans nécessiter de coupe.
  5. Insérer la pince fine dans l’ouverture du conduit auditif environ 5 mm (Figure 1 H), donc les conseils ne risquent pas de percer la cochlée. Casser délicatement l’os de la bulle tympanique (Figure 1 H, haut rouge zone ombrée) donc il fractures (ligneFigure 1I, rouge pointillée).
    Remarque : Si nécessaire, un microscope à dissection peut aider dans ce processus afin d’assurer un positionnement précis et la manipulation des instruments.
  6. À l’aide de pinces fines, dégager loin le reste de la bulle tympanique de l’OS temporal, exposant le labyrinthe osseux de la cochlée (Figure 1J, supports de rouges).
  7. Placez une boîte de Pétri assez grande pour contenir de l’OS temporal (p. ex., 30 mm ou plus) sous la dissection étendue de champ et remplissez-le avec assez Phosphate Buffered Saline (PBS) pour couvrir l’OS temporal (par exemple, 0,5 à 1 mL).
  8. Plonger l’OS temporal avec la bulle tympanique supprimée dans le PBS avec les fenêtres ovales et rondes de la cochlée vers le haut.
    Remarque : Suppression du système vestibulaire de la cochlée n’est pas nécessaire, car le système vestibulaire sert bien une poignée de manipulation et d’orienter les caractéristiques de la cochlée (Figure 1I et Figure 2 b).
  9. Avec un ultra fine paire de pinces, retirer l’artère stapédiens, qui traverse l’étrier.
  10. Insérez une extrémité de la pince ultra fine à travers l’arche de l’étrier où l’artère est transmise et soulever délicatement l’étrier. L’étrier désarticulés devrait soulever hors de la fenêtre ovale.
  11. À l’aide d’une pointe de la pince ultra-fine, perforer l’ovale et ronde de windows.
  12. À l’aide d’une solution de PBS 1 x rempli de 28,5 calibre seringue avec tuyau (diamètre intérieur 0,28 mm, diamètre extérieur 0,61 mm) attaché, positionner le tube sur la fenêtre ovale (Figure 2 a -B).
    Remarque : L’ouverture du tube peut être manipulé à l’aide de la pince ultra-fine contribuant à assurer un positionnement précis.
    1. Utiliser une seringue fraîche et les tubes pour chaque cochlée.
  13. Perfuse 2 mL d’antibiotique-antimycosiques (anti-anti) 10 % et 10 % la pénicilline-streptomycine (stylo-strep) dans du PBS par le biais de la cochlée pendant 5 min pour enlever la périlymphe. Perfusant trop vite avec trop de pression peut endommager les structures fines dans la cochlée.
    Remarque : Conduire manuellement la seringue à la main pour perfuse le liquide dans la cochlée est efficace, bien qu’une pompe à perfusion pourrait être utilisée comme une alternative.
    1. Si perfusant manuellement, utilisez une paire de fines, fermeture automatique des pinces pour stabiliser la cochlée (Figure 2 a) au cours de la perfusion en saisissant la partie vestibulaire de l’OS temporal.
      Remarque : Bien que non obligatoire, ce qui laisse les deux mains libres pour manipuler les instruments ; une main peut conduire à la seringue (Figure 2 a) tandis que l’autre permet de positionner le tube de façon appropriée (Figure 2 b).
    2. De cette étape vers l’avant, prenez soin de ne pas exposer la cochlée inutilement à l’air. Introduire des bulles d’air dans les espaces fluides se bloque la circulation du fluide, et les sécher n’endommage les structures fines dans la cochlée.
  14. Retirez et jetez n’importe quel muscle tissu et l’OS fragments restants à l’aide de pinces fines.
  15. Si nécessaire, stocker limaçon isolé à 4 ° C en solution de strep-stylo de 10 % dans du PBS et anti-anti 10 % jusqu'à sept jours, avec des changements réguliers de solution antibiotique toutes les 48 h.

2. cochléaire traitement

  1. DÉCELLULARISATION
    1. Pour chaque cochlée, remplir un flacon à scintillation de verre de 20 mL avec un 1 % sodium dodécyl sulfate solution (SDS) dans de l’eau déminéralisée (DI), qui sert à decellularize la cochlée.
    2. Couper l’extrémité hors d’une pipette de transfert 7 mL en plastique à l’aide d’une lame de rasoir afin que l’ouverture soit assez grande pour une cochlée de passer à travers.
    3. À l’aide de la pipette de transfert, doucement dresser la cochlée dans la pipette alors il passe juste au bord de la coupure de quelques millimètres.
    4. Expulser la cochlée dans le flacon 1 % de scintillation rempli de solution SDS.
    5. Faire circuler 2 mL de SDS de 1 % dans de l’eau déminéralisée (DI) par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.
    6. Placer le flacon à scintillation dans une coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante.
      1. Changez 1 % SDS solution toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement de SDS pour ne pas exposer la cochlée dans l’atmosphère.
    7. Laver la cochlée trois fois de 30 min chacun, avec l’eau distillée.
Effectuer les lavages dans le même flacon à scintillation, utilisé pour des charges de la SDD ; à ce stade, la cochlée est DECELLULARISE.
  • Décalcification
    1. Retirez l’eau DI le flacon à scintillation, laissant juste assez pour garder la cochlée submergés.
    2. Pour commencer une décalcification, ajouter 5 mL de 10 % d’acide tétraacétique (EDTA) (0,02 M) dans l’eau distillée dans le flacon à scintillation contenant de la cochlée.
    3. Faire circuler 2 mL d’EDTA 10 % dans l’eau distillée par le biais de la cochlée dans le flacon à scintillation à l’aide d’une pipette de transfert.
    4. Remettre le flacon à scintillation dans la coiffe et laisser le flacon à scintillation de tourner à 10 tr/min pendant 72 h à température ambiante. Changer la solution d’EDTA 10 % toutes les 24 h sur une période de 72 h. Faites attention lors du changement des solutions afin que la cochlée n’est pas exposée à l’air.
    5. Rincer la cochlée 3 fois pendant 2 h chacune avec du PBS 1 x ; à ce stade, la cochlée est détartrée.
  • Stockage
    1. Stocker le limaçon pendant 72 h dans une anti-anti, 10 % plume strep-solution à 10 % dans du PBS à 4 ° C.
      Remarque : Les plus longues périodes de stockage peuvent être possibles avec des changements réguliers de solution antibiotique ; Toutefois, un stockage prolongé de limaçon transformés n’a pas été validé dans le présent protocole.

    • 3. achats et l’Expansion des hWJCs

    1. Isoler les hWJCs selon les protocoles publiés antérieurement22. En bref, les cordons ombilicaux segment en sections de 3 cm.
    2. Faites une incision peu profonde avec un scalpel dans la longueur sur chaque segment du cordon ombilical de dérouler et d’exposer la gelée de Wharton du cordon ombilical. Forceps permet de supprimer les vaisseaux sanguins.
    3. Laver les segments de cordon ombilical deux fois avec assez de PBS (p. ex., 40 mL dans une boîte de Pétri de 60 mm) pour submerger le tissu. Finement hacher des segments de tissus avec un scalpel. Digérer le tissu dans une boîte de Pétri avec 50 mL de milieu de digestion de 100 mm (collagénase de type 2 de 0,2 %, 1 % la pénicilline-streptomycine, en basse-glucose moyen (DMEM d’aigle modifié de Dulbecco)).
    4. Placer le tissu en digérant moyen dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant la nuit dans un 5 % CO2, incubateur de 37 ° C. Le lendemain, diluer milieu de digestion à un ratio de 01:16 dans 2 % antibiotique-antimycosiques dans du PBS et cellules de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pour 10 min. jetez surnageant.
    5. Remettre en suspension les boulettes dans le cellules souches mésenchymateuses croissance moyen (MSCGM) et recombiner des cellules. Cellules de la plaque à une densité de 7 x 103 cellules/cm2 en culture de tissus traitement flacons T-75. HWJCs en MSCGM de la culture et étendre au passage 5 pour des expériences.
      Remarque : HWJCs peut être Sub cultivées dans plus grands T-fioles (p. ex., T-150, T-300) lors de passage pour augmenter le rendement des hWJCs pour des expériences.

    4. l’injection de hWJCs dans Decellularized limaçon

    1. Préparer le limaçon DECELLULARISE
      1. À l’aide d’une technique aseptique, laver limaçon stockées dans du PBS 1 x trois fois pour chaque 30 min.
      2. Transférer le limaçon dans puits séparés d’une plaque 24 puits et ajouter 1 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM.
      3. Incuber le limaçon dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire pendant au moins 1 h avant l’injection de cellules.
    2. Dissocier hWJCs et remettre en suspension
      1. HWJCs de lavage avec 37 ° C préchauffé solution 1 PBS x deux fois.
      2. Ajouter suffisamment 37 ° C préchauffé trypsine avec EDTA 0,5 % pour couvrir la surface du navire cellulaire.
      3. Incuber les hWJCs jusqu'à 5 min dans un 5 % CO2, 37 ° C incubateur de culture cellulaire.
        1. Vérifiez que 90 % des cellules ont détaché de la surface de culture cellulaire en affichant des cellules sous un microscope inversé.
          Remarque : Les cellules qui se déplacent lorsque le récipient de culture est tapoté doucement, ont détaché. Les cellules qui restent fixes, n’ont pas détaché.
        2. Tapoter légèrement les côtés du ballon pour déloger davantage les cellules attachées.
      4. À l’aide d’une technique aseptique, transfert hWJCs du récipient de culture dans un tube conique de 50 mL contenant un volume équivalent de MSCGM pour le volume de la trypsine permettant de dissocier les cellules.
      5. Le hWJCs de granule par centrifugation à 500 g à la température ambiante (~ 27 ° C) pendant 5 min.
      6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les hWJCs en MSCGM à une concentration de 500 000 cellules/mL.
    3. Perfuse limaçon
      1. Limaçon de transfert à une nouvelle plaque 24 puits à l’aide d’une pipette de transfert.
      2. Ajouter une goutte de MSCGM à chaque cochlée afin d’empêcher toute cochlée ne se dessèchent pas.
      3. Délicatement, orienter la cochlée avec une pincette ultra fines pour que la fenêtre ovale et ronde pointent vers le haut.
        Remarque : Faire extrêmement attention lorsque vous manipulez directement chaque cochlée comme la cochlée est facilement endommagée.
      4. À l’aide d’une seringue stérile calibre 28,5 insuline avec tuyau connecté, établir 0,2 mL resuspendue hWJCs (100 000 cellules).
      5. À l’aide de pinces fines stérilisé, positionner le tube au-dessus de la fenêtre ovale.
      6. Lentement et délicatement perfuse la cochlée avec 0,2 mL de hWJCs remises en suspension à l’aide d’une seringue à insuline 28,5-Manomètre reliée au tuyau de polyéthylène (diamètre extérieur : 0,61 mm, diamètre intérieur : 0,28 mm) pendant environ 5 min.
      7. Après la perfusion, ajouter 0,8 mL de 37 ° C préchauffé MSCGM dans la cupule contenant la cochlée pour porter le volume total dans le puits à 1 mL.
      8. Répétez les étapes 4.3.3-4.3.7 pour chaque cochlée, à l’aide d’une seringue fraîche et tube à chaque fois.
      9. Place perfusés limaçon dans un 5 % de CO2et 37 ° C incubateur de culture cellulaire changement médias trois fois par semaine.

    5. préservation et la récolte de la cochlée

    NOTE : Limaçon peut-être être cultivés et récoltés à n’importe quel point du temps de perfusion après de jusqu'à 30 jours.

    1. Afin de préserver le limaçon, difficulté à la paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C sur une plate-forme bascule.
    2. Après fixation, laver le limaçon avec du PBS 1 x trois fois de 5 min chacun.
    3. Peu à peu déshydrater la cochlée avec de l’éthanol et clair avec un solvant hydrocarbure aliphatique avant l’intégration à la paraffine.
    4. Section des échantillons jusqu'à une épaisseur de 10 µm à l’aide d’un microtome et monter sur lames de microscope de verre.
      Remarque : Les échantillons sont maintenant prêts à histologique ou immunohistochimique de traitement à l’aide de protocoles standard.

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    Representative Results

    En utilisant les méthodes présentées ici, DÉCELLULARISATION réussie du limaçon a été évaluée en examinant la présence ou l’absence de l’ADN à travers 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Limaçon était considérés comme pleinement DECELLULARISE si l’ADN n’a pas été identifié dans la cochlée DECELLULARISE. Une cochlée native d’une expérience antérieure qui n’a pas subi de DÉCELLULARISATION ou décalcification a été utilisée comme témoin positif pour illustrer les structures et les cellules, on trouves traditionnellement dans une cochlée de souris C57BL. La cochlée DECELLULARISE-décalcifiés, qui n’avait pas tout hWJCs infusé, a été utilisée comme contrôle négatif. Pas quantifiables noyaux cellulaires DAPI coloré ont été observés dans toutes les régions de la section de tissus (Figure 3). Deux limaçon était DECELLULARISE décalcifiés et puis imprégné de hWJCs pour le projet actuel. Le limaçon DECELLULARISE-détartrer qui est perfusés avec des hWJCs ont été observés d’avoir de nombreux DAPI teinté noyaux dans la cochlée et ça grimpe sur la coque osseuse en dehors de la cochlée (tableau 1). Total estimé de la densité des cellules pour la cellule infusé cochlée première étaient 113 759 cellules/cochlée après 30 jours de culture (Figure 4 et Figure 5) et pour la deuxième cochlée étaient 118 732 cellules/cochlée après 30 jours de culture (Figure 6 et La figure 7). Ces estimations de la densité cellulaire incluent les timbales Scala Scala media et Scala vestibule et volumes des structures trouvées dans les trois espaces fluides, mais ces estimations exclu tout du labyrinthe osseux restant. En outre, des échantillons de chaque cochlée sont colorés à l’hématoxyline et éosine (H & E) montrer la présence de cellules et des caractéristiques anatomiques dans chaque cochlée (Figure 8). L’anatomie générale des microstructures cochléaires est resté essentiellement inchangé tout au long de toutes les sections colorées ; Toutefois, aucune cellule n’était identifiables dans la section DECELLULARISE-détartrer (Figure 8 b). L’identification des noyaux des cellules était radicalement différente entre la cochlée native (Figure 8 a) et le limaçon DECELLULARISE-détartrer imprégné de cellules (Figure 8–D).

    Figure 1
    Figure 1 : souris OS temporal isolement. Une fois que la souris a été euthanasiée convenablement, décapiter l’animal par une coupe entre la base du crâne et la première vertèbre cervicale et la tête de pulvérisation avec de l’éthanol pour désinfecter (A). Coupent le crâne dans un plan sagittal de la section (CdeB–) à l’aide des ciseaux chirurgicaux, coupant à travers les tissus du cerveau et les os aiguisés. La tête de souris bissection (D, Mandibule inférieure supprimé pour des travaux expérimentaux indépendant) doit alors avoir le tissu de cerveau enlevé pour faire apparaître l’OS temporal. Les deux foramens à travers lequel le col auditif et vestibulaire nerfs (pointes de flèchesE, rouge) sont utiles indices permettant d’identifier correctement l’OS temporal. Retirez la chair du crâne (F). Le conduit auditif externe (F, flèche, panneau supérieur) fournit un signal externe utile aussi bien. Soigneusement couper l’OS en excès, laissant juste l’OS temporal isolés (G). La bulle tympanique (H, panneau supérieur, zone en surbrillance rouge) doit ensuite être délicatement retirée à l’aide de pinces fines (H, panneau inférieur). La bulle tympanique est OS minces et peut être facilement train de s’effriter (I) jusqu'à ce que le labyrinthe osseux de la cochlée est révélée (J, rouge entre parenthèses). Barres d’échelle sur toutes les images sont mm 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2 : Perfusion cochléaire. Une fois l’OS temporal a été isolé et la bulle tympanique a été supprimée, la cochlée peut ensuite être mises en place une perfusion à un microscope. Lorsque perfusant l’aide d’une seringue entraînée manuellement avec la tuyauterie fixée (A, ligne en pointillé), il peut être utile stabiliser la cochlée en utilisant une paire de pinces de fermeture automatique. Doucement, fixez la pince sur la partie vestibulaire de l’OS temporal (B) et reposer le forceps contre le rebord de la boîte de Pétri (A). Ce qui laisse les deux mains libres pour manipuler des instruments durant la perfusion. Une main peut alors manipuler la seringue, en contrôlant la vitesse d’écoulement du fluide, alors que l’autre main peut positionner le tube sur la fenêtre ovale à l’aide d’une deuxième paire de pinces (B). Couper l’extrémité libre du tuyau à un angle permet un positionnement plus facile, permettant la tubulure à placer correctement sans bloquer le champ de vision. Barre d’échelle est 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3 : section de tissu d’une cochlée souris DECELLULARISE. Un microscope vertical d’épi-fluorescence a été utilisé à l’image des échantillons à un grossissement de 200 X (10 X oculaire et objectif 20 X). Des images ont été cousues ensemble pour créer environ un montage de 4 x 5. DAPI absence d’affichage des cellules de la coloration nucléaire est affiché dans le panneau A en utilisant un ensemble de filtre commun DAPI (350 nm excitation, émission à 470 nm) et une surexposée, image en niveaux de gris de l’autofluorescence en utilisant un filtre commun de fluorescéine isothiocyanate (FITC) ensemble (une excitation 490 nm, émission à 525 nm), qui fournit des repères anatomiques, est montré dans le groupe B. Du nombre de cellules automatisées ont été effectué dans trois régions d’intérêt, qui sont délimitées sur les panneaux A et B. Nombre total de cellules ont été calculé pour la section de tissus ensemble (1, ligne blanche continue) et la cochlée (2, ligne pointillée). Ces deux numéros ont été utilisées pour calculer le nombre de cellules dans les structures osseuses à l’extérieur de la cochlée mais à l’intérieur les bords extérieurs, osseux de la section de tissu (3, l’espace entre la ligne pointillée et la ligne pointillée). Barres d’échelle sur toutes les images sont 500 µm.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4 : une section près de-modiolar de la cochlée DECELLULARISE souris 1 imprégné de hWJCs. La coloration des noyaux au DAPI apparaît dans panneau Qu'a superposer sur une surexposée, autofluorescence en niveaux de gris de la couche verte, qui fournit des repères anatomiques. Automatisée de cellules chefs d’accusation ont été effectuées dans trois régions d’intérêt, qui sont définies dans le groupe A. Nombre total de cellules ont été calculé pour la section de tissus ensemble (1, ligne blanche continue) et la cochlée (2, ligne pointillée). Ces deux numéros ont été utilisées pour calculer le nombre de cellules dans les structures osseuses à l’extérieur de la cochlée mais à l’intérieur les bords extérieurs, osseux de la section de tissu (3, l’espace entre la ligne pointillée et la ligne pointillée). La coloration DAPI isolé est figure dans le groupe B, et le seuil de la souillure de DAPI utilisé lors de la quantification automatique est à panneau C. Barres d’échelle sur toutes les images sont 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5 : vue de fort grossissement d’une section proche-modiolar de la cochlée DECELLULARISE souris 1 imprégné de hWJCs. La coloration des noyaux au DAPI apparaît dans panneau Qu'a superposer sur une image surexposée, de nuances de gris de l’autofluorescence de la couche verte, qui fournit des repères anatomiques. La coloration DAPI isolé est figure dans le groupe B, et l’image de seuil utilisée pendant le comptage cellulaire automatisée est à panneau C. Les espaces fluides et microstructures plus fines, logés dans la cochlée sont bien préservés pendant la DÉCELLULARISATION et phases de la culture de l’expérience de la cellule. Scala vestibulaire (SV), timbales (SM) de la Scala, Membrane basilaire (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), Ligament Spiral (SL) et strie vasculaire (*). Membrane de Reissner n’était pas clairement défini dans des sections de tissu, et en conséquence les médias de la Scala n’était pas clairement défini. Barres d’échelle sur toutes les images sont 250 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6 : une section près de-modiolar de la cochlée DECELLULARISE souris 2 qui a été imprégnée de hWJCs. La coloration des noyaux au DAPI est montrée panneau A, à superposer sur autofluorescence en niveaux de gris de la couche verte, qui fournit des repères anatomiques. Automatisée de cellules chefs d’accusation ont été effectuées dans trois régions d’intérêt, qui sont définies dans le groupe A. Nombre total de cellules ont été calculé pour la section de tissus ensemble (1, ligne blanche continue) et la cochlée (2, ligne pointillée). Ces deux numéros ont été utilisées pour calculer le nombre de cellules dans les structures osseuses à l’extérieur de la cochlée mais à l’intérieur les bords extérieurs, osseux de la section de tissu (3, espace entre les pointillés et les lignes pointillées). La coloration DAPI isolé est figure dans le groupe B, et le seuil de la souillure de DAPI utilisé lors de la quantification automatique est à panneau C. Barres d’échelle sur toutes les images sont 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 7
    Figure 7 : vue de fort grossissement d’une section de près-modiolar de la cochlée DECELLULARISE souris 2 qui a été imprégnée de hWJCs. La coloration des noyaux au DAPI est montrée panneau A, à superposer sur autofluorescence en niveaux de gris de la couche verte, qui fournit des repères anatomiques. La coloration DAPI isolé est figure dans le groupe B, et l’image de seuil utilisée pendant le comptage cellulaire automatisée est à panneau C. Les espaces fluides et microstructures plus fines, logés dans la vis d’Archimède sont conservées pendant les phases de la culture DÉCELLULARISATION et cellulaire de l’expérience. Scala vestibulaire (SV), timbales (SM) de la Scala, Membrane basilaire (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), Ligament Spiral (SL) et strie vasculaire (*). Membrane de Reissner n’était pas clairement défini dans des sections de tissu, et en conséquence les médias de la Scala n’était pas clairement défini. Barres d’échelle sur toutes les images sont 250 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    Figure 8
    Figure 8 : hématoxyline et éosine coloration de contrôle et traitée limaçon. L’hématoxyline et éosine coupes affichant une cochlée typique avec des cellules natives présentes colorées est montré dans le groupe A. Panneau B contient les mêmes structures que le groupe A, mais provient d’une cochlée entièrement DECELLULARISE, qui laisse derrière lui de la matrice extracellulaire. Le limaçon démontré précédemment deux imprégné de hWJCs est vus dans les séries C et D. L’anatomie cochléaire brut reste essentiellement inchangé par les DÉCELLULARISATION et les processus de culture cellulaire, bien que les populations de cellules spécifiques et les lieux est considérablement altérées. Scala vestibulaire (SV), timbales (SM) de la Scala, Membrane basilaire (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), Ligament Spiral (SL) et strie vasculaire (*). Barres d’échelle sur toutes les images sont 250 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    A1 Cochlée + des cellules A2 Cochlée + des cellules B2 nég.
    Contrôle cochlée Labyrinthe osseux extérieur 3 758 549 0 Espaces extérieurs de cochlée d’OS 248 586 0 Au sein de la cochlée 518 701 0 Total de cellules 4 524 1 836 0 Section Volume (µL) 0.0077 0,0100 0,0147 Pour cent du Volume de la cochlée 0,46 % 0,59 % 0,87 % Estimation de densité des cellules dans la cochlée 113 759 118 732 0

    Tableau 1 : nombre de cellules. DAPI cochléaires coupes coloré ont été binariser et quantifiée à l’aide des outils de comptage automatique dans ImageJ dans 3 régions non-cumul d’intérêt (ne pas le labyrinthe osseux, OS temporal en dehors des espaces fluides cochléaires et au sein de la cochlée). Section transversale cochléaire a également mesuré ImageJ, et cette valeur est utilisée pour calculer le volume de la section en combinaison avec l’épaisseur de coupe (10 µm). En utilisant une estimation du volume total de cochléaire publié par Santi et al. 23, le volume cochléaire relatif d’une section donnée a été calculée. La densité des cellules de la cochlée entier a été estimée en utilisant le volume cochléaire relatif d’une section donnée en combinaison avec le nombre d’éléments appariés.

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    Discussion

    Nous avons démontré avec succès que des cellules cochléaires natifs peuvent être retirés de la cochlée via un processus DÉCELLULARISATION, qui permet l’utilisation de la cochlée comme un échafaudage de tissu complexe, en trois dimensions. Santi et al. 15 mis au point la méthode initiale pour decellularizing limaçon et ont réussi à estimer les volumes de nombreuses structures cochléaires grâce à l’aide d’une nappe de lumière microscopie23. Ce premiers travaux a servi une base solide pour l’ingénierie tissulaire et des techniques de culture cellulaire présentés ici. Cochlée DECELLULARISE peut être avec succès infusée avec des cellules et puis cultivés pendant une période prolongée de temps. Limaçon d’une vaste gamme d’animaux pourrait théoriquement être utilisés en combinaison avec une même gamme de types de cellules. Ces combinaisons permettent les techniques présentées ici pour être utilisé dans nombreuses conceptions expérimentales possibles, telles que les applications qui examinent l’épithélium sensoriel développement14, drug testing de nouveaux agents pharmaceutiques en génie tissulaire 24, et élaboration de réparation cochléaire modèles25. Cependant, malgré la large applicabilité de ces techniques ils ne sont pas sans limites.

    Une des limites de la technique actuelle est que la perfusion est variable et basé sur l’individu. Développer un titulaire, de la cochlée et à l’aide d’un pousse-seringue pour mener les perfusions peuvent augmenter la précision et la réussite du processus. En outre, le prouver définitivement DÉCELLULARISATION réussie pourrait potentiellement être accompli via plusieurs méthodes. Nous avons utilisé la coloration DAPI qui a été utilisé pour quantifier les noyaux des cellules restantes, et nous avons n’observé aucun post-DÉCELLULARISATION noyaux résiduels. En outre, des essais de quantification ADN standards utilisent le réactif, colorant vert, détecter des quantités picogramme de l’ADN, pour identifier les restes d’acide nucléique, qui est peut-être visuellement plus sensibles que le DAPI pour identifier la présence de petits fragments d’acides nucléiques acides dans les tissus DECELLULARISE26. Peu importe quelles techniques sont utilisées pour valider DÉCELLULARISATION réussie, ce n'est pas possible montrer DÉCELLULARISATION complète d’une cochlée individuelle avant d’utiliser comme un échafaudage. Néanmoins, nous avons trouvé le processus DÉCELLULARISATION soit efficace et robuste.

    Les deux étapes les plus critiques dans le protocole actuel sont l’isolement et le traitement du limaçon et la perfusion du limaçon. Grand soin doit être franchie avec la cochlée est initialement isolée, comme la cochlée est délicate et fragile. Si trop de force est appliquée lors de la manipulation de la cochlée avec une pince, la cochlée pourrait fragmenter. Ainsi, il est impératif de traiter chaque cochlée doucement avant DÉCELLULARISATION et décalcification. Le système vestibulaire, si laissé intact, sert de poignée grande pour attraper l’oreille interne complexe avec une pince et orienter la cochlée. De même, lorsque perfusant la cochlée avec des cellules, la pression derrière la perfusion ne doit pas être trop grande, sinon les cellules pourraient ne pas survivre à la perfusion. Comme indiqué dans le protocole actuel, raccorder le tube à la fin d’une seringue de 1 mL insuline permet une manipulation plus facile de la cochlée avec d’une part et une plus grande précision en perfusant les cellules dans la cochlée de l’autre main.

    L’étape suivante, il serait naturel pour évaluer les marqueurs du développement et fonctionnelles pour déterminer si l’ECM cochléaire est induisant la différenciation des cellules souches, et si oui, quels composants spécifiques d’ECM dans la cochlée sont induisant des changements dans les cellules. Perfusant les différents types de cellules (par exemple, les cellules souches, neuroprogenitors, fibroblastes, etc.) par le biais de la cochlée au moniteur la différenciation cellulaire et le comportement serait une autre enquête de suivi fascinante. En outre, les cellules qui ont été génétiquement modifiées ou sont exposés à un protocole de différenciation de facteur de croissance peuvent apporter un éclairage nouveau sur comment l’ECM cochléaire prend en charge le développement neurosensoriel et peut-être même fonction dans l’audience. Ainsi, le protocole actuel est une première étape importante dans l’utilisation de l’ECM cochléaire pour étudier le développement neurosensoriel oreille interne et la maintenance, qui pourrait un jour mener à l’élaboration de nouveaux traitements pour restaurer la perte de l’audition.

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    Disclosures

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Acknowledgments

    Le projet actuel a été financé par la preuve de l’Université du Kansas de fonds Concept. Nous tenons à remercier le personnel soignant à KUMC (Kansas City, KS) pour nous aider à obtenir des humains des cordons ombilicaux et David Jorgensen pour aider avec les cultures de limaçon.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

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    References

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    Tags

    Bio-ingénierie numéro 131, : Cochlée les cellules ciliées échafaudage decellularize les cellules de la gelée de Wharton génie tissulaire culture cellulaire
    Un protocole pour Decellularizing limaçon de souris pour l’ingénierie tissulaire oreille interne
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    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

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