Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En protokoll for Decellularizing musen Cochleae indre øret Tissue engineering

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

Målet med denne protokollen er å demonstrere en effektiv metode for å decellularize og avkalke mus cochleae for utnyttelse som stillaser for tissue engineering programmer.

Abstract

I pattedyr, mechanosensory hårcellene som letter høring manglende evne til å regenerere, som har begrenset behandlinger for hørselstap. Gjeldende regenerativ medisin strategier har fokusert på transplanting stamceller eller genetisk manipulering av omkringliggende støtte celler i det indre øret å oppmuntre utskifting av skadet stamceller rette hørselstap. Likevel, den ekstracellulære matrisen (EFM) kan spille en viktig rolle i inducing og vedlikeholde funksjon av hårcellene, og har ikke blitt godt undersøkt. Ved hjelp av cochlea kan ECM som en stillaset å vokse voksne stamceller tilby unik innsikt i hvordan sammensetning og arkitektur i miljøet som ekstracellulære hjelpemidler celler i opprettholde høring-funksjonen. Her presenterer vi en metode for å isolere og decellularizing cochleae fra mus til bruk som stillaser akseptere perfused voksne stamceller. I gjeldende protokollen er cochleae isolert fra euthanized mus, decellularized og decalcified. Etterpå var menneskelige Wharton gelé celler (hWJCs) som ble isolert fra navlestrengen nøye parfyme i hver sneglehuset. Cochleae ble brukt som bioreaktorer og celler ble kultivert for 30 dager før under behandling for analyse. Decellularized cochleae beholdt identifiserbar stamtre, men avsløre ikke tilstedeværelsen av celler eller merkbar fragmenter av DNA. Celler parfyme i sneglehuset invaderte de fleste interiør og eksteriør av sneglehuset og vokste uten hendelsen over en varighet på 30 dager. Dermed kan det aktuelle metoden brukes til å studere hvordan cochlear ECM påvirker celle utvikling og atferd.

Introduction

Sneglehuset er en intrikat spiral struktur funnet i temporal benet. Det består av en ytre benete labyrinten og konsentriske, indre membranous labyrint1. Membranous labyrinten består av tre flytende områder: Scala vestibuli, Scala media og Scala Pauker1. Scala media huser sensoriske epitel, som består av en rekke celletyper, men sensoriske hårcellene (HC), som transduce mekanisk energi i lydbølger til nerveimpulser2, er av spesiell interesse. Eksponering for akustisk traumer3,4,5, medisinering6, sykdom7,8og aldring9 kan alle føre svekket auditiv funksjon via HC død. Hair celle tap i pattedyr er permanent, i motsetning til avian HCs, noe som kan regenerere etter skade10.

En rekke moderne forskningsinnsats har søkt å gjenopprette tapt HCs, selv om de spesifikke eksperimentelle tilnærmingene variere. Manipulasjon av genuttrykk i Sensorisk epitel og implantering av stamceller differensiert utenfor kroppen er dominerende tilnærminger i feltet selv om induksjon metoder som søker å differensiere stamceller i cochlea organoids har vært forsøkt11,12,13. Hver av disse metodene er avhengig på stamceller, eller utviklingsmessige signaler brukes av stamceller; men andre delte, og potensielt avgjørende element er ECM av sneglehuset selv14,15.

ECM gir ikke bare fysisk støtte for celler og vev, som inkluderer en overflate for celle vedheft, spredning, overlevelse og migrasjon, men spiller også avgjørende roller i utviklingen av HCs og spiral ganglion15,16 ,17. Naturlig gir forekommende ECM induktiv signaler som kan veilede celle fenotypen besluttsomhet og/eller celle vedheft, spredning og overlevelse18. Derfor bruk av decellularized sneglehuset i kombinasjon med kulturperler hWJCs tilbyr en unik mulighet til å utforske rollen ECM og HC fornyelse. HWJCs er en lett tilgjengelig, ikke-kontroversielt celle type isolert fra menneskelige navle ledninger som oppfører seg som mesenchymal stamceller19. HWJCs har vist evnen til å skille ned neurosensory celle overleveringslinjer20,21. Dermed detaljer gjeldende protokollen isolasjon, decellularization, og perfusjon av cochleae fra C57BL musen skrotter med hWJCs indre øret tissue engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer, inkludert dyr dødshjelp, ble gjennomført i henhold til godkjente institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokollen (mitt vredes og min #2014-2234) ved University of Kansas Medical Center (KUMC).

Merk: HWJCs var isolert fra menneskelige navle ledninger som ble donert av pasienter som gitt samtykke og prøver ble brukt i henhold til protokoller godkjent ved University of Kansas menneskelig fag komiteen (KU-IRB #15402).

1. Temporal bein Harvest og sneglehuset isolasjon

  1. Halshugge en hensiktsmessig euthanized, 15-uke-gamle musen ved å kutte mellom skallen og første cervical vertebra med en skarp kirurgisk saks, så spray ned hodet med 70% etanol å desinfisere (figur 1A).
  2. Halvere skallen i en midt-sagittal fly ved hjelp av samme skarpe par kirurgisk saks (figur 1B-C, stiplede linjer).
  3. Fjern hjernevevet fra skallen med en tang (figur 1 d, pilspiss).
  4. Identifisere temporal benet gjennom tilstedeværelse av det auditive og vestibular nerve røttene (figur 1E-F, pilspisser) på innsiden av skallen og det øre kanalen fra utsiden (figur 1F, pil). Forsiktig skjære gjennom skallen isolere temporal bein fra resten av skallen (figur 1G).
    Merk: I noen tilfeller kan det være mulig å forsiktig lirke rundt beina i skallen fra temporal benet uten kutte.
  5. Sett inn fine tang i åpningen av ørekanalen ca 5 mm (figur 1 H), så tips ikke risikere punktering sneglehuset. Forsiktig bryter benet bulla (figur 1 H, topp røde skyggelagt) så det sprekker (figur 1I, røde prikket linje).
    Merk: Eventuelt disseksjon mikroskop kan hjelpe i denne prosessen å sikre nøyaktig plassering og manipulering av instrumenter.
  6. Bruke fine tang, lirke bort resten av bulla fra temporal bein, utsette det benete labyrinten av sneglehuset (figur 1J, røde parentes).
  7. Plasser en Petriskål stor nok til å holde temporal benet (f.eks, 30 mm eller større) under den dissekere omfang synsfelt og fylle den med nok fosfat bufret saltvann (PBS) til å dekke temporal benet (f.eks, 0,5 til 1 mL).
  8. Senk temporal bein med bulla fjernet i PBS med vinduene ovale og runde av sneglehuset grossist.
    Merk: Fjerning av vestibulærsystemet fra sneglehuset er ikke nødvendig, som vestibulærsystemet fungerer godt som et håndtak for manipulere og orientere funksjoner i cochlea (figur 1I og figur 2B).
  9. Bruker en ultra-fin par pinsett, fjerne arteria stapedial, som går gjennom stigbøylen.
  10. Sett en av ultra-fine pinsett gjennom buen av stigbøylen hvor arterien gikk gjennom, og delikat løft stigbøylen oppover. Disarticulated stigbøylen bør løfte av det ovale vinduet.
  11. Bruker et tips av ultra-fine pinsett, punktering ellipsen og rundt windows.
  12. Ved hjelp av en 1 x PBS fylt 28.5-gauge sprøyte med rør (indre diameter 0,28 mm ytre diameter 0,61 mm) knyttet, plasser slangen over det ovale vinduet (figur 2A -B).
    Merk: Åpningen av røret kan manipuleres med ultra-fine tang bidrar til å sikre nøyaktig plassering.
    1. Bruk en frisk sprøyten og rør for hver sneglehuset.
  13. Perfuse 2 mL 10% antibiotika-antimycotic (anti-anti) og 10% penicillin-streptomycin (penn-strep) i PBS gjennom sneglehuset over 5 min fjerne perilymph. Perfusing for fort med for mye press vil skade de fine strukturene i sneglehuset.
    Merk: Manuelt kjøre sprøyte for hånd til perfuse væske gjennom sneglehuset er effektive, selv om en perfusjonsmåling pumpe kan brukes som et alternativ.
    1. Hvis manuelt perfusing, kan du bruke et par fine, selvbildet lukking tang å stabilisere cochlea (figur 2A) under perfusjon ved å ta tak vestibulærsystemet delen av temporal benet.
      Merk: Selv om ikke nødvendig, dette går begge hendene fri til å håndtere instrumenter; ene kan kjøre sprøyten (figur 2A) mens andre kan plassere slangen riktig (figur 2B).
    2. Dette trinnet videresende, ta vare for å unngå å utsette sneglehuset unødvendig til luft. Innføre luftbobler i flytende områder vil blokkere væske sirkulasjon, og ytterligere uttørking vil skade de fine strukturene i sneglehuset.
  14. Fjerne og kast eventuelle gjenværende muskel vev og bein fragmenter med fine tang.
  15. Eventuelt lagre isolert cochleae på 4 ° C i 10% anti-anti og 10% penn-strep løsningen i PBS for opptil sju dager med vanlige endringer av antibiotika løsning alle 48 timer.

2. cochlea behandling

  1. Decellularization
    1. For hver cochlea, Fyll en 20-mL scintillation hetteglass med en 1% natrium dodecyl sulfate (SDS) løsning i de-ionisert (DI) vann, som brukes til å decellularize cochlea.
    2. Klippe tuppen av en plast 7-mL overføring pipette med et barberblad slik at åpningen er stor nok for en sneglehuset passerer.
    3. Bruker overføring pipette, forsiktig utarbeide sneglehuset i pipette så den rettferdig passerer cut-off kanten av noen millimeter.
    4. Utvise sneglehuset til 1% SDS løsning-fylt scintillation ampullen.
    5. Sirkulere 2 mL 1% SDS i de-ionisert (DI) vann gjennom sneglehuset i scintillation ampullen bruker en overføring pipette.
    6. Plasser scintillation ampullen i en rotator, og la scintillation ampullen rotere på 10 rpm 72 h ved romtemperatur.
      1. Endre 1% SDS løsning hver 24 h løpet 72 h. Vær forsiktig når du endrer SDS å aldri avsløre sneglehuset til luft.
    7. Vask sneglehuset tre ganger i 30 min hver med DI vann.
Utføre vasker i samme scintillation ampullen brukes for SDS kostnader; på dette stadiet, er sneglehuset decellularized.
  • Avkalking
    1. Fjern gjenværende DI vannet fra scintillation ampullen, forlater akkurat nok til å holde sneglehuset neddykket.
    2. For å begynne Avkalking, legge til 5 mL av 10% ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (0.02 M) i DI vann scintillation ampullen inneholder sneglehuset.
    3. Sirkulere 2 mL 10% EDTA i DI vann gjennom sneglehuset i scintillation ampullen bruker en overføring pipette.
    4. Plasser scintillation ampullen tilbake i omdreiende, og la scintillation ampullen rotere på 10 rpm 72 h ved romtemperatur. Endre 10% EDTA løsningen hver 24 h løpet 72 h. Vær forsiktig når du endrer løsninger slik at sneglehuset ikke er eksponert for luft.
    5. Skyll sneglehuset 3 ganger for 2 h hver med 1 x PBS; på dette stadiet, er sneglehuset decalcified.
  • Lagring
    1. Lagre cochleae for opptil 72 h i en 10% anti-anti, 10% penn-strep løsning i PBS på 4 ° C.
      Merk: Lengre lagring perioder kan være mulig med regelmessig endringer i antibiotika løsning; men har langvarig oppbevaring av behandlet cochleae ikke blitt validert i denne protokollen.

    • 3. innkjøp og utvidelse av hWJCs

    1. Isolere hWJCs ifølge publisert tidligere protokoller22. Kort, segmentet navle snorer i 3 cm seksjoner.
    2. Nøye gjør en grunne snitt med skalpell lengderetningen på hvert navlestreng segment rulle og avsløre det Wharton gele av navlestrengen. Bruke pinsett fjerne blodkar.
    3. Vask navlestreng segmenter to ganger med nok PBS (f.eks, 40 mL i en 60 mm Petriskål) for å senke vevet. Fint hakke vev segmenter med skalpell. Fordøye vev i en 100 mm Petriskål med 50 mL av fordøyelsen medium (0,2% type 2 collagenase, 1% penicillin-streptomycin, i lav-glukose Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM)).
    4. Plasser vev i fordøyer mediet på en orbital shaker på 50 rpm overnatter i en 5% CO2, 37 ° C inkubator. Dagen fortynne fordøyelsen medium i forholdet 1:16 i 2% antibiotika-antimycotic i PBS og pellets celler med sentrifugering 500 x g ved romtemperatur (~ 27 ° C) for 10 min. Forkast nedbryting.
    5. Resuspend pellets i Mesenchymal stamceller vekst Medium (MSCGM) og sette sammen celler. Plate cellene på en tetthet av 7 x 103 celler/cm2 i vev kultur behandlet T-75 flasker. Kultur HWJCs i MSCGM, og utvide til passering 5 for eksperimenter.
      Merk: HWJCs kan være sub kultivert i større T-flasker (f.eksT-150, T-300) når passaging for å øke avkastningen av hWJCs for eksperimenter.

    4. infusjon av hWJCs i Decellularized Cochleae

    1. Forberede decellularized cochleae
      1. Bruker steril teknikk, vaske lagret cochleae i 1 x PBS tre ganger i 30 minutter hver.
      2. Overføre cochleae til egen brønner av en 24-vel plate, og Legg til 1 mL av 37 ° C før varmet MSCGM.
      3. Inkuber cochleae i en 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator for minimum 1 time før infusjon av celler.
    2. Dissociate hWJCs og resuspend
      1. Vask hWJCs med 37 ° C varme pre 1 x PBS to ganger.
      2. Legg nok 37 ° C før varmet Trypsin med 0,5% EDTA å dekke fartøyet celleoverflaten.
      3. Inkuber hWJCs for opptil 5 minutter i en 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator.
        1. Kontroller at 90% av cellene har løsrevet fra kultur celleoverflaten ved å vise celler under en invertert mikroskop.
          Merk: Celler som flyttes når kultur fartøyet forsiktig tappes, har koblet fra. Celler som holdes, har ikke koblet fra.
        2. Forsiktig Tapp sidene av kolbe å lenger fjerne tilknyttede celler.
      4. Bruker steril teknikk, pleide overføre hWJCs fra kultur fartøyet til en 50-mL konisk rør som inneholder en tilsvarende mengde MSCGM volumet av Trypsin å distansere cellene.
      5. Pellets til hWJCs av sentrifugering på 500 x g ved romtemperatur (~ 27 ° C) i 5 min.
      6. Sug opp nedbryting, og resuspend hWJCs i MSCGM i en konsentrasjon av 500.000 celler/mL.
    3. Perfuse cochleae
      1. Overføre cochleae til en ny 24-vel plate med en overføring pipette.
      2. Legge til en dråpe MSCGM hver cochlea for å hindre eventuelle sneglehuset tørker.
      3. Delikat orientere sneglehuset med ultra-fine tang slik at vinduene ellipse og rundt vender.
        Merk: Ta forsiktig når du håndterer direkte hver sneglehuset sneglehuset er lett skadet.
      4. Bruker en steril 28.5-gauge insulinsprøyte med tilkoblede rør, trekke opp 0,2 mL resuspended hWJCs (100 000 celler).
      5. Bruke steriliserte fine tang, plasser rør over det ovale vinduet.
      6. Delikat og langsomt perfuse cochlea med 0,2 mL resuspended hWJCs bruker en 28.5-gauge insulinsprøyte koblet til polyetylen rør (ytre Diameter: 0,61 mm indre Diameter: 0,28 mm) over ca 5 min.
      7. Etter perfusjon, legger 0,8 mL 37 ° C før varmet MSCGM til den også inneholder cochlea for å bringe det totale volumet i brønnen til 1 mL.
      8. Gjenta trinn 4.3.3-4.3.7 for hver cochlea, bruker en fersk sprøyte og rør hver gang.
      9. Sted parfyme cochleae 5% CO2, 37 ° C celle kultur inkubator, og endre media tre ganger per uke.

    5. sneglehuset Harvest og bevaring

    Merk: Cochleae kan bli kultivert og høstet til enhver tid opptil 30 dager etter perfusjon.

    1. For å bevare cochleae, fikse på 4% paraformaldehyde i 1 x PBS overnatting på 4 ° C på en rocking plattform.
    2. Fiksering, vaskes cochleae med 1 x PBS tre ganger i 5 minutter hver.
    3. Gradvis tørke sneglehuset med etanol og fjern med en alifatisk hydrokarboner løsemiddel før innebygging i parafin.
    4. Delen prøver til en tykkelse på 10 µm ved hjelp av en mikrotom og montere på glass objektglass.
      Merk: Utvalg er nå klare for histologiske eller immunohistochemical behandling ved hjelp av standard protokoller.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved hjelp av metodene som presenteres her, vellykkede decellularization av cochleae ble vurdert ved å undersøke tilstedeværelse eller fravær av DNA gjennom 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) flekker. Cochleae ble ansett fullt decellularized hvis DNA ikke ble identifisert i decellularized cochlea. En innfødt sneglehuset fra en tidligere eksperiment som ikke gjennomførte decellularization eller avkalking ble brukt som en positiv for å illustrere strukturer og tradisjonelt cellene i en C57BL musen sneglehuset. Decellularized-decalcified cochlea, som ikke har noen hWJCs infunderes, ble brukt som en negativ kontroll. Ingen målbar DAPI farget celle kjerner ble observert i en region av delen vev (Figur 3). To cochleae var decellularized og decalcified, og deretter tilført hWJCs for det gjeldende prosjektet. De decellularized-decalcified cochleae som var parfyme med hWJCs ble observert å ha mange DAPI farget kjerner i cochlea og vokse på det benete skallet utenfor cochlea (tabell 1). Totalt beregnet celle tettheter for cellen infundert første sneglehuset var 113,759 celler/sneglehuset etter 30 dager av kultur (Figur 4 og figur 5) og andre sneglehuset var 118,732 celler/sneglehuset etter 30 dager av kultur (figur 6 og Figur 7). Estimatene celle tetthet inkluderer Scala Pauker, Scala media, og Scala vestibylen og mengder strukturer innen tre flytende mellomrom, men disse estimatene utelatt noen av det gjenværende benete labyrinten. I tillegg prøver fra hver sneglehuset var farget med Hematoxylin og Eosin (H & E) vise celler og anatomisk funksjoner innen hver sneglehuset (Figur 8). Grov anatomi av cochlea microstructures uforandret hovedsakelig gjennom alle farget seksjoner; men var ingen celler identifiserbar i delen decellularized-decalcified (figur 8B). Identifikasjon av cellen kjerner var dramatisk forskjellig innfødt cochlea (figur 8A) og decellularized-decalcified-cochleae fylt med celler (Figur 8 c-D).

    Figure 1
    Figur 1: mus temporal bein isolasjon. Når musen har blitt riktig euthanized, halshugge dyr ved å kutte mellom bunnen av skallen og første cervical vertebra og spray hodet med etanol å desinfisere (A). Halvere skallen i et sagittal fly avsnitt (B-C) med en skarp kirurgisk saks, gjennom både hjernevev og bein. Delt i to mus hodet (D, lavere mandible fjernet for urelaterte eksperimentelt arbeid) må deretter hjernevev fjernet for å avsløre temporal benet. De to foramina som auditiv og vestibular nerve pass (E, røde pilspisser) er nyttige stikkord for å kunne identifisere temporal benet. Fjern kjøttet fra skallen (F). Den ytre øregangen (F, pil, toppanelet) gir en nyttig eksterne stikkordet også. Nøye klippe bort overflødig bein, forlater bare isolert temporal benet (G). Bulla (H, toppanelet, røde uthevede området) må da delikat fjernes ved hjelp av fine pinsett (H, nedre panel). Bulla er tynne bein og kan lett chipped bort (jeg) til det benete labyrinten av sneglehuset er avslørt (J, røde parentes). Skala barer på alle bilder er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2: cochlea perfusjon. Når temporal benet er isolert og bulla er fjernet, kan sneglehuset deretter settes opp for steder et mikroskop. Perfusing bruker en manuelt drevet sprøyte med slange knyttet (A, prikket linje) kan det være nyttig å stabilisere sneglehuset med en selvlukkende tang. Forsiktig legge tang til vestibular del av temporal benet (B) og hvile tang mot av Petriskål (A). Dette går begge hendene fri til å manipulere instrumenter under perfusjon. En hånd kan du manipulere sprøyten, kontrollerer infusjonshastigheten væske, mens derimot kan plassere slangen over det ovale vinduet med et par pinsett (B). Skjæring gratis slutten av slangen skrått lar for enklere plassering, slik at slangen plasseres riktig uten sperring synsfelt. Skala bar er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3: vev delen av en decellularized musen sneglehuset. En oppreist epi-fluorescerende mikroskop ble brukt å image samples ved en forstørrelse av 200 X (10 X okularet og 20 X-målet). Bilder ble sydd sammen for å lage en 4 x 5 montasje. DAPI kjernefysiske flekker viser fraværet av celler vises i panelet A bruker et DAPI felles filteret sett (350 nm eksitasjon, 470 nm utslipp) og en overeksponert, gråtonebilde av autofluorescence bruke et vanlig filter for fluorescein-isothiocyanate (FITC) sett (490 nm eksitasjon, 525 nm utslipp), som gir anatomiske landemerker, vises i panelet B. Automatisert celletall ble utført i tre regioner av interesse, som er avgrenset på begge paneler A og B. Totalt celletall ble beregnet for delen hele vev (1, heldekkende hvit linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tallene ble brukt til å beregne antall celler i benete strukturer utenfor sneglehuset men innenfor eksteriør, bony kantene i delen vev (3, mellomrom mellom den prikkete linjen og stiplet linje). Skala barer på alle bilder er 500 µm.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4: en nær-modiolar del av decellularized musen sneglehuset 1 tilført hWJCs. DAPI kjernefysiske flekker vises i panelet A kledde på en overeksponert, gråtone autofluorescence fra den grønne kanalen, som gir anatomiske landemerker. Automatisert celle teller ble utført i tre regioner av interesse, som er avgrenset i A-panelet. Totalt celletall ble beregnet for delen hele vev (1, heldekkende hvit linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tallene ble brukt til å beregne antall celler i benete strukturer utenfor sneglehuset men innenfor eksteriør, bony kantene i delen vev (3, mellomrom mellom den prikkete linjen og stiplet linje). Isolerte DAPI flekker vises i panelet B, og terskelen til den DAPI flekker under automatiserte kvantifisering vises i panelet C. Skala barer på alle bilder er 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5: høy forstørrelse visningen av en nær-modiolar del av decellularized musen sneglehuset 1 tilført hWJCs. DAPI kjernefysiske flekker vises i panelet A kledde på en overeksponert, gråtonebilde av autofluorescence fra den grønne kanalen, som gir anatomiske landemerker. Isolerte DAPI flekker vises i panelet B, og terskelen bildet under automatiserte celle teller vises i panelet C. Den flytende mellomrom og finere microstructures i sneglehuset beholdes pent under decellularization og celle kultur faser av forsøket. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauker (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal kanalen (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Reissners membran er klart definert ikke i vev deler, og resultatet Scala Media er ikke klart definert. Skala barer på alle bilder er 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 6
    Figur 6: en nær-modiolar del av decellularized musen sneglehuset 2 som ble tilført hWJCs. DAPI kjernefysiske flekker vises i panelet A, kledde på gråtone autofluorescence fra den grønne kanalen, som gir anatomiske landemerker. Automatisert celle teller ble utført i tre regioner av interesse, som er avgrenset i A-panelet. Totalt celletall ble beregnet for delen hele vev (1, heldekkende hvit linje) og cochlea (2, stiplet linje). Disse to tallene ble brukt til å beregne antall celler i benete strukturer utenfor sneglehuset men innenfor eksteriør, bony kantene i delen vev (3, mellomrom mellom den prikkete linjen og stiplede linjer). Isolerte DAPI flekker vises i panelet B, og terskelen til den DAPI flekker under automatiserte kvantifisering vises i panelet C. Skala barer på alle bilder er 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 7
    Figur 7: høy forstørrelse visningen av en nær-modiolar del av decellularized musen sneglehuset 2 som ble tilført hWJCs. DAPI kjernefysiske flekker vises i panelet A, kledde på gråtone autofluorescence fra den grønne kanalen, som gir anatomiske landemerker. Isolerte DAPI flekker vises i panelet B, og terskelen bildet under automatiserte celle teller vises i panelet C. Flytende mellomrommene og finere microstructures i den cochlea beholdes i decellularization og celle kultur faser av forsøket. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauker (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal kanalen (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Reissners membran er klart definert ikke i vev deler, og resultatet Scala Media er ikke klart definert. Skala barer på alle bilder er 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 8
    Figur 8: Hematoxylin og Eosin flekker av kontroll og behandlet cochleae. Hematoxylin og Eosin farget deler viser en typisk sneglehuset med innfødt celler vises i panelet A. Panelet B inneholder samme strukturer som panel A, men fra en fullt decellularized cochlea, som etterlater den ekstracellulære matrisen. De to tidligere vist cochleae tilført hWJCs vises i paneler C og D. Brutto cochlea anatomien uforandret hovedsakelig gjennom decellularization og celle kultur prosesser, selv om de spesifikke celle populasjoner og plasseringene er dramatisk forandret. Scala Vestibuli (SV), Scala Pauker (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal kanalen (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) og Stria Vascularis (*). Skala barer på alle bilder er 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    A1 Sneglehuset + celler A2 Sneglehuset + celler B2 uaktso
    Kontroll sneglehuset Utenfor benete labyrinten 3758 549 0 Bein utenfor sneglehuset mellomrom 248 586 0 I sneglehuset 518 701 0 Totalt celler 4,524 1,836 0 Del volum (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Prosent av sneglehuset volum 0.46% 0,59% 0.87% Anslått celle tetthet i sneglehuset 113,759 118,732 0

    Tabell 1: celle teller. DAPI farget cochlea deler var thresholded og kvantifisert bruker automatisk telling verktøy i ImageJ i 3 ikke-overlappende områder av interesse (utenfor det benete labyrinten, temporal bein utenfor cochlea flytende områder, og i cochlea). Cochlea tverrsnitt ble også målt i ImageJ, og denne verdien ble brukt til å beregne delen volum i kombinasjon med snittykkelsen (10 µm). Bruke estimert cochlea totalvolum publisert av Santi et al. 23, relativ cochlea volumet av avdeling ble beregnet. Cellen tettheten av hele sneglehuset ble anslått relative cochlea volumet av avdeling i kombinasjon med de sammenkoblede celletall.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi har vist at innfødt cochlea celler kan fjernes fra sneglehuset via en decellularization prosess, som tillater bruk av sneglehuset som en intrikate, tredimensjonale vev stillaset. Santi et al. 15 utviklet den første metoden for decellularizing cochleae, og har nøyaktig anslått volum av mange cochlea strukturer gjennom ved hjelp av lys ark mikroskopi23. Slik tidlige arbeid var et sterkt grunnlag for tissue engineering og celle kultur teknikker som presenteres her. Decellularized sneglehuset kan er infused med celler, og så kultivert for en lengre periode. Cochleae fra en rekke dyr kunne teoretisk brukes i kombinasjon med en tilsvarende rekke typer celler. Disse kombinasjonene kan teknikker som presenteres her for å bli brukt i mange mulige eksperimentell design, som vev utvikling programmer som undersøke sensoriske epitel utvikling14, narkotika testing av nye farmasøytisk agenter 24, og utvikling av cochlea reparasjon modeller25. Men til tross for bred anvendelse av disse teknikkene er de ikke uten begrensninger.

    En av begrensningene for gjeldende teknikken er at perfusjonen er variabel basert på individuelle. Utvikle en holder, for sneglehuset, og bruker en Sprøytepumpe for å gjennomføre perfusions kan øke nøyaktigheten og suksess for prosessen. I tillegg kunne beviser definitivt vellykket decellularization potensielt gjøres gjennom flere metoder. Vi ansatt DAPI flekker som ble brukt om å kvantifisere gjenværende celle kjerner, og vi observerte ingen gjenværende kjerner innlegg-decellularization. I tillegg utnytte standard DNA kvantifisering analyser reagens, grønt fargebad oppdage hører mengder av DNA, å identifisere nukleinsyre rester, som kan visuelt mer følsom enn DAPI for å identifisere tilstedeværelsen av små fragmenter av nukleinsyre syrer i decellularized vev26. Uansett hvilke teknikker brukes til å validere vellykket decellularization, kan det ikke være mulig å vise fullstendig decellularization av en individuell sneglehuset før du bruker den som et stillas. Vi har imidlertid funnet decellularization prosessen å være vellykkede og robuste.

    De to viktigste trinnene i gjeldende protokollen er isolasjon og håndtering av cochleae og perfusjon av cochleae. Stor forsiktighet må tas når sneglehuset er opprinnelig isolert, som sneglehuset er delikat og skjør. Hvis for mye kraft ved håndtering sneglehuset med tang, kan sneglehuset fragmentere. Derfor er det viktig å håndtere hver sneglehuset forsiktig før decellularization og Avkalking. Vestibulærsystemet, fungerer hvis intakt, som en stor håndtere fanget det indre øret kompleks med tang og orientere sneglehuset. Tilsvarende når perfusing cochlea med celler, trykket bak perfusjonen må ikke være for stor, ellers celler kan ikke overleve perfusjonen. Som nevnt i gjeldende protokollen, gir legge rør til slutten av en 1-mL insulinsprøyte enklere håndtering av sneglehuset med én hånd og større nøyaktighet i perfusing cellene til sneglehuset med den andre hånden.

    Som et neste skritt, vil det være naturlig å vurdere utviklingsmessige og funksjonelle markører å avgjøre hvis cochlea ECM er inducing differensiering av stamceller, og hvis så, hvilke bestemte ECM komponenter i sneglehuset er inducing endringer i cellene. Perfusing ulike typer celler (f.eks, stilk celler, neuroprogenitors, fibroblaster, etc.) gjennom sneglehuset skjermen celledifferensiering og problemet ville være en annen fascinerende oppfølging undersøkelse. I tillegg kan celler som har blitt genmodifisert eller utsettes for en vekstfaktor differensiering protokoll gir ny innsikt i hvordan cochlear ECM støtter neurosensory utvikling, og muligens også funksjonen i høringen. Dermed er gjeldende protokollen et viktig første skritt i bruk av cochlea ECM indre øret neurosensory utvikling og vedlikehold, som kan en dag føre til utvikling av nye behandlingsformer å gjenopprette hørselstap.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Det gjeldende prosjektet ble finansiert ved University of Kansas bevis på konseptet fondet. Vi ønsker å takke pleiepersonalet KUMC (Kansas City, KS) for å hjelpe oss å skaffe menneskelige kontrollkabler og David Jørgensen bistå med cochleae kulturer.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Tags

    Bioteknologi problemet 131,: Cochlea hår cell stillas decellularize Whartons gelé celler vev engineering cellekultur
    En protokoll for Decellularizing musen Cochleae indre øret Tissue engineering
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter