O objetivo do presente protocolo é demonstrar um método eficaz para decellularize e descalcificar cochleae rato para utilização como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.
Nos mamíferos, mechanosensory células ciliadas que facilitam a falta de audiência a capacidade de regenerar, que limitou a tratamentos para perda auditiva. Estratégias atuais de medicina regenerativa concentraram-se no transplante de células-tronco ou manipulação genética de em torno de células de suporte na orelha interna para incentivar a substituição de células-tronco danificadas para corrigir a perda de audição. Ainda, a matriz extracelular (ECM) pode desempenhar um papel fundamental na indução e manutenção da função das células de cabelo e não tem sido suficientemente estudada. Usando o coclear ECM como um andaime para cultivar células-tronco adultas pode fornecer insights exclusivos sobre como a composição e arquitetura do ambiente extracelular aids células em sustentar a função auditiva. Aqui nós apresentamos um método para isolar e decellularizing cochleae de ratos para usar como andaimes aceitando perfundidas células-tronco adultas. O protocolo atual, cochleae são isolados da eutanásia de ratos, decellularized e descalcificadas. Depois, células de geleia humana da Wharton (hWJCs) que foram isoladas a partir do cordão umbilical foram cuidadosamente pintadas em cada cóclea. Os cochleae foram usados como biorreatores, e as células foram cultivadas por 30 dias antes de sofrer a transformação para análise. Decellularized cochleae mantidos identificáveis estruturas extracelulares, mas não revelou a presença de células ou fragmentos visíveis de DNA. Células perfundidas na cóclea invadiram a maior parte do interior e exterior da cóclea e cresceram sem incidentes em uma duração de 30 dias. Assim, o método atual pode ser usado para estudar como coclear ECM afeta células desenvolvimento e comportamento.
A cóclea é uma estrutura espiral intrincado encontrada no osso temporal. Ele é composto de um labirinto ósseo exterior e interior, concêntricos labirinto membranoso1. O labirinto membranoso é composto por três espaços fluidos: Scala vestibuli, Scala Scala tympani1e mídia. A mídia scala abriga o epitélio sensorial, que é composto de uma infinidade de tipos de células, mas as células sensoriais de cabelo (HC), que transduce energia mecânica em ondas sonoras para impulsos nervosos2, são de particular interesse. Exposição ao trauma acústico3,4,5, medicação6, doença7,8e envelhecimento9 tudo o que pode resultar em insuficiência auditiva através da morte HC. Perda de cabelo celular em mamíferos é permanente, ao contrário de HCs aviária, que podem se regenerar após lesão10.
Uma variedade de esforços de pesquisa contemporânea procuraram restaurar perdidos HCs, embora as abordagens experimentais específicas variam. Manipulação da expressão do gene no epitélio sensorial e implante de células-tronco diferenciadas fora do corpo são abordagens dominantes no campo, apesar de tem sido métodos de indução que buscam diferenciar as células-tronco em organoids coclear tentativa de11,12,13. Cada uma dessas abordagens é também dependente diretamente as células-tronco, ou as pistas do desenvolvimento, usadas por células-tronco; no entanto, um segundo compartilhados, e potencialmente crítico, o elemento é o ECM da cóclea em si14,15.
O ECM não só fornece suporte físico para as células e tecidos, que inclui uma superfície de adesão celular, sobrevivência, proliferação e migração, mas também tem um papel crítico no desenvolvimento de HCs e a espiral do gânglio15,16 ,17. Naturalmente ocorrendo ECM fornece sinais indutivos que podem orientar a determinação do fenótipo celular e/ou18, de adesão, proliferação e sobrevivência celular. Consequentemente, o uso da cóclea decellularized em combinação com hWJCs cultivadas oferecem uma oportunidade única de explorar o papel da regeneração ECM e HC. HWJCs são um tipo de célula prontamente disponível, sem controvérsias, isolado de humanos cordões umbilicais que se comportar como células-tronco mesenquimais19. HWJCs tem demonstrado a capacidade de diferenciar-se abaixo de20,de linhagens de célula marcante21. Assim, o atual protocolo detalha o isolamento, decellularization e perfusão de cochleae de carcaças de rato C57BL com hWJCs para engenharia de tecidos do ouvido interno.
Temos com sucesso demonstrado que células cocleares nativas podem ser removidas da cóclea através de um processo de decellularization, que permite a utilização da cóclea como um andaime de tecido tridimensional, intrincado. Santi et al. 15 desenvolveu o método inicial para decellularizing cochleae e estimaram com precisão os volumes de muitas estruturas cocleares através com o auxílio de microscopia de luz folha23. Tal trabalho inicial serviu como uma bas…
The authors have nothing to disclose.
O projeto atual foi financiado pela Universidade de Kansas prova de conceito de fundo. Gostaríamos de agradecer a equipe de enfermagem no KUMC (Kansas City, KS) para nos auxiliar na obtenção de humanos cordões umbilicais e David Jorgensen para ajudar com culturas cochleae.
Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |