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Bioengineering

भीतरी कान ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Decellularizing माउस Cochleae के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पाड़ के रूप में उपयोग के लिए decellularize और decalcify माउस cochleae के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदर्शित करने के लिए है ।

Abstract

स्तनधारियों में, mechanosensory बाल कोशिकाओं है कि सुनवाई कमी को पुनर्जीवित करने की क्षमता की सुविधा है, जो सुनवाई हानि के लिए उपचार सीमित है । वर्तमान अपक्षयी दवा रणनीतियों स्टेम सेल या भीतरी कान में आसपास के समर्थन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर प्रत्यारोपण पर ध्यान केंद्रित किया है क्षतिग्रस्त स्टेम कोशिकाओं के प्रतिस्थापन को सही करने के लिए सुनवाई नुकसान को प्रोत्साहित करने के लिए । फिर भी, extracellular मैट्रिक्स (ECM) उत्प्रेरण और बाल कोशिकाओं के समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, और अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है । एक पाड़ वयस्क स्टेम सेल के रूप में कॉकलियर ECM का प्रयोग कैसे संरचना और extracellular पर्यावरण एड्स कोशिकाओं की वास्तुकला सुनवाई समारोह बनाए रखने में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहाँ हम अलग और decellularizing cochleae चूहों से perfused वयस्क स्टेम कोशिकाओं को स्वीकार मचान के रूप में उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, cochleae euthanized चूहों, सेलुलर, और decalcified से अलग कर रहे हैं । इसके बाद, मानव व्हार्टन जेली कोशिकाओं (hWJCs) है कि गर्भनाल से अलग थे ध्यान से प्रत्येक कोक्लीअ में perfused थे । cochleae के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण के दौर से गुजर से पहले 30 दिनों के लिए संस्कृति थे । सेलुलर cochleae पहचाने extracellular संरचनाओं को बनाए रखा, लेकिन कोशिकाओं या डीएनए की नजर टुकड़े की उपस्थिति प्रकट नहीं किया । कोक्लीअ में perfused कोशिकाओं इंटीरियर और कोक्लीअ के बाहरी के सबसे पर आक्रमण किया और 30 दिनों की अवधि में घटना के बिना बढ़ी । इस प्रकार, वर्तमान पद्धति का अध्ययन कैसे कॉकलियर ECM कोशिका विकास और व्यवहार को प्रभावित करता है इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

कोक्लीअ एक जटिल सर्पिल संरचना लौकिक हड्डी में पाया जाता है । यह एक बाहरी बोनी भूलभुलैया और एक गाढ़ा, इनर झिल्लीदार भूलभुलैया1से बना है । झिल्लीदार भूलभुलैया तीन द्रव रिक्त स्थान होते हैं: Scala vestibuli, Scala मीडिया, और Scala tympani1। scala मीडिया संवेदी उपकला, जो कोशिका प्रकार के एक भीड़ से बना है घरों, लेकिन संवेदी बाल कोशिकाओं (एचसी), जो तंत्रिका आवेगों को ध्वनि तरंगों में यांत्रिक ऊर्जा transduce2, विशेष रुचि के हैं. ध्वनिक आघात करने के लिए जोखिम3,4,5, दवा6, रोग7,8, और उंर बढ़ने9 सब एचसी मौत के माध्यम से बिगड़ा श्रवण समारोह में परिणाम कर सकते हैं । स्तनधारियों में बाल कोशिका हानि, एवियन HCs, जो चोट के बाद पुनर्जीवित कर सकते है के विपरीत स्थाई है10।

समकालीन अनुसंधान के प्रयासों की एक किस्म के लिए खो HCs बहाल की मांग की है, हालांकि विशिष्ट प्रयोगात्मक दृष्टिकोण बदलती हैं । संवेदी उपकला में जीन अभिव्यक्ति की हेरफेर और शरीर के बाहर विभेदित स्टेम कोशिकाओं के आरोपण क्षेत्र में प्रमुख दृष्टिकोण हैं, हालांकि प्रेरण तरीकों कि कॉकलियर organoids में स्टेम कोशिकाओं अंतर करना चाहते हैं 11,12,13का प्रयास किया । इन तरीकों में से प्रत्येक या तो स्टेम सेल, या विकासात्मक cues स्टेम सेल द्वारा इस्तेमाल पर सीधे निर्भर है; हालांकि, एक दूसरे साझा, और संभावित महत्वपूर्ण, तत्व कोक्लीअ ही14,15के ECM है ।

ECM न केवल कोशिकाओं और ऊतक है, जो सेल आसंजन, प्रसार, अस्तित्व, और प्रवास के लिए एक सतह भी शामिल है के लिए शारीरिक सहायता प्रदान करता है, लेकिन HCs के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और सर्पिल नाड़ीग्रंथि15,16 ,17. स्वाभाविक रूप से होने वाली ECM आगमनात्मक संकेत है कि सेल phenotype निर्धारण और/या सेल आसंजन, प्रसार, और अस्तित्व18गाइड कर सकते है प्रदान करता है । नतीजतन, प्रसंस्कृत hWJCs के साथ संयोजन में कोक्लीअ के उपयोग के लिए एक अनूठा ECM और एचसी उत्थान की भूमिका का पता लगाने का अवसर प्रदान करते हैं । HWJCs एक आसानी से उपलब्ध हैं, गैर विवादास्पद कोशिका मानव गर्भनाल कि mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के19तरह व्यवहार से पृथक प्रकार । HWJCs को नीचे neurosensory कोशिका वंश20,21अंतर करने की क्षमता दिखाई है । इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव, decellularization विवरण, और भीतरी कान ऊतक इंजीनियरिंग के लिए hWJCs के साथ C57BL माउस लावे से cochleae के छिड़काव ।

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Protocol

कैनसस मेडिकल सेंटर (KUMC) के विश्वविद्यालय में अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) प्रोटोकॉल (ACUP #2014-२२३४) के अनुसार पशु इच्छामृत्यु सहित सभी प्रक्रियाओं का आयोजन किया गया ।

नोट: HWJCs मानव गर्भनाल कि रोगियों है कि प्रदान की सहमति और नमूनों द्वारा दान किया गया से अलग थे कैनसस मानव विषय समिति (केयू-आईआरबी #15402) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार उपयोग किए गए थे ।

1. लौकिक हड्डी फसल और कोक्लीअ अलगाव

  1. Decapitate एक उचित euthanized, 15 सप्ताह पुरानी शल्य कैंची की एक तेज जोड़ी के साथ खोपड़ी और पहले ग्रीवा ग्रीवा के बीच काटने के द्वारा माउस, तो ७०% इथेनॉल के साथ सिर को संक्रमित (चित्र 1a) नीचे स्प्रे ।
  2. सर्जिकल कैंची (चित्रा 1b-सी, डैश्ड लाइनों) के समान तेज जोड़ी का उपयोग कर एक मध्य sagittal विमान में खोपड़ी Bisect ।
  3. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग खोपड़ी से मस्तिष्क ऊतक निकालें (चित्रा 1 डी, ऐरोहेड).
  4. श्रवण और vestibular तंत्रिका जड़ों की उपस्थिति के माध्यम से लौकिक हड्डी की पहचान (चित्रा 1E-F, खोपड़ी और बाहरी (चित्रा 1F, तीर) से कान नहर के इंटीरियर पर ऐरोहेड) । ध्यान से खोपड़ी के शेष से लौकिक हड्डी को अलग करने के लिए खोपड़ी के माध्यम से कटौती (चित्रा 1G) ।
    नोट: कुछ उदाहरणों में, यह नाजुक काटने की आवश्यकता के बिना अस्थाई हड्डी से दूर खोपड़ी के आसपास की हड्डियों को खोदकर संभव हो सकता है ।
  5. कान नहर के उद्घाटन में ठीक संदंश डालें लगभग 5 मिमी (चित्रा1), तो सुझाव कोक्लीअ puncturing जोखिम नहीं है. धीरे bulla की हड्डी को तोड़ने (चित्राa, शीर्ष लाल छायांकित क्षेत्र) तो यह भंग (चित्रा 1I, लाल बिंदीदार रेखा) ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप इस प्रक्रिया में सहायता के लिए सटीक स्थान और उपकरणों के हेरफेर सुनिश्चित कर सकते हैं ।
  6. ठीक संदंश का प्रयोग, दूर लौकिक हड्डी से bulla के शेष खोदकर, कोक्लीअ की बोनी भूलभुलैया (चित्रा 1J, लाल कोष्ठक) को उजागर ।
  7. एक पेट्री डिश काफी बड़े के लिए अस्थाई हड्डी पकड़ (जैसे, 30 मिमी या अधिक) देखने के विदारक गुंजाइश क्षेत्र के नीचे और पर्याप्त फॉस्फेट के साथ भरने के लिए पर्याप्त फास्फेट (पंजाब) के लिए लौकिक हड्डी को कवर (जैसे, ०.५ 1 मिलीलीटर) ।
  8. कोक्लीअ का सामना करना पड़ रहा ओवल और गोल खिड़कियों के साथ पंजाब में हटाया bulla के साथ अस्थाई हड्डी जलमग्न ।
    नोट: कोक्लीअ से vestibular प्रणाली को हटाने आवश्यक नहीं है, के रूप में vestibular प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से जोड़ तोड़ और कोक्लीअ (चित्रा 1I और चित्रा बी) की सुविधाओं को ओरिएंट के लिए संभाल के रूप में कार्य करता है ।
  9. संदंश के एक अल्ट्रा ठीक जोड़ी का उपयोग करना, stapedial धमनी को दूर, जो stapes के माध्यम से गुजरता है ।
  10. stapes के आर्क के माध्यम से अल्ट्रा ठीक संदंश के एक टिप डालें जहां धमनी के माध्यम से पारित कर दिया, और नाजुक stapes ऊपर की ओर उठा । विस्पष्ट stapes को अंडाकार खिड़की से हटा देना चाहिए ।
  11. अल्ट्रा ठीक संदंश के एक टिप का उपयोग कर, अंडाकार और दौर खिड़कियों पंचर ।
  12. एक 1x २८.५ भरे पंजाबियों का उपयोग-टयूबिंग के साथ सिरिंज गेज (इनर व्यास ०.२८ mm, बाहरी व्यास ०.६१ मिमी) संलग्न, ओवल विंडो पर ट्यूबिंग स्थिति (चित्रा 2a -बी).
    नोट: ट्यूब के उद्घाटन अल्ट्रा ठीक संदंश सटीक स्थान सुनिश्चित करने के लिए मदद का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है ।
    1. एक ताजा सिरिंज और प्रत्येक कोक्लीअ के लिए टयूबिंग का प्रयोग करें ।
  13. कोक्लीअ को दूर करने के लिए 5 मिनट से अधिक perilymph के माध्यम से पंजाब में 10% एंटीबायोटिक-antimycotic (एंटी-एंटी) और 10% पेनिसिलिन-streptomycin (पेन-strep) की Perfuse 2 मिलीलीटर । बहुत अधिक दबाव के साथ भी तेजी से Perfusing कोक्लीअ के भीतर ठीक संरचनाओं को नुकसान होगा ।
    नोट: मैन्युअल रूप से हाथ से सिरिंज ड्राइविंग कोक्लीअ के माध्यम से द्रव perfuse करने के लिए प्रभावी है, हालांकि एक छिड़काव पंप एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. यदि मैन्युअल perfusing, ठीक है, आत्म समापन संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कोक्लीअ (चित्रा 2a) छिड़काव दौरान लौकिक हड्डी के vestibular भाग लोभी द्वारा स्थिर करने के लिए ।
      नोट: आवश्यक नहीं है, हालांकि, यह दोनों हाथों उपकरणों को संभालने के लिए स्वतंत्र छोड़ देता है; एक हाथ सिरिंज (चित्रा 2a) ड्राइव कर सकते हैं, जबकि अन्य टयूबिंग उचित स्थिति (चित्रा बी) कर सकते हैं.
    2. इस कदम से आगे, कोक्लीअ को अनावश्यक रूप से हवा को उजागर करने से बचने के लिए ध्यान रखना । तरल पदार्थ रिक्त स्थान में हवा के बुलबुले का परिचय, और आगे बाहर सुखाने कोक्लीअ के भीतर ठीक संरचनाओं को नुकसान होगा ।
  14. निकालें और किसी भी शेष मांसपेशी ऊतक और हड्डी के टुकड़े ठीक संदंश का उपयोग कर त्यागें ।
  15. यदि आवश्यक हो, तो अलग cochleae में 4 ° c में 10% विरोधी और 10% कलम-strep समाधान में सात दिनों तक एंटीबायोटिक सॉल्यूशन के नियमित परिवर्तन के साथ हर ४८ ज.

2. कॉकलियर प्रोसेसिंग

  1. Decellularization
    1. प्रत्येक कोक्लीअ के लिए, एक 20 मिलीलीटर ग्लास जुटान शीशी एक 1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान के साथ de-में भरें (DI) पानी, जो कोक्लीअ decellularize करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    2. एक प्लास्टिक 7 मिलीलीटर स्थानांतरण पिपेट एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर इतना है कि खोलने के लिए एक कोक्लीअ के माध्यम से पारित करने के लिए काफी बड़ा है बंद टिप काट ।
    3. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करना, धीरे पिपेट में कोक्लीअ ऊपर आकर्षित तो यह सिर्फ कुछ मिलीमीटर से कट-ऑफ एज गुजरता है ।
    4. कोक्लीअ को 1% एसडीएस समाधान-भरे हुए की शीशी में निष्कासित कर दीजिये ।
    5. 4 डी में 1% एसडीएस के 2 मिलीलीटर परिचालित (DI) कोक्लीअ के माध्यम से जुटान शीशी में एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर पानी ।
    6. एक रोटेटर में जुटान शीशी रखें, और सी सी शीशी को 10 rpm को कमरे के तापमान पर ७२ घंटे के लिए घुमाने की अनुमति दें ।
      1. परिवर्तित करें 1% एसडीएस समाधान प्रत्येक 24 h पर ७२ h अवधि । ध्यान रखना जब एसडीएस बदलने के लिए कोक्लीअ हवा को बेनकाब कभी नहीं ।
    7. कोक्लीअ तीन बार DI पानी के साथ 30 मिनट प्रत्येक के लिए धो लें ।
एसडीएस प्रभार के लिए इस्तेमाल एक ही जुटान शीशी में बहाकर प्रदर्शन; इस स्तर पर, कोक्लीअ है ।
  • Decalcification
    1. कोक्लीअ की शीशी से बचे हुए DI पानी को निकालकर, बस को रखने के लिए पर्याप्त छोड़ कर जलमग्न हो गया.
    2. decalcification शुरू करने के लिए, DI पानी में 10% ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (०.०२ मीटर) के 5 मिलीलीटर जोड़ने के कोक्लीअ युक्त शीशी ।
    3. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर कोक्लीअ में EDTA के माध्यम से DI पानी में 10% की 2 मिलीलीटर परिचालित ।
    4. सी. सी. शीशी को रोटेटर में वापस रखें, और सी सी शीशी को कमरे के तापमान पर ७२ h के लिए 10 rpm पर घुमाने की अनुमति दें । 10% EDTA समाधान प्रत्येक 24 h ७२ h अवधि पर परिवर्तित करें । समाधान बदलते समय सावधानी बरतें ताकि कोक्लीअ को हवा न पड़नी पड़े ।
    5. 1x पंजाबियों के साथ 2 एच प्रत्येक के लिए कोक्लीअ 3 बार कुल्ला; इस अवस्था में कोक्लीअ decalcified है ।
  • भंडारण
    1. 4 ° c में पंजाब में 10% एंटी-एंटी, 10% पेन-strep समाधान में ७२ h तक के लिए cochleae को संग्रहित करें ।
      नोट: एंटीबायोटिक समाधान के नियमित परिवर्तन के साथ अब भंडारण अवधि संभव हो सकती है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल में संसाधित cochleae का विस्तारित संग्रह मांय नहीं किया गया है ।

    • 3. hWJCs का प्रापण और विस्तार

    1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार hWJCs को अलग करें22। संक्षेप में, 3 सेमी वर्गों में गर्भनाल कॉर्ड ।
    2. ध्यान से एक नाल कॉर्ड खंड पर एक स्केलपेल लंबाई के साथ एक उथले चीरा बनाने के लिए unरॉल और गर्भनाल के व्हार्टन जेली बेनकाब । रक्त वाहिकाओं को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें ।
    3. एक ६० mm पेट्री डिश में ४० मिलीलीटर (उदाहरणके लिए पर्याप्त पंजाबियों के साथ दो बार नाल गर्भनाल खंडों धो) ऊतक जलमग्न करने के लिए । स्केलपेल के साथ टिशू सेगमेंट को बारीकी से कीमा करें । पाचन मध्यम के ५० मिलीलीटर (०.२% प्रकार 2 collagenase, 1% पेनिसिलिन-streptomycin, कम ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM)) में एक १०० mm पेट्री डिश में ऊतक डाइजेस्ट ।
    4. ५० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर मध्यम पचाने में एक 5% CO2, ३७ ° c मशीन में रातोंरात ऊतक रखें । अगले दिन, 2% एंटीबायोटिक में 1:16 के अनुपात में पाचन माध्यम पतला-पंजाब में antimycotic, और गोली कोशिकाओं के केंद्रापसारक द्वारा ५०० x जी में कमरे के तापमान पर (~ 27 ° c) 10 मिनट के लिए supernatant त्यागें ।
    5. Mesenchymal स्टेम सेल विकास मध्यम (MSCGM) में छर्रों reसस्पेंड और कोशिकाओं reसंयोजित । 7 x 103 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट कोशिकाओं/ऊतक संस्कृति इलाज टी-७५ कुप्पी में सेमी2 । संस्कृति MSCGM में HWJCs, और प्रयोगों के लिए 5 बीतने के लिए विस्तार ।
      नोट: HWJCs उप-बड़ा टी-कुप्पी (जैसे, टी-१५०, टी-३००) जब passaging प्रयोगों के लिए HWJCs की उपज को बढ़ाने के लिए में संस्कृति हो सकता है ।

    4. hWJCs की अर्की Cochleae में

    1. तैयार cochleae
      1. रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग, धो 30 मिनट के लिए प्रत्येक तीन बार 1x पंजाब में cochleae संग्रहीत ।
      2. एक 24-खैर प्लेट के अलग कुओं में cochleae हस्तांतरण, और ३७ डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म MSCGM के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. एक 5% CO2, ३७ ° c सेल की एक ंयूनतम के लिए 1 h के अर्क से पहले में मशीन cochleae ।
    2. अलग hWJCs और रिसस्पेंड
      1. धो hWJCs ३७ ° c पूर्व गर्म 1x पंजाबियों के साथ दो बार ।
      2. सेल पोत सतह को कवर करने के लिए ०.५% EDTA के साथ पर्याप्त ३७ डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म Trypsin जोड़ें ।
      3. एक 5% CO2, ३७ ° c सेल संस्कृति मशीन में 5 मिनट तक के लिए मशीन hWJCs ।
        1. सत्यापित करें कि कक्षों का ९०% कक्ष संस्कृति सतह से एक औंधा माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कक्षों को देखने के द्वारा अलग है ।
          नोट: जब संस्कृति पोत धीरे दोहन किया है कि चाल कोशिकाओं, अलग है । स्थिर रहने वाले कक्ष अलग नहीं किए गए हैं ।
        2. धीरे आगे संलग्न कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए कुप्पी के पक्षों का दोहन ।
      4. रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग, hWJCs संस्कृति पोत से एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब कोशिकाओं अलग करने के लिए इस्तेमाल किया Trypsin की मात्रा के लिए MSCGM के एक समकक्ष मात्रा युक्त करने के लिए स्थानांतरण ।
      5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (~ 27 डिग्री सेल्सियस) पर ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा hWJCs गोली ।
      6. महाप्राण supernatant, और hWJCs MSCGM में ५००,००० कोशिकाओं की एकाग्रता पर reसस्पेंड/
    3. Perfuse cochleae
      1. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर एक नया 24-well प्लेट में cochleae हस्तांतरण ।
      2. किसी भी कोक्लीअ को बाहर सुखाने से रोकने के लिए प्रत्येक कोक्लीअ में MSCGM की एक बूंद डालें ।
      3. नाजुक कोक्लीअ अल्ट्रा ठीक संदंश का उपयोग कर इतना है कि अंडाकार और दौर खिड़कियों का सामना कर रहे है ओरिएंट ।
        नोट: जब सीधे प्रत्येक कोक्लीअ हैंडलिंग के रूप में कोक्लीअ आसानी से क्षतिग्रस्त है चरम देखभाल ले लो ।
      4. जुड़े टयूबिंग के साथ एक बाँझ २८.५ गेज इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना, ०.२ मिलीलीटर reसस्पैंड hWJCs (१००,००० कोशिकाओं) को आकर्षित.
      5. का उपयोग कर निष्फल ठीक संदंश, अंडाकार खिड़की पर स्थिति टयूबिंग ।
      6. नाजुक और धीरे perfuse ०.२ मिलीलीटर reसस्पैंड hWJCs के साथ कोक्लीअ एक २८.५ गेज इंसुलिन पॉलीथीन टयूबिंग से जुड़े सिरिंज (बाहरी व्यास: ०.६१ मिमी, भीतरी व्यास: ०.२८ मिमी) लगभग 5 मिनट से अधिक का उपयोग कर ।
      7. छिड़काव के बाद, ३७ डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म MSCGM के ०.८ मिलीलीटर जोड़ने के लिए अच्छी तरह से युक्त कोक्लीअ के लिए 1 मिलीलीटर में कुल मात्रा लाने के लिए ।
      8. दोहराएं प्रत्येक कोक्लीअ के लिए कदम 4.3.3-4.3.7, एक ताजा सिरिंज और टयूबिंग हर बार का उपयोग कर ।
      9. प्लेस perfused cochleae में एक 5% CO2, ३७ ° c सेल कल्चर मशीन, और परिवर्तन मीडिया प्रति सप्ताह तीन बार ।

    5. कोक्लीअ फसल और संरक्षण

    नोट: Cochleae और संस्कृति हो सकता है किसी भी समय 30 दिनों के बाद छिड़काव को बिंदु पर काटा ।

    1. cochleae को संरक्षित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल के मंच पर एक रात में 1x पंजाबियों में ४% paraformaldehyde में फिक्स ।
    2. निर्धारण के बाद, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पंजाबियों के साथ तीन बार cochleae धो लें ।
    3. धीरे से इथेनॉल के साथ कोक्लीअ निर्जलीकरण और तेल में embedding से पहले एक aliphatic हाइड्रोकार्बन विलायक के साथ स्पष्ट है ।
    4. एक microtome का उपयोग कर 10 µm की मोटाई और कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करने के लिए अनुभाग नमूने ।
      नोट: नमूने अब मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर ऊतकीय या immunohistochemical संसाधन के लिए तैयार हैं ।

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    Representative Results

    यहाँ प्रस्तुत विधियों का उपयोग करते हुए, cochleae के सफल decellularization 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला के माध्यम से उपस्थिति या डीएनए की अनुपस्थिति का परीक्षण करके मूल्यांकन किया गया था । Cochleae पूरी तरह से विचार किया गया अगर डीएनए की पहचान नहीं की गई थी भीतर कोक्लीअ । decellularization या decalcification से गुजरना नहीं था कि पिछले प्रयोग से एक मूल कोक्लीअ संरचनाओं और पारंपरिक रूप से एक C57BL माउस कोक्लीअ में पाया कोशिकाओं को समझाने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । decalcified कोक्लीअ, जो किसी भी hWJCs संचार नहीं किया गया था, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । ऊतक खंड (चित्रा 3) के किसी भी क्षेत्र में कोई quantifiable DAPI सना हुआ सेल नाभिक मनाया गया । दो cochleae और decalcified, और फिर वर्तमान परियोजना के लिए hWJCs के साथ संचार किया गया । decalcified cochleae कि hWJCs के साथ perfused थे DAPI के भीतर कई नाभिक सना हुआ कोक्लीअ है और बोनी के बाहर कोक्लीअ खोल पर बढ़ रही है (तालिका 1) मनाया गया । सेल के लिए कुल अनुमानित सेल घनत्व पहले कोक्लीअ थे ११३,७५९ कक्ष/कोक्लीअ संस्कृति के 30 दिनों के बाद (चित्रा 4 और चित्रा 5) और दूसरी कोक्लीअ के लिए थे ११८,७३२ कोशिकाओं/कोक्लीअ संस्कृति के 30 दिनों के बाद (चित्रा 6 और चित्र 7) । इन सेल घनत्व का अनुमान Scala tympani, Scala मीडिया, और Scala बरोठा, और तीन द्रव रिक्त स्थान के भीतर पाया संरचनाओं के संस्करणों में शामिल हैं, लेकिन इन अनुमानों शेष बोनी भूलभुलैया के किसी भी बाहर रखा । इसके अलावा, प्रत्येक कोक्लीअ से नमूने Hematoxylin और Eosin (एच & #38; ई) के साथ प्रत्येक कोक्लीअ (चित्र 8) के भीतर कोशिकाओं और संरचनात्मक सुविधाओं की उपस्थिति दिखाने के लिए दाग थे. कॉकलियर microstructures की सकल एनाटॉमी सभी दाग वर्गों में मुख्य रूप से अपरिवर्तित बनी रही; हालांकि, कोई भी कक्ष विरूपण-decalcified अनुभाग (चित्र 8B) में पहचाने जाने योग्य नहीं थे । सेल नाभिक की पहचान नाटकीय रूप से देशी कोक्लीअ (चित्रा ८अ) और सेलुलर-decalcified cochleae कोशिकाओं (चित्रा 8C-डी) के साथ संचार के बीच अलग था ।

    Figure 1
    चित्रा 1: माउस अस्थाई हड्डी अलगाव । एक बार माउस को उचित रूप से euthanized गया है, खोपड़ी और पहले ग्रीवा ग्रीवा के आधार के बीच काटने से पशु decapitate, और (A) को संक्रमित करने के लिए इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे । शल्य कैंची की एक तेज जोड़ी का उपयोग करते हुए खंड (बी-सी) के एक sagittal विमान में खोपड़ी Bisect, दोनों मस्तिष्क ऊतक और हड्डी के माध्यम से काटने. bisected माउस सिर (डी, लोअर mandible असंबंधित प्रयोगात्मक कार्य के लिए हटा दिया) तो मस्तिष्क ऊतक लौकिक हड्डी प्रकट हटा दिया है चाहिए । दो foramina के माध्यम से जो श्रवण और vestibular नसों पास (E, red ऐरोहेड) सफलतापूर्वक लौकिक हड्डी की पहचान के लिए उपयोगी cues हैं । खोपड़ी से मांस निकालें (च) । बाहरी कान नहर (च, तीर, शीर्ष पैनल) के रूप में अच्छी तरह से एक उपयोगी बाहरी क्यू प्रदान करता है । ध्यान से दूर अतिरिक्त हड्डी ट्रिम कर दीजिए, सिर्फ अलग लौकिक हड्डी (G) छोड़कर । bulla (एच, शीर्ष पैनल, लाल हाइलाइटेड क्षेत्र) फिर नाजुक ठीक संदंश (एच, लोअर पैनल) का उपयोग कर हटा दिया जाना चाहिए । bulla पतली हड्डी है और आसानी से दूर छिल जा सकता है (मैं) कोक्लीअ के बोनी भूलभुलैया (जंमू, लाल कोष्ठक) से पता चला है जब तक । सभी छवियों पर स्केल सलाखों के 1 मिमी हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 2
    चित्र 2: कॉकलियर छिड़काव. एक बार लौकिक हड्डी अलग किया गया है और bulla हटा दिया गया है, कोक्लीअ तो छिड़काव के लिए एक खुर्दबीन पर स्थापित किया जा सकता है । जब perfusing (एक, बिंदीदार रेखा) संलग्न टयूबिंग के साथ एक मैंयुअल रूप से प्रेरित सिरिंज का उपयोग कर यह स्वयं की एक जोड़ी-बंद संदंश का उपयोग कर कोक्लीअ को स्थिर करने के लिए सहायक हो सकता है । धीरे लौकिक हड्डी (ख) के vestibular भाग के लिए संदंश संलग्न और पेट्री पकवान (ए) के होंठ के खिलाफ संदंश आराम करो । यह दोनों हाथों छिड़काव के दौरान उपकरणों में हेरफेर करने के लिए स्वतंत्र छोड़ देता है । एक हाथ तो सिरिंज हेरफेर कर सकते हैं, तरल पदार्थ की प्रवाह दर को नियंत्रित करने, जबकि दूसरे हाथ संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग कर ओवल विंडो पर ट्यूबिंग की स्थिति कर सकते हैं (ख). एक कोण पर ट्यूबिंग के मुक्त अंत काटना आसान स्थिति के लिए अनुमति देता है, टयूबिंग को देखने के क्षेत्र को अवरुद्ध बिना सही ढंग से रखा जा करने के लिए इजाजत दी । स्केल बार 1 मिमी है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 3
    चित्रा 3: एक सेलुलर माउस कोक्लीअ के ऊतक अनुभाग. एक ईमानदार महामारी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप 200X का इज़ाफ़ा (10x ऐपिस और 20X उद्देश्य) पर छवि नमूनों के लिए इस्तेमाल किया गया था । छवियों को एक साथ सिले थे लगभग एक 4 x 5 असेंबल बनाने के लिए । DAPI परमाणु धुंधला दिखाने कोशिकाओं के अभाव पैनल में दिखाया गया है एक का उपयोग कर एक DAPI आम फिल्टर सेट (३५० एनएम उत्तेजना, ४७० एनएम उत्सर्जन), और एक उजागर, autofluorescence के ग्रेस्केल छवि एक fluorescein isothiocyanate (FITC) आम फिल्टर का उपयोग सेट (४९० एनएम उत्तेजना, ५२५ एनएम उत्सर्जन), जो संरचनात्मक स्थलों प्रदान करता है, पैनल Bमें दिखाया गया है । स्वचालित सेल गणना ब्याज के तीन क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया, जो दोनों पैनलों ए और बीपर delineated हैं । पूरे टिशू सेक्शन (1, सॉलिड व्हाइट लाइन) और कोक्लीअ (2, डैश्ड लाइन) के लिए कुल सेल काउंट्स की गणना की गई । ये दो नंबर कोक्लीअ के बाहर बोनी संरचनाओं में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन बाहरी के भीतर, ऊतक खंड के बोनी किनारों (3, डॉटेड रेखा और डैश्ड रेखा के बीच रिक्ति) । सभी छवियों पर स्केल सलाखों ५०० µm हैं ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 4
    चित्रा 4: एक के पास-modiolar खंड के एक सेलुलर माउस कोक्लीअ 1 hWJCs के साथ संचार किया । DAPI परमाणु धुंधला पैनल में दिखाया गया है एक उजागर पर मढ़ा एक , ग्रेस्केल ग्रीन चैनल से autofluorescence, जो संरचनात्मक स्थलों प्रदान करता है । स्वचालित सेल गिनती ब्याज के तीन क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया, जो पैनल Aमें delineated हैं । पूरे टिशू सेक्शन (1, सॉलिड व्हाइट लाइन) और कोक्लीअ (2, डैश्ड लाइन) के लिए कुल सेल काउंट्स की गणना की गई । ये दो नंबर कोक्लीअ के बाहर बोनी संरचनाओं में कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन बाहरी के भीतर, ऊतक खंड के बोनी किनारों (3, डॉटेड रेखा और डैश्ड रेखा के बीच रिक्ति) । पृथक DAPI धुंधला पैनल Bमें दिखाया गया है, और स्वचालित ठहराव के दौरान उपयोग किए जाने वाले DAPI के थ्रेशोल्ड को पेनल Cमें दिखाया गया है । सभी छवियों पर स्केल सलाखों ५०० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 5
    चित्रा 5: एक के पास modiolar खंड के उच्च आवर्धन देखने के लिए सेलुलर माउस कोक्लीअ 1 hWJCs के साथ संचार । DAPI परमाणु धुंधला पैनल में दिखाया गया है, जो संरचनात्मक स्थलों प्रदान करता है जो ग्रीन चैनल से autofluorescence के एक उजागर, स्केल छवि पर मढ़ा एक । पृथक DAPI धुंधला पैनल Bमें दिखाया गया है, और स्वचालित कक्ष की गणना के दौरान उपयोग की गई थ्रेशोल्ड छवि को पेनल Cमें दिखाया गया है । द्रव रिक्त स्थान और महीन कोक्लीअ के भीतर स्थित microstructures अच्छी तरह से प्रयोग के decellularization और कोशिका संस्कृति चरणों के दौरान संरक्षित कर रहे हैं । Scala Vestibuli (एसवी), Scala Tympani (एसएम), Basilar झिल्ली (बीएम), Tectorial झिल्ली (TM), सर्पिल Limbus (एल), Rosenthal के नहर (आर सी), Modiolus (एम), सर्पिल बंधन (SL), और Stria Vascularis (*) । Reissner की झिल्ली स्पष्ट रूप से ऊतक वर्गों में परिभाषित नहीं था, और एक परिणाम के रूप में Scala मीडिया स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं किया गया था । सभी छवियों पर स्केल सलाखों २५० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 6
    चित्रा 6: एक के पास modiolarी माउस कोक्लीअ 2 की धारा है कि hWJCs के साथ संचार किया गया था । DAPI परमाणु धुंधला पैनल Aमें दिखाया गया है, जो संरचनात्मक स्थलों प्रदान करता है ग्रीन चैनल से ग्रेस्केल autofluorescence पर मढ़ा । स्वचालित सेल गिनती ब्याज के तीन क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया, जो पैनल Aमें delineated हैं । पूरे टिशू सेक्शन (1, सॉलिड व्हाइट लाइन) और कोक्लीअ (2, डैश्ड लाइन) के लिए कुल सेल काउंट्स की गणना की गई । इन दो संख्याओं का उपयोग कोक्लीअ के बाहर बोनी संरचनाओं में कक्षों की संख्या की गणना करने के लिए किया गया था लेकिन बाहरी, बोनी किनारों के ऊतक खंड (3, डॉटेड रेखा और डैश्ड रेखाओं के बीच रिक्ति) के भीतर । पृथक DAPI धुंधला पैनल Bमें दिखाया गया है, और स्वचालित ठहराव के दौरान उपयोग किए जाने वाले DAPI के थ्रेशोल्ड को पेनल Cमें दिखाया गया है । सभी छवियों पर स्केल सलाखों ५०० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 7
    चित्रा 7: एक के पास के modiolar खंड के उच्च इज़ाफ़ा देखने के लिए एक सेलुलर माउस कोक्लीअ 2 कि hWJCs के साथ संचार किया गया था । DAPI परमाणु धुंधला पैनल Aमें दिखाया गया है, जो संरचनात्मक स्थलों प्रदान करता है ग्रीन चैनल से ग्रेस्केल autofluorescence पर मढ़ा । पृथक DAPI धुंधला पैनल Bमें दिखाया गया है, और स्वचालित कक्ष की गणना के दौरान उपयोग की गई थ्रेशोल्ड छवि को पेनल Cमें दिखाया गया है । कॉकलियर के भीतर रखे द्रव रिक्त स्थान और महीन microstructures प्रयोग के decellularization और कोशिका संस्कृति चरणों के दौरान संरक्षित किए जाते हैं । Scala Vestibuli (एसवी), Scala Tympani (एसएम), Basilar झिल्ली (बीएम), Tectorial झिल्ली (TM), सर्पिल Limbus (एल), Rosenthal के नहर (आर सी), Modiolus (एम), सर्पिल बंधन (SL), और Stria Vascularis (*) । Reissner की झिल्ली स्पष्ट रूप से ऊतक वर्गों में परिभाषित नहीं था, और एक परिणाम के रूप में Scala मीडिया स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं किया गया था । सभी छवियों पर स्केल सलाखों २५० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Figure 8
    चित्रा 8: Hematoxylin और Eosin नियंत्रण और इलाज cochleae के दाग । Hematoxylin और Eosin सना हुआ वर्गों वर्तमान देशी कोशिकाओं के साथ एक ठेठ कोक्लीअ प्रदर्शित करने के पैनल aमें दिखाया गया है । पैनल बी एकपैनल के रूप में एक ही संरचनाओं शामिल हैं, लेकिन एक पूरी तरह से सेलुलर कोक्लीअ, जो extracellular मैट्रिक्स के पीछे छोड़ देता है । दो पहले hWJCs के साथ संचार cochleae दिखाया पैनलों सी और डीमें देखा जाता है । सकल कॉकलियर शरीर रचना विज्ञान decellularization और सेल संस्कृति प्रक्रियाओं के माध्यम से मुख्य रूप से अपरिवर्तित रहता है, हालांकि विशिष्ट कोशिका आबादी और स्थानों नाटकीय रूप से बदल रहे हैं । Scala Vestibuli (एसवी), Scala Tympani (एसएम), Basilar झिल्ली (बीएम), Tectorial झिल्ली (TM), सर्पिल Limbus (एल), Rosenthal के नहर (आर सी), Modiolus (एम), सर्पिल बंधन (SL), और Stria Vascularis (*) । सभी छवियों पर स्केल सलाखों २५० µm हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    A1 कोक्लीअ + कक्ष A2 कोक्लीअ + कक्ष B2 नेग.
    नियंत्रण कोक्लीअ बोनी भूलभुलैया के बाहर ३,७५८ ५४९ 0 हड्डी के बाहर कोक्लीअ रिक्त स्थान २४८ ५८६ 0 दरम्यान कोक्लीअ ५१८ ७०१ 0 कुल कक्ष ४,५२४ १,८३६ 0 अनुभाग खंड (μl) ०.००७७ ०.०१०० ०.०१४७ कोक्लीअ वॉल्यूम का प्रतिशत ०.४६% ०.५९% ०.८७% कोक्लीअ के भीतर अनुमानित कोशिका घनत्व ११३,७५९ ११८,७३२ 0

    तालिका 1: कक्ष की गणना. DAPI सना हुआ कॉकलियर वर्गों और थ्रेसहोल्ड ImageJ में स्वचालित गिनती उपकरण का उपयोग कर मात्रा ब्याज की 3 गैर अतिव्यापी क्षेत्रों (बोनी भूलभुलैया के बाहर, कॉकलियर द्रव रिक्त स्थान के बाहर लौकिक हड्डी, और कोक्लीअ के भीतर) थे । क्रॉस-अनुभागीय कॉकलियर क्षेत्र भी ImageJ में मापा गया था, और इस मूल्य खंड मोटाई (10 µm) के साथ संयोजन में खंड की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । संती एट अल द्वारा प्रकाशित कुल कॉकलियर मात्रा के एक अनुमान का उपयोग करना. 23, किसी दिए गए अनुभाग के सापेक्ष कॉकलियर वॉल्यूम की गणना की गई । पूरे कोक्लीअ के कोशिका घनत्व युग्मित सेल गिनती के साथ संयोजन में एक दिया अनुभाग के सापेक्ष कॉकलियर मात्रा का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था ।

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    Discussion

    हम सफलतापूर्वक दिखा दिया है कि देशी कॉकलियर कोशिकाओं कोक्लीअ से एक decellularization प्रक्रिया है, जो एक जटिल, तीन आयामी ऊतक पाड़ के रूप में कोक्लीअ के उपयोग के लिए अनुमति देता है के माध्यम से हटाया जा सकता है । संती एट अल. 15 decellularizing cochleae के लिए प्रारंभिक विधि विकसित की है, और सही प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी23की सहायता के साथ के माध्यम से कई कॉकलियर संरचनाओं के संस्करणों का अनुमान है । इस तरह के प्रारंभिक कार्य ऊतक इंजीनियरिंग और सेल संस्कृति तकनीक यहां प्रस्तुत करने के लिए एक मजबूत आधार के रूप में कार्य किया । सेलुलर कोक्लीअ सफलतापूर्वक कोशिकाओं के साथ संचार किया जा सकता है, और फिर समय की एक लंबी अवधि के लिए संस्कृति । पशुओं की एक विस्तृत सरणी से Cochleae सैद्धांतिक रूप से कोशिकाओं के प्रकार की एक इसी तरह की व्यापक सरणी के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है । इन संयोजनों यहां प्रस्तुत तकनीकों की अनुमति ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों है कि संवेदी उपकला विकास की जांच के रूप में कई संभव प्रयोगात्मक डिजाइन, में उपयोग किया जा14, नई दवा एजेंटों के ड्रग परीक्षण 24, और कॉकलियर मरंमत मॉडल25के विकास । हालांकि, इन तकनीकों की व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद वे सीमाओं के बिना नहीं हैं ।

    वर्तमान तकनीक की सीमाओं में से एक है कि छिड़काव व्यक्ति के आधार पर चर रहा है । एक धारक का विकास, कोक्लीअ के लिए, और perfusions आचरण करने के लिए एक सिरिंज पंप का उपयोग सटीकता और प्रक्रिया की सफलता में वृद्धि हो सकती है. इसके अतिरिक्त, निश्चित साबित सफल decellularization संभावित कई तरीकों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है । हम DAPI धुंधला है कि शेष सेल नाभिक यों तो इस्तेमाल किया गया था कार्यरत है, और हम कोई अवशिष्ट नाभिक पोस्ट decellularization मनाया । इसके अतिरिक्त, मानक डीएनए ठहराव परख एजेंट का उपयोग, ग्रीन डाई डीएनए की picogram मात्रा का पता लगाने, न्यूक्लिक एसिड अवशेष, जो नेत्रहीन न्यूक्लिक के छोटे टुकड़े की उपस्थिति की पहचान करने के लिए DAPI से अधिक संवेदनशील हो सकता है की पहचान करने के लिए सेलुलर ऊतकों में एसिड26। चाहे जो तकनीक सफल decellularization को मांय करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह एक पाड़ के रूप में उपयोग करने से पहले एक व्यक्ति कोक्लीअ की पूरी decellularization दिखाने के लिए संभव नहीं हो सकता है । फिर भी, हम decellularization प्रक्रिया को सफल और मजबूत हो पाया है ।

    वर्तमान प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम cochleae के अलगाव और हैंडलिंग रहे हैं, और cochleae के छिड़काव । महान देखभाल लिया जाना चाहिए जब कोक्लीअ शुरू में अलग है, के रूप में कोक्लीअ नाजुक और भंगुर है । संदंश के साथ कोक्लीअ हैंडलिंग करते समय बहुत अधिक बल लागू किया जाता है, तो कोक्लीअ अंश हो सकता है । इस प्रकार, यह decellularization और decalcification से पहले धीरे से प्रत्येक कोक्लीअ संभाल अनिवार्य है । vestibular प्रणाली, अगर बरकरार छोड़ दिया, संदंश के साथ भीतरी कान परिसर हथियाने के लिए एक महान संभाल के रूप में कार्य करता है, और कोक्लीअ उंमुख । इसी प्रकार, जब perfusing कोशिकाओं के साथ कोक्लीअ, छिड़काव के पीछे दबाव भी महान नहीं होना चाहिए, अन्यथा कोशिकाओं छिड़काव जीवित नहीं हो सकता है. के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित है, एक 1-एमएल इंसुलिन सिरिंज के अंत करने के लिए टयूबिंग संलग्न एक हाथ से कोक्लीअ की आसान हैंडलिंग के लिए अनुमति देता है, और perfusing कोशिकाओं में दूसरे हाथ से कोक्लीअ के माध्यम से अधिक से अधिक परिशुद्धता ।

    अगले चरण के रूप में, यह निर्धारित करने के लिए विकासात्मक और कार्यात्मक मार्करों का मूल्यांकन करना स्वाभाविक होगा यदि कॉकलियर ECM स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित कर रहा है, और यदि ऐसा है, जो कोक्लीअ में विशिष्ट ECM घटकों कोशिकाओं में परिवर्तन उत्प्रेरण रहे हैं । Perfusing कोशिकाओं के विभिंन प्रकार (जैसे, स्टेम सेल, neuroprogenitors, fibroblasts, आदि) कोक्लीअ के माध्यम से कोशिका भेदभाव और व्यवहार पर नजर रखने के लिए एक और आकर्षक अनुवर्ती जांच होगी । इसके अलावा, कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है या एक वृद्धि कारक भेदभाव प्रोटोकॉल के संपर्क में नए अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है कैसे कॉकलियर ECM neurosensory विकास का समर्थन करता है, और संभवतः भी सुनवाई में काम करते हैं । इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल कॉकलियर ECM का उपयोग करने के लिए भीतरी कान neurosensory विकास और रखरखाव है, जो एक दिन नए उपचारों के विकास के लिए सुनवाई हानि बहाल करने के लिए नेतृत्व कर सकते है अध्ययन में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    मौजूदा परियोजना अवधारणा कोष के कैनसस सबूत के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया । हम मानव गर्भनाल प्राप्त करने में हमें सहायता के लिए KUMC (कैनसस सिटी, एस) में नर्सिंग स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और cochleae संस्कृतियों के साथ सहायता के लिए डेविड Jorgensen ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

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    References

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    इंजीनियरिंग १३१ अंक,: कोक्लीअ हेयर सेल पाड़ decellularize व्हार्टन जेली कोशिकाओं ऊतक इंजीनियरिंग सेल संस्कृति
    भीतरी कान ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Decellularizing माउस Cochleae के लिए एक प्रोटोकॉल
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    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

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