Målet med detta protokoll är att demonstrera en effektiv metod för att decellularize och om avkalkning mus cochleae för utnyttjande som ställningar för tissue engineering program.
Hos däggdjur, mechanosensory hårcellerna som underlättar förhandlingen saknar förmågan att regenerera, som har begränsad behandlingar för hörselnedsättning. Nuvarande strategier för regenerativ medicin har fokuserat på transplantation av stamceller eller genetisk manipulation av omgivande stödjeceller i innerörat att uppmuntra utbyte av skadade stamceller att korrigera hörselnedsättning. Men den extracellulär matrixen (ECM) kan spela en viktig roll i inducerande och upprätthålla funktion av hårceller, och har inte undersökts väl. Med hjälp av cochlear kan ECM som en byggnadsställning växa adulta stamceller ge unika insikter i hur sammansättning och arkitekturen av den extracellulära miljön hjälper celler upprätthålla förhandlingen funktion. Här presenterar vi en metod för att isolera och decellularizing cochleae från möss att använda som ställningar att acceptera perfunderade adulta stamceller. I det nuvarande protokollet isoleras cochleae från euthanized möss, cell-lösa och urkalkade permanenta. Efteråt, var mänskliga Wharton’s jelly celler (hWJCs) som var isolerade från navelsträngen noggrant perfusion in varje cochlean. Cochleae användes som bioreaktorer och celler odlades i 30 dagar innan de genomgick behandling för analys. Cell-lösa cochleae behöll identifierbar extracellulära strukturer, men avslöja inte förekomsten av celler eller märkbar fragment av DNA. Celler perfusion in i cochlean invaderade de flesta av interiör och exteriör av cochlean och växte utan incidenter under en löptid på 30 dagar. Dagskursmetoden kan således användas för att studera hur cochlear ECM påverkar cell utveckling och beteende.
Snäckan är en intrikat spiralstrukturen Funna i tinningbenet. Den består av en yttre benig labyrint och en koncentrisk, inre membranös labyrint1. Membranös labyrinten består av tre flytande utrymmen: Scala vestibuli, Scala media och Scala tympani1. Scala media hus sensoriska epitelet, som består av en mängd celltyper, men sensoriska hårcellerna (HC), som transduce mekanisk energi i ljudvågor till nervimpulser2, är av särskilt intresse. Exponering för akustisk trauma3,4,5, medicinering6, sjukdom7,8och åldrande9 kan alla leda till nedsatt hörsel funktion via HC död. Hår cellförlust hos däggdjur är permanent, till skillnad från aviär HCs, som kan regenerera efter skada10.
En mängd samtida forskningsansträngningar har försökt att återställa förlorade HCs, även om de specifika experimentella metoderna varierar. Manipulation av genuttryck i sensoriska epitelet och implantation av stamcellerna differentierade utanför kroppen är dominerande ansatser inom, men induktion metoder som syftar till att differentiera stamceller till cochlear organoids har varit försökt11,12,13. Alla dessa metoder är antingen direkt beroende av stamceller eller utvecklingsmässiga ledtrådar används av stamceller; dock en andra delade, och potentiellt kritiska, elementet är ECM av snäckan själv14,15.
ECM ger inte bara fysiska stöd för celler och vävnad, som omfattar en yta för celladhesion, spridning, överlevnad och migration, men också spelar avgörande roller i utvecklingen av HCs och spiral ganglion15,16 ,17. Naturligt ger förekommande ECM induktiva signaler som kan vägleda cell fenotyp bestämning eller cell adhesion, spridning och överlevnad18. Därför, användningen av cell-lösa snäckan i kombination med odlade hWJCs erbjuder en unik möjlighet att utforska rollen av ECM och HC regeneration. HWJCs är en lättillgänglig, icke-kontroversiella celltyp som isolerats från mänskliga navelsträngar som beter sig som mesenkymala stamceller19. HWJCs har visat förmågan att skilja ned sensorineural cell härstamningar20,21. Således, det nuvarande protokollet uppgifter om isolering, decellularization och genomblödning av cochleae från C57BL mus slaktkroppar med hWJCs för innerörat vävnadsteknik.
Vi har framgångsrikt visat att infödda cochlear celler kan tas bort från snäckan via en decellularization process, vilket möjliggör användning av snäckan som en intrikat, tredimensionella vävnad byggnadsställning. Santi et al. 15 utvecklade den första metoden för decellularizing cochleae, och har korrekt uppskattade volymerna för många cochlear strukturer genom med hjälp av lätta blad mikroskopi23. Sådana tidiga arbete fungerat som en stark grund f…
The authors have nothing to disclose.
Det aktuella projektet finansierades av University of Kansas bevis på konceptet fonden. Vi vill tacka vårdpersonalen på KUMC (Kansas City, KS) för att hjälpa oss att få mänskliga navelsträngar, och David Jorgensen bistå med cochleae kulturer.
Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |