Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

Bu iletişim kuralının amacı decellularize ve fare cochleae doku mühendisliği uygulamaları için iskele olarak kullanımı için decalcify için etkili bir yöntem göstermektir.

Abstract

Memelilerde, işitme eksikliği yeniden yeteneği kolaylaştırmak mechanosensory saç hücreleri olan işitme kaybı için tedavi sınırlıdır. Geçerli rejeneratif tıp stratejileri kök hücre veya destek hücreleri değiştirme hasarlı kök hücrelerin işitme kaybı düzeltmek için teşvik etmek için iç kulak çevresindeki genetik manipülasyon nakli üzerinde odaklanmıştır. Henüz, hücre dışı Matriks (ECM) inducing ve saç hücreleri işlevini sürdürmek hayati bir rol oynayabilir ve değil de soruşturma. Koklear kullanarak nasıl kompozisyon ve ekstraselüler ortamın mimari AIDS hücreleri işitme fonksiyonu sürdürülmesi içine benzersiz anlayışlar ECM bir iskele olarak erişkin kök hücreleri büyümeye sağlayabilir. Burada izole ve cochleae üzerinden periosteum erişkin kök hücreleri kabul iskele kullanmak için fare decellularizing bir yöntem mevcut. Geçerli protokol cochleae decellularized ve decalcified euthanized fare, izole edilmiştir. Daha sonra göbek kordonu izole edildi insan Wharton'ın jöle hücreleri (hWJCs) dikkatle her koklea derin. Cochleae Biyoreaktörler kullanıldı ve analiz için işleme geçiren 30 gün için hücreler kültürlü. Decellularized cochleae olarak tanımlanabilir hücre dışı yapılar korunur ama hücrelerin varlığı veya DNA'ın dikkat çeken parçaları olmadığını göstermiştir. Koklea derin hücreler içte ve dışta koklea çoğunu işgal ve olay olmadan 30 gün süre içinde büyüdü. Böylece, geçerli yöntemi nasıl koklear ECM etkiler hücre gelişimi ve davranış çalışma için kullanılabilir.

Introduction

Koklea temporal kemik bulundu bir karmaşık sarmal yapısıdır. Bir dış kemik labirent ve konsantrik, iç membranöz labirentin1oluşur. Membranöz labirentin üç sıvı boşluk oluşur: Scala vestibuli, Scala medya ve Scala tympani1. Çok sayıda hücre tiplerinin oluşmaktadır, duyu epiteli scala medya evler ama duyusal saç ses dalgaları sinir uyarılarının2mekanik enerji transduce, hücreleri (HC), belirli ilgi vardır. Akustik travma3,4,5, ilaç6, hastalık7,8ve yaşlanma9 maruz tüm Engelli işitsel işlevi HC ölüm ile sonuçlanabilir. Memelilerde saç hücre kaybı kalıcı yaralanma10' dan sonra yeniden oluşturabilirsiniz kuş HCs aksine.

Çağdaş araştırma çabalarının çeşitli çalışmışlardır kayıp HCs, geri yüklemek belirli deneysel yaklaşımlar farklılık. Duyu epiteli gen ifadesinde manipülasyon ve vücut dışında farklı kök hücre implantasyonu baskın yaklaşım alanında, kök hücre koklear organoids ayırt etmeye indüksiyon yöntemleri olmasına rağmen vardır 11,12,13çalıştı. Her bu yaklaşımların olması güvenen doğrudan kök hücre veya kök hücreleri tarafından; kullanılan gelişimsel ipuçları Ancak, bir saniye paylaşılan ve potansiyel olarak kritik koklea kendisi ECM öğedir14,15.

ECM sadece fiziksel için hücre ve doku, hücre adezyon, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma ve geçiş için bir yüzey içerir, ancak aynı zamanda HCs ve sarmal ganglion15,16 gelişiminde önemli roller oynar destekler ,17. Doğal olarak meydana gelen ECM hücre fenotip belirlenmesi ve/veya hücre adezyon, yayılmasını önleme ve hayatta kalma18rehberlik endüktif sinyalleri sağlar. Sonuç olarak, kültürlü hWJCs ile birlikte decellularized koklea kullanımı ECM ve HC rejenerasyon rol keşfetmek için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. HWJCs Mezenkimal Kök hücre19gibi davranan insan göbek bağları gelen izole bir hazır, tartışmalı olmayan hücre türü vardır. HWJCs neurosensory hücre soy20,21ayırt etmek için yetenek göstermiştir. Böylece, geçerli protokol izolasyon, decellularization ve cochleae C57BL fare leşleri ile iç kulak doku mühendisliği için hWJCs dan perfüzyon ayrıntıları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yordamları, hayvan ötenazi, dahil olmak üzere onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) iletişim kuralı (ACUP #2014-2234) Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi (KUMC) göre yapılmıştır.

Not: HWJCs Onam sağlanan hastalar tarafından bağışlandı insan göbek bağları yalıtılmış ve numuneler Kansas Üniversitesi insan denekler Komitesi tarafından (KU-IRB #15402) onaylanmış protokolleri uygun olarak kullanılmıştır.

1. Temporal kemik hasat ve koklea yalıtım

  1. Cerrahi makas keskin bir çift ile kafatası ve ilk servikal omur arasında keserek uygun şekilde ötenazi, 15-hafta-yaşlı fare başını kesmek, o zaman (şekil 1A) dezenfekte için % 70 etanol ile baş aşağı sprey.
  2. Cerrahi makas (şekil 1B-C, kesik çizgiler) aynı keskin çiftini kullanarak bir-sagittal düzlemde kafatası bisect.
  3. Beyin dokusu forseps (şekil 1 d, ok ucu) bir çift kullanarak kafatasından kaldırın.
  4. Temporal kemik işitsel varlığı ve kafatası ve (şekil 1F, ok) dış kulak kanalına iç vestibular sinir kökleri (şekil 1E-F, ok uçları) tanımlayın. Dikkatle kafatası kafatası (şekil 1G) kalan şakak kemiğinden yalıtmak için kesti.
    Not: bazı durumlarda, ince kesim gerek kalmadan kafatası temporal kemik uzak çevresindeki kemiklerin burnumu sokmak mümkün olabilir.
  5. Böylece ipuçları koklea delinme riski değil iyi forseps kulak kanalına yaklaşık 5 mm (şekil 1 H), açılış içine ekle. Yavaşça bulla (şekil 1 H, en iyi kırmızı gölgeli alan) kemik kır aç (noktalı1I rakam, kırmızı hat) kırıkları bu yüzden.
    Not: gerekirse, diseksiyon mikroskop bu süreçte doğru yerleştirme ve işleme aletleri sağlamak için yardımcı olabilir.
  6. İyi forseps kullanarak, uzak bulla temporal kemikten, koklea (şekil 1J, kırmızı köşeli ayraçlar) kemik labirent maruz kalan gözetlemek.
  7. Temporal kemik alacak kadar büyük bir Petri kabına yerleştirin (örneğin, 30 mm veya daha büyük) altında diseksiyon kapsam görüş alanı ve yeterli fosfat tamponlu tuz (temporal kemik (örneğin, 0.5-1 mL) kapsayacak şekilde PBS ile) doldurun.
  8. Yukarı dönük olacak şekilde koklea oval ve yuvarlak pencerelerle PBS kaldırıldı bulla ile temporal kemik daldırın.
    Not: Vestibüler sistem manipüle ve koklea (1I anlamaya ve şekil 2B) özelliklerini yönlendirme için de bir kolu olarak hizmet vermektedir olarak koklea Vestibüler sistemden kaldırılması gerekli değildir.
  9. Forseps Ultra-ince bir çifti kullanarak, stapes geçer stapedial arter kaldırın.
  10. Ultra-ince forseps nerede arter geçtiğini üzengi kemer aracılığıyla bir ucu yerleştirin ve ince üzengi yukarı doğru kaldırın. Disarticulated üzengi oval pencere kapalı kaldırmak.
  11. Ultra-ince forseps bir ucu kullanarak, oval ponksiyon ve windows yuvarlak.
  12. 1 x PBS kullanarak 28.5'lik şırınga ile tüp dolu (iç çap 0,28 mm, dış çap 0,61 mm) bağlı, tüp oval penceresinin üzerine getirin (şekil 2A -B).
    Not: Tüp açılış yardımcı olmak doğru yerleşim sağlamak için ultra-ince forseps kullanarak manipüle edilebilir.
    1. Temiz şırınga ve boru her koklea için kullanın.
  13. % 10 antibiyotik antimycotic (anti-anti) ve % 10 penisilin-streptomisin (kalem-strep) PBS içinde koklea 5 dk ile perilymph kaldırmak için 2 mL sıvı. Çok hızlı çok fazla baskı ile Ventriküler koklea içinde güzel yapıları zarar verir.
    Not: bir perfüzyon pompası alternatif olarak kullanılabilir, ancak el ile el ile koklea yoluyla sıvı sıvı şırınga sürüş etkilidir.
    1. El ile Ventriküler, koklea (şekil 2A) dengelemeye forseps perfüzyon sırasında kendi kendine kapanış temporal kemik Vestibüler bölümünü açgözlü bir çift iyi kullanın.
      Not: gerekli değildir, ancak bu iki el aletleri işlemek serbest bırakır; bir yandan diğer tüp konumlandırabilirsiniz iken şırınga (şekil 2A) sürebilirim uygun şekilde (şekil 2B).
    2. Bu adım ileri, koklea gereksiz yere hava için kullanılmasını önlemek için dikkat ediniz. Hava kabarcıkları sıvı alanlarda tanıtımı sıvı dolaşımını engeller ve daha fazla kurumasını koklea içinde güzel yapıları zarar verir.
  14. Kaldırmak ve iyi forseps kullanarak herhangi bir kalan kas doku ve kemik parçaları atın.
  15. Gerekirse, izole cochleae 4 ° C'de % 10 anti-anti ve % 10 kalem-strep çözümde PBS antibiyotik çözüm her 48 h normal değişikliklerle yedi güne kadar saklayın.

2. koklear işleme

  1. Decellularization
    1. Her koklea için dolgu 20 mL cam mercek şişe ile % 1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çözüm koklea decellularize eskiden de-iyonize (DI) su içinde.
    2. Kapalı açılış geçmesine bir koklea için yeterli büyüklükte bir jilet kullanarak bir plastik 7-mL transfer pipet ucu kesilmiş.
    3. Sadece bir kaç milimetre kesme kenarına geçer böylece transfer pipet kullanarak yavaşça koklea pipet çizin.
    4. Koklea % 1 SDS çözüm dolu mercek flakon kovmak.
    5. 2 mL % 1 SDS koklea transfer pipet kullanarak mercek şişe içinde de-iyonize (DI) su içinde dolaşımda.
    6. Mercek şişe bir rotator yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 h için 10 RPM döndürmek mercek şişe sağlar.
      1. % 1 SDS çözüm her 24 h bir 72 saat süre içinde değiştirin. SDS koklea hava için pilleri değiştirirken dikkat et.
    7. Koklea üç kez için 30 dk her DI su ile yıkayın.
SDS giderler için kullanılan aynı mercek şişe yıkama gerçekleştirmek; Bu aşamada, koklea decellularized.
  • Kalsiyumun
    1. Kalan DI su batık koklea tutmak yeterli bırakarak mercek şişeyi kaldırın.
    2. Kalsiyumun başlamak için koklea içeren mercek şişeyi DI suda 5 mL % 10 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0,02 M) de ekleyin.
    3. 2 mL % 10 EDTA DI suyun içinden bir transfer pipet kullanarak mercek şişe koklea içinde dolaşımda.
    4. Mercek şişeyi geri rotator içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında 72 h için 10 RPM döndürmek mercek şişe sağlar. % 10 EDTA çözüm her 24 h bir 72 saat süre içinde değiştirin. Böylece koklea havaya maruz değil çözümleri değiştirirken dikkat et.
    5. 1 x PBS ile her 2 h için 3 kez koklea durulayın; Bu aşamada, koklea decalcified.
  • Depolama
    1. Cochleae en fazla 72 saat için % 10 anti-anti, % 10 kalem-strep çözeltilerine PBS 4 ° C'de depolayın
      Not: Daha uzun depolama süre antibiyotik çözüm düzenli değişiklikler ile mümkün olabilir; Ancak, genişletilmiş depolama işlenmiş cochleae, bu protokol için doğrulanmadı.

    • 3. satın alma ve hWJCs genişlemesi

    1. HWJCs göre daha önce yayımlanmış protokolleri22yalıtmak. Kısaca, göbek bağları 3 cm bölümlere kesiminde.
    2. Dikkatli bir neşter ile sığ bir kesi boyuna göz önüne sermek ve göbek kordonu Wharton'ın jöle maruz her göbek kordonu kesiminde olun. Forseps kan damarları kaldırmak için kullanın.
    3. Göbek kordonu kesimleri yeterince PBS (örneğin, 60 mm Petri kabına 40 mL) ile iki kez doku daldırın yıkayın. İnce doku parçaları bir neşter ile kıyma. Sindirmek doku 100 mm Petri dish ile sindirim orta 50 mL (% 0,2 tip 2 collagenase, % 1 penisilin-streptomisin, düşük glikoz içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM)).
    4. Doku bir orbital Çalkalayıcı geceleme bir % 5 CO2, 37 ° C kuluçka 50 RPM medyada sindirerek yerleştirin. Ertesi gün, seyreltik sindirim orta 1:16 antibiyotik-antimycotic PBS %2 oranında ve cips hücreleri tarafından Santrifüjü vasıl 500 x g oda sıcaklığında (~ 27 ° C) için 10 dk. atma süpernatant.
    5. Granül Mezenkimal Kök hücre büyüme orta (MSCGM) resuspend ve hücreleri birleştireceğimi. 7 x 103 hücreleri/cm2 doku kültürü'yoğunluğu plaka hücreleri T-75 şişeler tedavi. HWJCs MSCGM içinde kültür ve geçit 5 deneyler için genişletin.
      Not: HWJCs daha büyük T-şişeler alt kültürlü (örneğin, T-150, T-300) hWJCs deneyler için verimini artırmak için passaging zaman.

    4. Decellularized Cochleae içine hWJCs infüzyonu

    1. Decellularized cochleae hazırlamak
      1. Aseptik tekniği kullanarak, saklı cochleae 1 x PBS 30 dk için üç kez yıkayın.
      2. Cochleae 24-şey plaka ayrı kuyu aktarmak ve 37 ° C 1 mL ekleyin önceden MSCGM ısıttı.
      3. Cochleae bir % 5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka en az 1 h önce hücreleri infüzyonu kuluçkaya.
    2. HWJCs ayırmak ve resuspend
      1. Yıkama hWJCs 37 ° C ile 1 x PBS iki kez önceden ısıttı.
      2. Yeterli 37 ° C eklemek önceden tripsin hücre gemi yüzeyi kapsayacak şekilde % 0.5 EDTA ile ısıttı.
      3. HWJCs 5 dakikaya kadar bir % 5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka için kuluçkaya.
        1. Ters bir mikroskop altında hücreler görüntüleyerek %90 hücre hücre kültür yüzeyden ayırdıktan doğrulayın.
          Not: Kültür gemi hafifçe vurdu olduğu zaman, hareket hücreleri ilişkisi kesildi. Sabit kalır, değil ayırdıktan hücreler.
        2. Daha fazla bağlı hücreler çıkarmak için balonun kenarlarına hafifçe dokunun.
      4. Aseptik teknik kullanılarak, kültür gemisinden transfer hWJCs içeren MSCGM eşdeğer bir birimi tripsin hacmiyle 50 mL konik tüp için hücreleri ayırmak için kullanılır.
      5. 500 x g oda sıcaklığında, centrifuging tarafından hWJCs cips (~ 27 ° C) 5 min için.
      6. Süpernatant Aspire edin ve hWJCs bir konsantrasyon 500.000 hücre/mL MSCGM resuspend.
    3. Cochleae sıvı
      1. Cochleae transfer pipet kullanarak yeni bir 24-şey tabağa aktarın.
      2. MSCGM bir damla herhangi bir koklea kurumasını önlemek için her koklea ekleyin.
      3. İnce oval ve yuvarlak windows karşı karşıya yükleyebilmeniz için ultra-ince forseps kullanarak koklea gelecek şekilde yönlendirin.
        Not: koklea kolayca zarar gibi her koklea doğrudan işlerken aşırı kendine iyi bak.
      4. Steril 28.5'lik insülin ile bağlı tüp kullanarak, 0.2 mL resuspended hWJCs (100.000 hücreleri) kadar çizin.
      5. Steril iyi forseps kullanarak, boru oval penceresinin üzerine getirin.
      6. İnce ve yavaş yavaş koklea ile resuspended hWJCs polietilen boru için bağlı 28.5'lik insülin kullanarak 0.2 mL sıvı (dış çap: 0,61 mm, iç çapı: 0,28 mm) yaklaşık 5 dk içinde.
      7. Perfüzyon sonra 37 ° C 0.8 mL ekleyin önceden sıcak MSCGM de 1 mL su kuyusunda Toplam hacim getirmek koklea içeren için.
      8. Adımları 4.3.3-4.3.7 taze bir Ģırınga kullanarak ve her zaman boru her koklea için yineleyin.
      9. Yer cochleae %5 CO2, 37 ° C hücre kültür kuluçka ve değişim medya haftada üç kez derin.

    5. koklea hasat ve koruma

    Not: Cochleae kültürlü olabilir ve herhangi bir zaman noktasında 30 gün sonrası perfüzyon hasat.

    1. Cochleae korumak için 1 x PBS gecede 4 ° C'de sallanan bir platformda %4 paraformaldehyde düzeltin.
    2. Fiksasyon sonra cochleae 1 x PBS 5 min için üç kez ile yıkayın.
    3. Yavaş yavaş koklea etanol ile kurutmak ve parafin içinde katıştırma önce bir Alifatik hidrokarbon çözücü ile temizleyin.
    4. Örnekleri için bir microtome kullanarak 10 µm kalınlığında bölüm ve cam mikroskop slaytlar üzerine monte edin.
      Not: Örnekleri için hazırsınız histolojik veya immunohistokimyasal işleme standart protokolleri kullanarak.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Burada sunulan yöntemleri kullanarak, cochleae başarılı decellularization varlığı ya da yokluğu DNA ile 4', inceleyerek değerlendirildi 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) boyama. DNA decellularized koklea içinde tanımlanmamış Eğer cochleae tam olarak decellularized kabul edildi. Yerel bir koklea decellularization veya incelemelerine tabi değil bir önceki deneme olumlu bir denetim yapıları ve geleneksel olarak bir C57BL fare koklea içinde bulunan hücreleri göstermek için kullanıldı. İnfüzyon herhangi bir hWJCs yoktu, decellularized-decalcified koklea, bir negatif kontrol kullanıldı. Hiçbir ölçülebilir lekeli DAPI hücre çekirdeği doku bölüm (şekil 3) herhangi bir bölgede tespit edildi. İki cochleae decellularized decalcified ve sonra hWJCs geçerli proje için ilham. HWJCs ile derin decellularized-decalcified cochleae çok sayıda DAPI için çekirdek koklea ve koklea (Tablo 1) dışında kemikli kabuk üzerinde büyüyen içinde lekeli tespit edildi. Toplam tahmini hücre yoğunluğu hücre için infüzyon ilk koklea vardı 113,759 hücreler/koklea sonra kültür (şekil 4 ve şekil 5) ve ikinci koklea için 30 gün 30 gün sonra kültür 118,732 hücreler/koklea (şekil 6 ve Şekil 7). Bu hücre yoğunluğu tahminler Scala tympani, Scala medya ve Scala antre ve hacimli üç sıvı boşluk içinde bulunan yapılar içerir, ancak bu tahminler herhangi bir kalan kemik labirent hariç. Buna ek olarak, her koklea örnekleri Hematoksilen ve Eozin ile lekeli (H & E) hücreleri ve anatomik özellikleri her koklea (şekil 8) içinde varlığını göstermek için. Koklear microstructures gross anatomi tüm lekeli bölümleri boyunca ağırlıklı olarak değişmeden kalmıştır; Ancak, hiçbir hücre decellularized decalcified bölümünde (şekil 8B) olarak tanımlanabilir. Hücre çekirdeği tanımlaması önemli ölçüde farklı arada yerel koklea (şekil 8A) ve infüzyon içeren hücreleri (şekil 8 c-D) decellularized-decalcified cochleae.

    Figure 1
    Şekil 1: fare temporal kemik yalıtım. Fare uygun şekilde euthanized sonra keserek kafatası tabanı ve ilk servikal omur arasında hayvan başını kesmek ve kafa(a)dezenfekte etanol ile sprey. Cerrahi makas, beyin doku ve kemik ile kesme keskin bir çift kullanarak kafatası (B-C) bölümünün bir sagittal düzlemde bisect. Fare böldüğü kafa (D, alt çene için ilişkisiz deneysel iş kaldırıldı) o zaman temporal kemik ortaya çıkarmak için kaldırıldı beyin doku olması gerekir. İki foramina üzerinden işitsel ve vestibular sinir pass (E, kırmızı ok uçları) yararlı ipuçları başarıyla temporal kemik tanımlamak için. Eti kafatasından (F) kaldırın. Dış kulak kanalının (F, ok, üst panel) yararlı bir harici işaret de sağlar. Dikkatlice uzakta sadece izole temporal kemik (G) bırakarak aşırı kemik kırpın. Bulla (H, üst panel, kırmızı vurgulanan alanı) sonra ince ince forseps (H, alt paneli) kullanılarak kaldırılmalıdır. Bulla ince kemik ve kemik labirent koklea ortaya (J, kırmızı parantez) kadar kolayca uzağa (Ben) yontma. Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Şekil 2: koklear perfüzyon. Temporal kemik izole edildikten ve bulla kaldırıldıktan sonra koklea sonra mikroskop, perfüzyon için ayarlanabilir. El ile tahrik boru ile kullanarak Ventriküler (çizgi noktalıA,) bağlı bir çift kendi kendine kapanma forseps kullanarak koklea stabilize etmek yararlı olabilir. Yavaşça forseps temporal kemik (B) Vestibüler parçası takın ve forseps Petri kabına(a)dudak karşı dinlenmek. Bu iki el aletleri perfüzyon sırasında işlemek özgür bırakır. Bir yandan sonra Öte yandan tüp oval forseps (B) ikinci bir çifti kullanarak penceresi üzerinde konumlandırabilirsiniz iken sıvı, Debi kontrol şırınga, üzerinde değişiklik yapabilir. Ücretsiz tüp sonuna bir açıyla kesme, daha kolay konumlandırma için doğru görüş alanı engellenmeden yerleştirilecek tüp izin verir. Ölçek çubuğu olduğunu 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Resim 3: bir decellularized fare koklea bölümünü doku. Dik bir epi-floresan mikroskobu örnekleri (10 X mercek ve 20 X objektif) 200 X büyütme, görüntü için kullanıldı. Görüntüleri birlikte yaklaşık 4 x 5 resim dizisi oluşturmak için dikişli. DAPI hücrelerin yokluğu gösteren boyama nükleer DAPI ortak bir filtre set (350 nm uyarma, 470 nm emisyon) ve pozlanmış bir kullanarak panel A floresein isothiocyanate (FITC) genel filtre kullanarak autofluorescence gri tonlamalı görüntü gösterilir Anatomik yerlerinden sağlayan küme (490 nm uyarma, 525 nm emisyon), Bpanelinde gösterilir. Her iki panelleri A ve Bbelirlenen faiz, üç bölgelerinde otomatik hücre sayımları yapıldı. Toplam hücre sayımları tüm doku bölümü (1, düz beyaz çizgi) ve koklea (2, kesikli çizgi) için hesaplanır. Bu iki sayı koklea dışında ama doku bölümü (3, noktalı çizgi ve kesikli çizgi arasındaki boşluk) dış, kemikli kenarlarını içinde kemik yapılarda hücre sayısını hesaplamak için kullanılmıştır. Ölçek barlar tüm görüntüleri 500 µm vardır.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Şekil 4: decellularized fare koklea 1 yakınındaki modiolar bir bölümünü infüzyon ile hWJCs. DAPI nükleer boyama A anatomik yerler sağlar yeşil kanal pozlanmış, bir gri tonlama autofluorescence üzerine bindirilmiş panelinde gösterilir. Hücre sayımları Apanelinde belirlenen faiz, üç bölgelerinde gerçekleştirilen otomatik. Toplam hücre sayımları tüm doku bölümü (1, düz beyaz çizgi) ve koklea (2, kesikli çizgi) için hesaplanır. Bu iki sayı koklea dışında ama doku bölümü (3, noktalı çizgi ve kesikli çizgi arasındaki boşluk) dış, kemikli kenarlarını içinde kemik yapılarda hücre sayısını hesaplamak için kullanılmıştır. İzole DAPI boyama Bpanelinde gösterilir ve otomatik miktar sırasında kullanılan DAPI boyama eşik Cpanelinde gösterilir. Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 5
    Şekil 5: decellularized fare koklea 1 modiolar bir bölümünü yüksek büyütme görünümünü infüzyon ile hWJCs. DAPI nükleer boyama A anatomik yerler sağlar yeşil kanal autofluorescence bir pozlanmış, gri tonlamalı görüntü üzerine bindirilmiş panelinde gösterilir. İzole DAPI boyama Bpanelinde gösterilir ve otomatik Hücre sayımı sırasında kullanılan eşik resim Cpanelinde gösterilir. Sıvı alanlarda ve koklea içinde yer alan ince microstructures güzel decellularization sırasında korunur ve deneme aşamaları kültür hücre. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal'ın kanal (RC), Modiolus (M), Spiral bağ (SL) ve çizikleri Vascularis (*). Reissner'ın membran açıkça doku bölümlerde tanımlı değil ve bunun sonucunda Scala medya değil açıkça tanımlanmıştır. Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 250 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 6
    Şekil 6: yakınındaki modiolar bir bölümünü hWJCs ile infüzyon decellularized fare koklea 2. DAPI nükleer boyama Masası'a Agri tonlama autofluorescence anatomik yerler sağlar yeşil kanal üzerine bindirilmiş, gösterilir. Hücre sayımları Apanelinde belirlenen faiz, üç bölgelerinde gerçekleştirilen otomatik. Toplam hücre sayımları tüm doku bölümü (1, düz beyaz çizgi) ve koklea (2, kesikli çizgi) için hesaplanır. Bu iki sayı koklea dışında ama doku bölümü (3, noktalı çizgi ve kesik çizgiler arasındaki boşluk) dış, kemikli kenarlarını içinde kemik yapılarda hücre sayısını hesaplamak için kullanılmıştır. İzole DAPI boyama Bpanelinde gösterilir ve otomatik miktar sırasında kullanılan DAPI boyama eşik Cpanelinde gösterilir. Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 500 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 7
    Şekil 7: hWJCs ile infüzyon decellularized fare koklea 2 modiolar bir bölümünü yüksek büyütme görünümünü. DAPI nükleer boyama Masası'a Agri tonlama autofluorescence anatomik yerler sağlar yeşil kanal üzerine bindirilmiş, gösterilir. İzole DAPI boyama Bpanelinde gösterilir ve otomatik Hücre sayımı sırasında kullanılan eşik resim Cpanelinde gösterilir. Sıvı alanlarda ve ince microstructures koklear içinde yer alan deneme decellularization ve hücre kültür aşamalarında korunur. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal'ın kanal (RC), Modiolus (M), Spiral bağ (SL) ve çizikleri Vascularis (*). Reissner'ın membran açıkça doku bölümlerde tanımlı değil ve bunun sonucunda Scala medya değil açıkça tanımlanmıştır. Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 250 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 8
    Şekil 8: Hematoksilen ve Eozin kontrol ve tedavi cochleae boyama. Hematoksilen ve Eozin bölümleri mevcut yerel hücrelerle tipik bir koklea görüntüleme lekeli Apanelinde gösterilir. Panel B panel Aolarak aynı yapıları içerir, ancak hücre dışı matriks bırakır bir tam decellularized koklea edinilebilir. HWJCs ile infüzyon iki daha önce gösterilen cochleae C ve Dpanellerinde görülmektedir. Her ne kadar belirli hücre popülasyonlarının ve mekanlar önemli ölçüde değişmiş brüt koklear anatomi decellularization ve hücre kültür süreçleri ile ağırlıklı olarak değişmeden kalır. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar membran (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal'ın kanal (RC), Modiolus (M), Spiral bağ (SL) ve çizikleri Vascularis (*). Ölçek barlar tüm görüntüleri vardır 250 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    A1 Koklea + hücre A2 Koklea + hücre B2 negatif.
    Denetim koklea Dış kemik labirent 3,758 549 0 Kemik dış koklea alanlarda 248 586 0 Koklea içinde 518 701 0 Toplam hücreleri 4,524 1,836 0 Bölüm birimi (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Koklea hacminin yüzde %0,46 %0.59 %0,87 Hücre yoğunluğu koklea içinde tahmini 113,759 118,732 0

    Tablo 1: hücre sayımları. Koklear bölümleri lekeli DAPI thresholded ve ImageJ (kemik labirent, temporal kemik koklear sıvı alanlarda dışında ve koklea içinde dışında) ilgi üst üste 3 bölgelerde otomatik sayım araçlarını kullanarak quantified vardı. Kesit koklear alanı da ImageJ içinde ölçüldü ve bu değer bölümü kalınlığı (10 µm) ile birlikte bölüm birimi hesaplamak için kullanıldı. Santi ve ark. tarafından Yayınlanan toplam koklear hacim tahmini kullanarak 23, belirli bir bölüm göreli koklear hacmi hesaplanır. Tüm koklea hücre yoğunluğu eşlenmiş hücre sayısı ile birlikte verilen bir bölümünün göreli koklear birim için tahmin edilmiştir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Yerel koklear hücreleri koklea koklea bir karmaşık, üç boyutlu doku iskele olarak kullanmak için izin verir bir decellularization süreci ile gelen kaldırılabilmesi için başarılı bir şekilde göstermiştir. Santi ve ark. 15 decellularizing cochleae için ilk yöntem geliştirdi ve birçok koklear yapıları birimleri hafif levha mikroskobu23yardımı ile doğru bir şekilde tahmin. Böyle erken dönem çalışmaları doku Mühendisliği ve burada sunulan hücre kültürü teknikleri için güçlü bir temel olarak görev yaptı. Decellularized koklea başarıyla hücrelerle infüzyon olabilir ve uzun bir süre için kültürlü. Cochleae hayvanlar geniş bir dizi hücre türleri benzer şekilde geniş bir dizi ile birlikte teorik olarak yararlanılabilir. Burada çok sayıda mümkün deneysel tasarımlar, doku Mühendisliği duyu epiteli geliştirme14incelemek, yeni ilaç ajanları test ilaç uygulamaları gibi kullanılmak üzere sunulan teknikleri bu birleşimlerine izin vermek 24, ve geliştirme koklear onarım model25. Ancak, bu teknikler geniş uygulanabilirliği rağmen onlar sınırlamalar değildir.

    Bir geçerli teknik sınırlamaları perfüzyon bireyin temel değişken olmasıdır. Bir sahibi, koklea için geliştirme ve perfusions yapmak için bir şırınga pompa kullanma doğruluk ve sürecinin başarısı artabilir. Ayrıca, başarılı decellularization kesin olarak ispat potansiyel olarak çeşitli yöntemlerle başarılı olabilir. Biz DAPI kalan hücre çekirdeği ölçmek için kullanılan boyama istihdam ve biz hiçbir kalıntı çekirdek yazı-decellularization gözlenen. Ayrıca, standart DNA miktar deneyleri kullanmak reaktif, yeşil boya picogram miktarda DNA nükleik asit kalıntıları, görsel olarak küçük parçaları nükleik varlığını belirlemek için DAPI daha daha duyarlı olabilir belirlemek için tespit decellularized doku26asitleri. Hangi teknikleri başarılı decellularization doğrulamak için kullanılan ne olursa olsun, bu bir iskele kullanan önce bireysel bir koklea tam decellularization göstermek mümkün olmayabilir. Yine de, biz decellularization işleminin başarılı ve sağlam olması için bulduk.

    Geçerli protokol en kritik iki adımda yalıtım ve cochleae işlenmesi ve cochleae perfüzyon vardır. Koklea hassas ve kırılgan olduğu gibi koklea başlangıçta izole olduğunda büyük özen göstermelidir. Çok fazla kuvvet Forseps ile koklea işlerken uygulanmışsa, koklea parçası. Böylece, her koklea hafifçe decellularization ve incelemelerine daha önce işlemek için zorunludur. Vestibüler sistem, sol bozulmamış, eğer karmaşık iç kulak Forseps ile kapma ve koklea yönlendirme için büyük bir kolu olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, koklea hücrelerle Ventriküler arkasında perfüzyon basıncı çok büyük olmaması gerekir, aksi takdirde hücreleri perfüzyon hayatta değil. Geçerli protokol belirtildiği gibi koklea ile bir yandan ve diğer elinizle koklea ile hücreleri Ventriküler daha yüksek hassasiyet elde etmek daha kolay işleme boru 1 mL insülin şırınga sonuna ekleme sağlar.

    Bir sonraki adım olarak, koklear ECM kök hücre farklılaşma inducing ve çok, hangi belirli ECM bileşenleri koklea içinde hücrelerdeki değişiklikler inducing belirlemek için gelişimsel ve işlev işaretçileri değerlendirmek için doğal olurdu. Koklea monitör hücre farklılaşma ve davranış ile hücreleri (örneğin, kök hücreler, neuroprogenitors, fibroblastlar, vb) farklı türde Ventriküler başka bir büyüleyici soruşturma olur. Buna ek olarak, genetik olarak değiştirilmiş veya bir büyüme faktörü farklılaşma iletişim kuralına maruz hücreler nasıl koklear ECM neurosensory geliştirmesini destekler içine yeni anlayışlar sağlamak ve işitme işlevinde hatta. Böylece, geçerli protokol işitme kaybı geri yüklemek için yeni tedavilerin geliştirilmesi için bir gün kurşun iç kulak neurosensory geliştirme ve bakım, eğitim için koklear ECM kullanarak bir önemli ilk adımdır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Geçerli proje kavramı Fonu University of Kansas kanıtı tarafından finanse edildi. Biz bize cochleae kültürleri ile yardım için insan göbek bağları ve David Jorgensen elde yardımcı olmak için KUMC (Kansas City, KS) hemşirelerin teşekkür etmek istiyorum.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Tags

    Biyomühendislik sayı: 131,: Koklea saç hücre iskele decellularize Wharton'ın jöle hücre doku Mühendisliği hücre kültürü
    Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter