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Bioengineering

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

O objetivo do presente protocolo é demonstrar um método eficaz para decellularize e descalcificar cochleae rato para utilização como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Abstract

Nos mamíferos, mechanosensory células ciliadas que facilitam a falta de audiência a capacidade de regenerar, que limitou a tratamentos para perda auditiva. Estratégias atuais de medicina regenerativa concentraram-se no transplante de células-tronco ou manipulação genética de em torno de células de suporte na orelha interna para incentivar a substituição de células-tronco danificadas para corrigir a perda de audição. Ainda, a matriz extracelular (ECM) pode desempenhar um papel fundamental na indução e manutenção da função das células de cabelo e não tem sido suficientemente estudada. Usando o coclear ECM como um andaime para cultivar células-tronco adultas pode fornecer insights exclusivos sobre como a composição e arquitetura do ambiente extracelular aids células em sustentar a função auditiva. Aqui nós apresentamos um método para isolar e decellularizing cochleae de ratos para usar como andaimes aceitando perfundidas células-tronco adultas. O protocolo atual, cochleae são isolados da eutanásia de ratos, decellularized e descalcificadas. Depois, células de geleia humana da Wharton (hWJCs) que foram isoladas a partir do cordão umbilical foram cuidadosamente pintadas em cada cóclea. Os cochleae foram usados como biorreatores, e as células foram cultivadas por 30 dias antes de sofrer a transformação para análise. Decellularized cochleae mantidos identificáveis estruturas extracelulares, mas não revelou a presença de células ou fragmentos visíveis de DNA. Células perfundidas na cóclea invadiram a maior parte do interior e exterior da cóclea e cresceram sem incidentes em uma duração de 30 dias. Assim, o método atual pode ser usado para estudar como coclear ECM afeta células desenvolvimento e comportamento.

Introduction

A cóclea é uma estrutura espiral intrincado encontrada no osso temporal. Ele é composto de um labirinto ósseo exterior e interior, concêntricos labirinto membranoso1. O labirinto membranoso é composto por três espaços fluidos: Scala vestibuli, Scala Scala tympani1e mídia. A mídia scala abriga o epitélio sensorial, que é composto de uma infinidade de tipos de células, mas as células sensoriais de cabelo (HC), que transduce energia mecânica em ondas sonoras para impulsos nervosos2, são de particular interesse. Exposição ao trauma acústico3,4,5, medicação6, doença7,8e envelhecimento9 tudo o que pode resultar em insuficiência auditiva através da morte HC. Perda de cabelo celular em mamíferos é permanente, ao contrário de HCs aviária, que podem se regenerar após lesão10.

Uma variedade de esforços de pesquisa contemporânea procuraram restaurar perdidos HCs, embora as abordagens experimentais específicas variam. Manipulação da expressão do gene no epitélio sensorial e implante de células-tronco diferenciadas fora do corpo são abordagens dominantes no campo, apesar de tem sido métodos de indução que buscam diferenciar as células-tronco em organoids coclear tentativa de11,12,13. Cada uma dessas abordagens é também dependente diretamente as células-tronco, ou as pistas do desenvolvimento, usadas por células-tronco; no entanto, um segundo compartilhados, e potencialmente crítico, o elemento é o ECM da cóclea em si14,15.

O ECM não só fornece suporte físico para as células e tecidos, que inclui uma superfície de adesão celular, sobrevivência, proliferação e migração, mas também tem um papel crítico no desenvolvimento de HCs e a espiral do gânglio15,16 ,17. Naturalmente ocorrendo ECM fornece sinais indutivos que podem orientar a determinação do fenótipo celular e/ou18, de adesão, proliferação e sobrevivência celular. Consequentemente, o uso da cóclea decellularized em combinação com hWJCs cultivadas oferecem uma oportunidade única de explorar o papel da regeneração ECM e HC. HWJCs são um tipo de célula prontamente disponível, sem controvérsias, isolado de humanos cordões umbilicais que se comportar como células-tronco mesenquimais19. HWJCs tem demonstrado a capacidade de diferenciar-se abaixo de20,de linhagens de célula marcante21. Assim, o atual protocolo detalha o isolamento, decellularization e perfusão de cochleae de carcaças de rato C57BL com hWJCs para engenharia de tecidos do ouvido interno.

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Protocol

Todos os procedimentos, incluindo a eutanásia de animais, foram conduzidos de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado (cálice #2014-2234) da Universidade de Kansas Medical Center (KUMC).

Nota: HWJCs foram isoladas de humanos cordões umbilicais que foram doados pelos pacientes que forneceram consentimento informado e as amostras foram utilizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de assuntos humanos da Universidade de Kansas (KU-IRB #15402).

1. osso Temporal colheita e isolamento da cóclea

  1. Decapitar um rato apropriadamente sacrificado, 15 semanas cortando entre o crânio e a primeira vértebra cervical com uma afiada tesoura cirúrgica e, em seguida, pulverizar a cabeça com etanol a 70% para desinfetar (figura 1A).
  2. Bissetriz do crânio em um médio sagital usando o mesmo par afiado de uma tesoura cirúrgica (figura 1B-C, linhas tracejadas).
  3. Remova o tecido cerebral do crânio utilizando um par de pinças (Figura 1, ponta de seta).
  4. Identifica o osso temporal através da presença do auditivo e o nervo vestibular raízes (Figura 1E-F, pontas de seta) no interior do crânio e do canal auditivo do exterior (Figura 1F, seta). Corte com cuidado através do crânio para isolar o osso temporal do resto do crânio (Figura 1).
    Nota: Em alguns casos, pode ser possível intrometer-se delicadamente os circundantes ossos do crânio longe do osso temporal sem a necessidade de corte.
  5. Insira a pinça bem a abertura do canal auditivo aproximadamente 5 mm (Figura 1 H), então as dicas não arrisque puncionando a cóclea. Suavemente quebrar o osso do bulla (Figura 1 H, top vermelha área sombreada) então ele fraturas (linhaFigura 1I, vermelha pontilhada).
    Nota: Se necessário, um microscópio de dissecação pode ajudar neste processo para garantir a colocação exata e manipulação de instrumentos.
  6. Usando a pinça fina, embora bisbilhotar o restante o bulla do osso temporal, expondo o labirinto ósseo da cóclea (Figura 1J, suportes de vermelhos).
  7. Coloque um prato de Petri grande o suficiente para segurar o osso temporal (por exemplo, 30 mm ou maior) por baixo da dissecação campo de visão do escopo e preenchê-lo com suficiente fosfato tamponado salino (PBS) para cobrir o osso temporal (por exemplo, 0,5 a 1 mL).
  8. Mergulhe no osso temporal com o bulla removido na PBS com as janelas ovais e redondas da cóclea virada para cima.
    Nota: A remoção do sistema vestibular da cóclea não é necessária, como o sistema vestibular serve bem como um identificador para a manipulação e orientando recursos da cóclea (Figura 1I e Figura 2B).
  9. Usando um par de microfuros de fórceps, remova a artéria estapédica, que atravessa o estribo.
  10. Inserir uma ponta da pinça ultra fina através do arco do estribo onde passou a artéria e delicadamente Levante o estribo para cima. O estribo desarticulado deve levantar fora a janela oval.
  11. Usando uma ponta da pinça ultra fina, fure o oval e redonda windows.
  12. Usar um 1X PBS preenchido 28,5 calibre seringa com tubo (diâmetro interno de 0,28 mm, diâmetro externo 0,61 mm) anexada, posicione o tubo sobre a janela oval (Figura 2A -B).
    Nota: A abertura do tubo pode ser manipulada usando fórceps ultra-fina, ajudando a garantir a colocação exata.
    1. Use uma seringa fresca e tubulação para cada cóclea.
  13. Perfundir 2ml de 10%-antibiótico antimicótico (anti-anti) e 10% penicilina-estreptomicina (pen-estreptococos) em PBS através da cóclea mais 5 min para remover a perilinfa. Perfusing muito rápido com muita pressão danificará as belas estruturas dentro da cóclea.
    Nota: Manualmente, dirigindo a seringa com a mão para perfundir o fluido através da cóclea é eficaz, embora uma bomba de perfusão pode ser usada como uma alternativa.
    1. Se perfusing manualmente, use um par de bem, fecho automático fórceps para estabilizar a cóclea (Figura 2A) durante a perfusão, agarrando-se a porção vestibular do osso temporal.
      Nota: Embora não seja obrigatório, isto deixa ambas as mãos livres para lidar com instrumentos; uma mão pode conduzir a seringa (Figura 2A), enquanto o outro pode posicionar o tubo adequadamente (Figura 2B).
    2. Desta etapa da frente, tome cuidado para evitar expor a cóclea desnecessariamente ao ar. Introdução de bolhas de ar nos espaços fluidos irá bloquear a circulação do fluido, e mais a secar irá danificar as belas estruturas dentro da cóclea.
  14. Remover e descartar qualquer restantes fragmentos de tecidos e ossos de músculo usando pinça fina.
  15. Se necessário, armazene cochleae isolado a 4 ° C em anti-anti 10% e 10% solução de caneta-estreptococos em PBS durante sete dias com mudanças regulares de solução antibiótica cada 48 h.

2. coclear processamento

  1. Decellularization
    1. Para cada cóclea, encha um frasco de cintilação de vidro de 20 mL com um 1% de sódio Dodecil sulfato solução (SDS) em água deionizada (DI), que é usada para decellularize a cóclea.
    2. Corte a ponta de uma pipeta de transferência de 7 mL plástico usando uma lâmina de barbear, de modo que a abertura é grande o suficiente para uma cóclea a passagem.
    3. Com a pipeta de transferência suavemente elaborar a cóclea na pipeta então só passa por alguns milímetros da borda de corte.
    4. Expulse da cóclea para o frasco de solução cintilação SDS 1%.
    5. Circule de 2 mL de SDS 1% em água desionizada de (DI) através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.
    6. Coloque o frasco de cintilação em rotacao e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente.
      1. Altere a solução de SDS 1% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar SDS para Nunca exponha a cóclea ao ar.
    7. Lave a cóclea três vezes por 30 min cada com água.
Executar as lavagens no frasco de cintilação mesma usado para as acusações de SDS; nesta fase, a cóclea é decellularized.
  • Descalcificação
    1. Remova a água restante do DI o frasco de cintilação, deixando apenas o suficiente para manter a cóclea submergida.
    2. Para começar a descalcificação, adicione 5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,02 M) a 10% em água para o frasco de cintilação que contém a cóclea.
    3. Circule de 2 mL de EDTA 10% em água DI através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.
    4. Coloque o frasco de cintilação no rotador e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente. Altere a solução de EDTA 10% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar soluções para que a cóclea não é exposta ao ar.
    5. Enxágue a cóclea 3 vezes durante 2 h com PBS 1x; nesta fase, a cóclea é descalcificada.
  • Armazenamento
    1. Armazenar os cochleae por até 72 h em uma solução 10% anti-anti, 10% caneta-estreptococos em PBS a 4 ° C.
      Nota: Os períodos de armazenamento podem ser possíveis com mudanças regulares de solução antibiótica; no entanto, armazenagem prolongada de cochleae transformados não foi validada neste protocolo.

    • 3. a colheita e a expansão de hWJCs

    1. Isole o hWJCs de acordo com protocolos previamente publicados22. Brevemente, segmento cordões umbilicais em seções de 3 cm.
    2. Com cuidado faça uma incisão superficial com um bisturi longitudinalmente em cada segmento de cordão umbilical para desenrolar e expor a geleia de Wharton, do cordão umbilical. Use a pinça para remover os vasos sanguíneos.
    3. Lave o cordão umbilical segmentos duas vezes com suficiente PBS (por exemplo, 40 mL em uma placa de Petri de 60 mm) para submergir o tecido. Picar finamente segmentos de tecido com um bisturi. Digerir o tecido em uma placa de Petri com 50 mL de meio de digestão de 100mm (colagenase tipo 2 de 0,2%, 1% penicilina-estreptomicina, em baixo-glicose médio (DMEM modificado águia de Dulbecco)).
    4. Coloque o tecido em digerir médio em um agitador orbital a 50 rpm durante a noite em um 5% CO2, incubadora 37 ° C. No dia seguinte, diluir meio digestão na proporção de 01:16 em 2% antibiótico antimicótico em PBS, pelota e células por centrifugação a 500 x g à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 10 min. Discard sobrenadante.
    5. Resuspenda pelotas em Mesenchymal Stem Cell crescimento médio (MSCGM) e recombinar as células. Células de placa em uma densidade de 7 x 103 células/cm2 em cultura de tecidos trataram frascos de T-75. Cultura HWJCs em MSCGM e expandir a passagem 5 para experimentos.
      Nota: HWJCs pode ser sub cultivadas em T-frascos maiores (p. ex., T-150, T-300) quando a passagem para aumentar o rendimento de hWJCs para experimentos.

    4. infusão de hWJCs em Decellularized Cochleae

    1. Preparar cochleae decellularized
      1. Utilizando técnica asséptica, lave cochleae armazenado em 1X PBS três vezes para 30 min cada.
      2. Transferir cochleae em separado poços de uma placa de 24 e adicionar 1 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM.
      3. Incube cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de célula de 37 ° C por um período mínimo de 1 h antes da infusão de células.
    2. Dissociar a hWJCs e ressuspender
      1. HWJCs de lavagem com 37 ° C pré aquecido 1X PBS duas vezes.
      2. Adicionar suficiente 37 ° C pré aquecido tripsina com 0,5% de EDTA para cobrir a superfície do vaso de célula.
      3. Incube a hWJCs para até 5 min em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C.
        1. Verifique-se que 90% das células ter retirado a superfície de cultura de células exibindo células sob um microscópio invertido.
          Nota: As células que se movem quando o navio de cultura suavemente é aproveitado, tem destacado. As células que permanecem estacionárias, não ter destacado.
        2. Bata levemente os lados do balão para desalojar mais células anexadas.
      4. HWJCs transferência do navio cultura para um tubo cônico de 50 mL, contendo uma quantidade equivalente de MSCGM para o volume de tripsina utilizando técnica asséptica, usado para dissociar as células.
      5. O hWJCs de pelotas por centrifugação a 500 x g, à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 5 min.
      6. Aspire o sobrenadante e ressuspender o hWJCs em MSCGM em uma concentração de 500.000 células/mL.
    3. Perfundir cochleae
      1. Transferência cochleae para uma nova placa de 24 usando uma pipeta de transferência.
      2. Adicione uma gota de MSCGM para cada cóclea para impedir qualquer cóclea desseque.
      3. Delicadamente, Oriente a cóclea usando fórceps ultra fino, de modo que as janelas ovais e redondas estão virada para cima.
        Nota: Tenha muito cuidado ao manusear diretamente cada cóclea cóclea é facilmente marcado.
      4. Utilizando uma seringa de insulina estéril de 28,5 mm com tubos conectados, elaborar 0,2 mL resuspended hWJCs (100.000 células).
      5. Usando a pinça bem esterilizada, posicione tubulação sobre a janela oval.
      6. Delicada e lentamente perfundir a cóclea com 0,2 mL de ressuspensão hWJCs utilizando uma seringa de insulina 28,5 mm conectada à tubulação de polietileno (diâmetro exterior: 0,61 mm, diâmetro interno: 0,28 mm) ao longo de cerca de 5 min.
      7. Após a perfusão, adicionar 0,8 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM para o bem que contém a cóclea para trazer o volume total no poço de 1 mL.
      8. Repita as etapas 4.3.3-4.3.7 para cada cóclea, utilizando uma seringa de fresca e tubos cada vez.
      9. Lugar perfundidos cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C e mudança mídia três vezes por semana.

    5. preservação e colheita de cóclea

    Nota: Cochleae podem ser cultivadas e colhidas em qualquer ponto do tempo de post-perfusão de até 30 dias.

    1. Para preservar os cochleae, corrigir em paraformaldeído 4% em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, em uma plataforma de balanço.
    2. Após a fixação, lave cochleae com PBS 1x, três vezes por 5 min cada.
    3. Gradualmente, desidratar a cóclea com etanol e limpar com um solvente Hidrocarboneto alifático antes de incorporação em parafina.
    4. Secção de amostras a uma espessura de 10 µm usando um micrótomo e montar em vidro corrediças do microscópio.
      Nota: As amostras agora estão prontas para histológica ou imuno-histoquímica de processamento usando protocolos padrão.

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    Representative Results

    Usando os métodos apresentados aqui, sucesso decellularization de cochleae foi avaliado examinando-se a presença ou ausência de DNA através de 4', coloração 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cochleae foram considerados totalmente decellularized, se o DNA não foi identificado dentro da cóclea decellularized. Uma cóclea nativa de uma experiência anterior que não passam por decellularization ou descalcificação foi usada como controle positivo para ilustrar as estruturas e células tradicionalmente encontradas em uma cóclea de rato C57BL. Decellularized-descalcificadas cóclea, que não tinha qualquer hWJCs infundido, foi usada como um controle negativo. Não quantificáveis DAPI manchado do núcleo de células foram observado em qualquer região da seção de tecido (Figura 3). Dois cochleae foram decellularized descalcificadas e então infundido com hWJCs para o projeto atual. Observou-se os cochleae decellularized-descalcificadas que foram pintadas com hWJCs ter numerosas DAPI manchado núcleos dentro da cóclea e crescendo no escudo ósseo fora da cóclea (tabela 1). Total estimado de densidades de célula para célula infundido cóclea primeira foram 113.759 células/cóclea após 30 dias da cultura (Figura 4 e Figura 5) e para a segunda cóclea foram 118.732 células/cóclea após 30 dias da cultura (Figura 6 e A Figura 7). Estas estimativas de densidade celular incluem a Scala tympani mídia Scala e Scala vestíbulo e volumes das estruturas encontradas nos três espaços fluidos, mas estas estimativas excluída qualquer do labirinto ósseo restante. Além disso, amostras de cada cóclea foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E) para mostrar a presença de células e características anatômicas dentro cada cóclea (Figura 8). A anatomia de microestruturas a coclear permaneceu predominantemente inalterada ao longo de todas as seções manchadas; no entanto, não há células eram identificáveis na seção decellularized-descalcificadas (Figura 8B). A identificação dos núcleos de células foi drasticamente diferente entre a cóclea nativa (Figura 8A) e o decellularized-descalcificadas cochleae infundido com células (Figura 8–D).

    Figure 1
    Figura 1: isolamento do osso temporal de rato. Uma vez que o mouse tem sido sacrificado, apropriadamente, decapitar o animal de corte entre a base do crânio e a primeira vértebra cervical e pulverize a cabeça com etanol para desinfectar o (A). Bissetriz do crânio em um plano sagital da seção (B–C) utilizando um par afiado de uma tesoura cirúrgica, cortando o tecido cerebral e o osso. A cabeça de rato bisseccionado (D, mandíbula inferior removida por trabalhos experimentais independentes) deve então ter o tecido cerebral removido para revelar o osso temporal. Os dois forames através do qual o passe de auditivo e nervos vestibulares (pontas de setaE, vermelho) são úteis sugestões para identificando com sucesso no osso temporal. Retire a carne do crânio (F). O canal do ouvido externo (F, seta, painel superior) fornece uma indicação útil e externa também. Apare cuidadosamente o osso em excesso, deixando apenas o isolado de ossos temporais (G). O bulla (H, painel superior, área em destaque vermelha) deve então ser delicadamente removido usando a pinça fina (H, painel inferior). O bulla é osso fino e pode ser prontamente lascado fora (eu) até o labirinto ósseo da cóclea é revelado (J, vermelho entre parênteses). Barras de escala em todas as imagens são 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 2
    Figura 2: perfusão coclear. Uma vez que o osso temporal foi isolado e o bulla foi removido, a cóclea então pode ser configurada para perfusão em um microscópio. Quando perfusing utilizando uma seringa conduzida manualmente com tubulação anexado (um, pontilhada de linha) pode ser útil estabilizar a cóclea usando um par de pinças de auto-fechamento. Delicadamente, anexar o fórceps para a vestibular parte do osso temporal (B) e descansar a pinça contra o bordo da placa de Petri (A). Isso deixa as duas mãos livres para manipular instrumentos durante a perfusão. Uma mão então pode manipular a seringa, controlando a taxa de fluxo do fluido, enquanto a outra mão pode posicionar o tubo sobre a janela oval, usando um segundo par de pinças (B). Cortar a extremidade livre do tubo em ângulo permite posicionamento mais fácil, permitindo que o tubo seja colocado corretamente sem bloquear o campo de visão. Barra de escala é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 3
    Figura 3: seção de tecido de uma cóclea de rato decellularized. Um microscópio vertical de epi-fluorescente foi usado para as amostras em uma ampliação de 200X (ocular de X 10 e 20 X objetivo) da imagem. Imagens foram costuradas juntos para criar uma montagem de aproximadamente 4 x 5. DAPI nuclear coloração mostrando ausência de células é mostrado no painel usando um conjunto de filtro comum DAPI (350 nm de excitação, emissão de 470 nm) e uma superexposta, imagem em tons de cinza da autofluorescência usando um filtro comum (FITC) de isotiocianato de fluoresceína conjunto (490 nm de excitação, emissão de 525 nm), que fornece pontos anatômicos, é mostrado no painel B. Contagem de células automatizadas foram realizadas em três regiões de interesse, que são delineadas em ambos os painéis A e B. Contagem de células totais foram calculadas para a seção de tecido inteiro (1, linha branca sólida) e a cóclea (2, linha tracejada). Esses dois números foram usados para calcular o número de células nas estruturas ósseas fora a cóclea, mas dentro das bordas exteriores, ósseas da seção de tecido (3, espaço entre a linha pontilhada e a linha tracejada). Barras de escala em todas as imagens são 500 µm.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 4
    Figura 4: uma seção modiolar perto da cóclea decellularized rato 1 infundido com hWJCs. DAPI coloração nuclear é mostrado no painel A sobrepostos em uma superexposta, autofluorescência de tons de cinza do canal verde, que fornece pontos anatômicos. Automatizado de célula contagens foram realizadas em três regiões de interesse, que são delineadas no painel A. Contagem de células totais foram calculadas para a seção de tecido inteiro (1, linha branca sólida) e a cóclea (2, linha tracejada). Esses dois números foram usados para calcular o número de células nas estruturas ósseas fora a cóclea, mas dentro das bordas exteriores, ósseas da seção de tecido (3, espaço entre a linha pontilhada e a linha tracejada). Coloração de DAPI isolado é mostrado no painel B, e o limiar do DAPI coloração usada durante a quantificação automatizada é mostrado no painel C. Barras de escala em todas as imagens são 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 5
    Figura 5: visualização de alta ampliação de uma seção de perto-modiolar da cóclea decellularized rato 1 infundido com hWJCs. DAPI coloração nuclear é mostrado no painel A sobreposta para uma imagem em tons de cinza superexposta, da autofluorescência do canal verde, que fornece pontos anatômicos. Coloração de DAPI isolado é mostrado no painel B, e a imagem de limite usada durante a contagem automatizada de células é mostrada no painel C. Os espaços fluidos e microestruturas mais finas alojadas dentro da cóclea são bem preservadas durante a decellularization e fases de cultura da experiência da pilha. Scala Vestibuli (SV), a Scala Tympani (SM), a membrana Basilar (BM), a Tectorial Membrane (TM), uma espiral Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), ligamento espiral (SL) e Vascularis do Stria (*). Membrana de Reissner não foi claramente definida nas secções de tecido, e como resultado o Scala Media não foi claramente definido. Barras de escala em todas as imagens são 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 6
    Figura 6: uma seção modiolar perto da cóclea decellularized rato 2 que foi infundida com hWJCs. DAPI coloração nuclear é mostrado no painel A, sobrepostos em autofluorescência de tons de cinza do canal verde, que fornece pontos anatômicos. Automatizado de célula contagens foram realizadas em três regiões de interesse, que são delineadas no painel A. Contagem de células totais foram calculadas para a seção de tecido inteiro (1, linha branca sólida) e a cóclea (2, linha tracejada). Esses dois números foram usados para calcular o número de células nas estruturas ósseas fora a cóclea, mas dentro das bordas exteriores, ósseas da seção de tecido (3, espaço entre a linha pontilhada e linhas tracejadas). Coloração de DAPI isolado é mostrado no painel B, e o limiar do DAPI coloração usada durante a quantificação automatizada é mostrado no painel C. Barras de escala em todas as imagens são 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 7
    Figura 7: visualização de alta ampliação de uma seção de perto-modiolar da cóclea decellularized rato 2 que foi infundida com hWJCs. DAPI coloração nuclear é mostrado no painel A, sobrepostos em autofluorescência de tons de cinza do canal verde, que fornece pontos anatômicos. Coloração de DAPI isolado é mostrado no painel B, e a imagem de limite usada durante a contagem automatizada de células é mostrada no painel C. Os espaços fluidos e microestruturas mais finas alojadas a coclear são preservadas durante as fases de cultura decellularization e célula do experimento. Scala Vestibuli (SV), a Scala Tympani (SM), a membrana Basilar (BM), a Tectorial Membrane (TM), uma espiral Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), ligamento espiral (SL) e Vascularis do Stria (*). Membrana de Reissner não foi claramente definida nas secções de tecido, e como resultado o Scala Media não foi claramente definido. Barras de escala em todas as imagens são 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 8
    Figura 8: coloração de hematoxilina e eosina de controle e tratados cochleae. Hematoxilina e eosina manchado seções exibindo uma cóclea típica com células nativas presentes é mostrado no painel A. Painel B contém as mesmas estruturas como painel A, mas é de uma cóclea totalmente decellularized, que deixa para trás a matriz extracelular. Os dois cochleae mostrada anteriormente, infundido com hWJCs é vistos em painéis C e D. A anatomia bruta coclear permanece predominantemente inalterada através do decellularization e processos de cultura celular, embora as populações de células específicas e locais são drasticamente alteradas. Scala Vestibuli (SV), a Scala Tympani (SM), a membrana Basilar (BM), a Tectorial Membrane (TM), uma espiral Limbus (L), Canal (RC) de Rosenthal, Modiolus (M), ligamento espiral (SL) e Stria Vascularis (*). Barras de escala em todas as imagens são 250 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    A1 Cóclea + células A2 Cóclea + células B2 negativo.
    Controle de cóclea Fora do labirinto ósseo 3.758 549 0 Espaços exteriores da cóclea de osso 248 586 0 Dentro da cóclea 518 701 0 Total de células 4.524 1.836 0 Volume da seção (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Por cento do Volume de cóclea 0,46% 0,59% 0,87% Estima-se densidade de células dentro da cóclea 113.759 118.732 0

    Tabela 1: contagens de células. DAPI manchado cocleares seções foram quantificados usando ferramentas de contagem automáticas no ImageJ em 3 não-sobreposição de regiões de interesse (fora do labirinto ósseo, osso temporal, fora dos espaços de fluido cocleares e dentro da cóclea) e thresholded. Área de seção transversal coclear também foi medida em ImageJ, e esse valor foi utilizado para calcular o volume da seção, em combinação com espessura de corte (10 µm). Usando uma estimativa do volume total de coclear publicado por Santi et al . calculou-se a 23, o volume de coclear relativo de uma determinada seção. A densidade de células da cóclea inteira foi estimada utilizando o volume coclear relativo de uma determinada seção em combinação com a contagem de células pareadas.

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    Discussion

    Temos com sucesso demonstrado que células cocleares nativas podem ser removidas da cóclea através de um processo de decellularization, que permite a utilização da cóclea como um andaime de tecido tridimensional, intrincado. Santi et al. 15 desenvolveu o método inicial para decellularizing cochleae e estimaram com precisão os volumes de muitas estruturas cocleares através com o auxílio de microscopia de luz folha23. Tal trabalho inicial serviu como uma base forte para a engenharia de tecidos e técnicas de cultura celular aqui apresentadas. Decellularized cóclea pode com sucesso ser infundida com células e em seguida cultivadas por um período prolongado de tempo. Cochleae de uma grande variedade de animais, teoricamente, poderia ser utilizados em combinação com da mesma forma ampla gama de tipos de células. Estas combinações permitem que as técnicas apresentadas aqui para ser utilizado em inúmeros projetos experimentais possíveis, tais como tecido, aplicações que examinar o epitélio sensorial desenvolvimento14, testes de novos agentes farmacêuticos de droga de engenharia 24, e desenvolvimento de reparação coclear modelos25. No entanto, apesar da ampla aplicabilidade destas técnicas não são sem limitações.

    Uma das limitações da técnica atual é que a perfusão é variável com base no indivíduo. Desenvolvimento de um suporte, para a cóclea e utilizando uma bomba de seringa para conduzir perfusions podem aumentar a precisão e o sucesso do processo. Além disso, provar definitivamente decellularization bem sucedido poderia potencialmente ser conseguido através de vários métodos. Utilizamos DAPI coloração que foi usado para quantificar o restante do núcleo de células, e observamos sem núcleos residual post-decellularization. Além disso, ensaios de quantificação de DNA padrão utilizam o reagente, detectando picograma quantidades de DNA, para identificar os restos de ácido nucleico, que podem ser visualmente mais sensíveis do que a DAPI para identificar a presença de pequenos fragmentos de ácidos nucleicos de corante verde ácidos em tecidos decellularized26. Independentemente do que as técnicas são usadas para validar o decellularization bem sucedida, não pode ser possível mostrar a completa decellularization de uma cóclea individual antes de utiliza-lo como um andaime. No entanto, encontramos o processo de decellularization para ser bem sucedido e robusto.

    As duas etapas mais críticas no protocolo atual são o isolamento e a manipulação dos cochleae e a perfusão dos cochleae. Grande deve ter cuidado quando a cóclea é inicialmente isolada, como a cóclea é delicado e frágil. Se muita força for aplicada durante a manipulação da cóclea com fórceps, pode fragmentar a cóclea. Assim, é imperativo para lidar com cada cóclea suavemente antes de decellularization e descalcificação. O sistema vestibular, se deixadas intactas, serve como um grande punho para agarrar o ouvido interno complexo com fórceps e orientando a cóclea. Da mesma forma, quando perfusing a cóclea com células, a pressão por trás da perfusão não deve ser demasiado grande, caso contrário, as células não podem sobreviver a perfusão. Como observado no actual protocolo, anexar tubos à extremidade de uma seringa de insulina 1 mL permite fácil manipulação da cóclea com uma mão e maior precisão em perfusing células através da cóclea com a outra mão.

    Como um próximo passo, que seria natural para avaliar marcadores funcionais e de desenvolvimento para determinar se o ECM coclear é induzir a diferenciação de células-tronco, e então, quais componentes específicos do ECM na cóclea estão induzindo alterações nas células. Perfusing diferentes tipos de células (por exemplo, as células-tronco, neuroprogenitors, fibroblastos, etc.) através da cóclea para diferenciação de célula de monitor e comportamento seria uma outra investigação fascinante. Além disso, as células que foram geneticamente modificadas ou estão expostas a um protocolo de diferenciação do fator de crescimento podem fornecer novos insights sobre como o ECM coclear suporta desenvolvimento marcante e possivelmente até mesmo função na audição. Assim, o protocolo atual é um primeiro passo significativo no usando o ECM coclear para estudar a orelha interna marcante desenvolvimento e manutenção, que um de pode dia levar ao desenvolvimento de novas terapias para restaurar a perda de audição.

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    Disclosures

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Acknowledgments

    O projeto atual foi financiado pela Universidade de Kansas prova de conceito de fundo. Gostaríamos de agradecer a equipe de enfermagem no KUMC (Kansas City, KS) para nos auxiliar na obtenção de humanos cordões umbilicais e David Jorgensen para ajudar com culturas cochleae.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

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    Bioengenharia questão 131,: Cóclea células de cabelo andaime decellularize células da geleia de Wharton engenharia de tecidos cultura de células
    Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno
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    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

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