多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞
Summary
勉強がん微小環境は免疫療法への臨床応答の予後や予測バイオ マーカーを識別できます。こちらに掲載しては革新的な手法に基づいてその場で蛍光スペクトルを分析し、様々 な集団を自動的に CD8 をカウント+ T 細胞。この再現性と信頼性の高い技術は、大規模コホート解析に適しています。
Abstract
免疫細胞は腫瘍微小環境の重要なコンポーネントであるし、発癌のすべての段階での腫瘍の成長と進化に影響を与えます。特に、それは今確立してひと腫瘍における免疫の浸潤が予後と治療への反応を関連付けることができます。腫瘍微小環境における免疫の浸潤の解析患者および治療に対する反応の分類の主要な課題となっています。
プログラム細胞死蛋白質 1 (PD1; として知られている CD279)、細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質の 4 (CTLA-4)、T 細胞免疫グロブリン、ムチンを含むタンパク質-3 (ティム 3; として知られている CD366)、リンパ球などの抑制性受容体の共発現アクティブ化の遺伝子 3 (ラグ 3; 別名 CD223) は、T 細胞の枯渇の特徴です。その場で多重蛍光染色、細胞レベルでこれらの抑制性受容体の共発現を定量化することを開発しました。腎細胞癌 (RCC) のフリーズされたティッシュのレトロスペクティブ シリーズでは、画像解析ソフトと相まって蛍光マルチ スペクトル イメージング技術を使用して、腫瘍浸潤 CD8 で PD 1 とティム-3 の共同式が見つかりました+ T 細胞RCC の予後と相関しています。我々 の知る限り、このを表します、この自動多重原・ テクノロジーを示す最初の研究いくつかの臨床的意義があります。
Introduction
過去数年間の免疫療法は、RCC を含む癌の多くの種類のための非常に有望な治療法として浮上しています。特に、免疫抑制のチェックポイントの阻害に基づく PD 1 のような臨床的に効果的な1,2,3,4,5,報告された ctla の条項 46。 モノクローナル抗体 CTLA-4、いくつかのがんでは既に承認されて PD-1、またはプログラム死配位子 1 (PD L1) と患者7の 20% 以上の長期的な臨床反応をもたらします。それにもかかわらず、ないすべての患者が反応、治療費が高い、これらの治療法は、有毒である、潜在的な深刻な自己免疫性のような副作用に 。したがって、現在の課題は、これらの新しい免疫療法を予測するマーカーを識別するためにです。臨床応答と相関する腫瘍、PD L1 の式または+ T 細胞浸潤 cd8 陽性腫瘍のレベルでの突然変異率を報告されています。しかし、この協会は非小細胞肺癌 (NSCLC) 癌患者8 で Pembrolizumab の管理の前に PD L1 の仲間のテストを除いて臨床実習では臨床マーカーの使用をお勧めしますには弱すぎます。、9,1011,12。PD 1、ティム-3、ラグ-3 のように多くの抑制性受容体の共発現し、CTLA-4 誘導細胞枯渇表現療法13,14,15への抵抗、それは実証されています。末梢血は、腫瘍微小環境の代表ではない、原細胞の表現型の機能の分析に関心の高いのです。PD 1 とティム 3 の共同表現する T 細胞が、いくつかのコンテキスト13,16,17機能的障害の細胞として知られています。この研究で 2 つの抑制性受容体 PD 1 の共発現と CD8 のティム-3 の予後への影響+ T 細胞が評価されました。
腫瘍浸潤リンパ球 (TILs) で複数のマーカーの共発現を勉強して、今までは主に流れフローサイトメトリー解析、新鮮な腫瘍とそのため除外解析上で動作する必要があるサービスによって実行されました。従来その場で染色、一度に 1 つだけの染色を実行できますと共同マーカーを表現するセル型の評価は不可能します。たとえば、PD L1 は、PD L1 を発現する細胞相関研究より関連している従来の免疫組織学的解析による定義を難しく腫瘍微小環境の多くの細胞のタイプによって表されます。今回、我々 は腫瘍浸潤 CD8 PD 1 とティム-3 の共発現を関連付けるコンピューター カウントで革新的なその場で多重蛍光方法を開発+ RCC の臨床結果と T 細胞。このテクニックに制限された間隔をキャプチャすることができますマルチ スペクトル カメラを用いた同時に単一セルのレベルで複数のマーカーを分析する可能性を含むいくつかの利点は、> 10 nm ~ 液晶フィルター18。さらに、プロシージャは自動オペレーター間の再現性とマニュアルのテクニック19に比べて短縮分析ができます。がん分野でいくつかの研究報告、メルケル細胞癌、肺癌、頭頸部癌20,21,22, PD 1、PD L1、cd8 陽性など免疫の分子の複数の染色を説得23. 自動細胞数はユーザー (表現型解析ステップ) による訓練で可能です。蛍光は、別の細胞コンパートメント (核、細胞質と膜) で測定されます。
ここでは、腫瘍浸潤 CD8 の異なるサブセット+ T 細胞表現する PD 1 および/または RCC の大規模コホートでティム 3 は数えられ結果が臨床重力得点と生存率パラメーターと相関しました。また、フローサイトメトリーのような蛍光強度の意味 (MFI) データと携帯電話の解像度で膜の蛍光強度を分析することが可能だった。我々 の知る限り、これは最初の研究レポート予後結果に基づいてカウントするマルチ スペクトル イメージングの技術を使用して表します。
Protocol
Representative Results
Discussion
変更とトラブルシューティング:
組織の品質は重要なパラメーターです。ヘマトキシリンとエオシンの着色によって簡単にチェックできます。
技術の利点の 1 つは多重染色の可能性が、fluorophore の波及を避けるためには、発振波長 10 nm 以上のデルタを選択することお勧めします。ここでは、4 染色 DAPI を含むので、我々 は波長を広げて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Institut 国立デュがん (インカ) (ET)、リーグ contre le がん (ET)、大学ソルボンヌ大学パリ ・ シテ (ET)、ANR (Selectimmunco) (ET)、Labex 免疫腫瘍 (ET)、SIRIC CARPEM (CG, ET) からの助成金によって支えられました。EdG 財団アークの交わりによって資金を供給されました。EV と CD APHP (bourse 極東凝った) の団体によって資金を供給されました。ChB 大学ソルボンヌ大学パリ シテ (契博士) の交わりによって資金を供給します。著者は、このプロジェクトの資金調達のためのブリストル マイヤーズ スクイブをありがとうございます。著者は、病理学の病院位置ジョルジュポンピドーとネッカー (Laurianne シャンボール、エロディ ミシェルとジゼル Legall) の部門をありがとうございます。著者は、PARCC 病院位置ジョルジュ ・ ポンピドゥー (コリーヌ クリスチアーネ) の組織のプラットフォームをありがとうございます。
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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