לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.
תאים חיסוניים להשפיע על צמיחת הגידול וההתפתחות בכל שלבי carcinogenesis הינם מרכיבים חשובים של microenvironment הגידול. ראוי לציין, היא עכשיו מבוססת היטב כי לחדור מערכת החיסון האנושית גידולים יכולים לתאם עם הפרוגנוזה והתגובה לטיפול. הניתוח של לחדור המערכת החיסונית ב microenvironment הגידול הפך לאתגר מרכזי עבור הסיווג של המטופלים ואת התגובה לטיפול.
הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים כגון תוכנית לתא המוות חלבון 1 (PD1; ידוע גם בשם CD279), ציטוטוקסיות לימפוציטים-T הקשורים חלבון 4 (CTLA-4), T-Cell בנוגדנים ו Mucin המכיל חלבון-3 (טים-3; ידוע גם בשם CD366) ו לימפוציטים הפעלת גנים 3 (לג-3; ידוע גם בשם CD223), מהווה סימן היכר של תא T תשישות. פיתחנו immunofluorescence של multiparametric בחיי עיר מכתים כדי לזהות ולכמת ברמה התאית הביטוי שיתוף של רצפטורים אלו מעכבות. על סדרה רטרוספקטיבית של רקמות קפוא של תאי הכליה קרצינומה (RCC), תוך שימוש בטכנולוגיה הדמיה מולטי ספקטריאליות קרינה פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח תמונה התוכנה, זה נמצא את הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על הגידול שחדר CD8+ T תאים הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה אצל RCC. לידע שלנו, המייצג את המחקר הראשון הוכחת כי זה אוטומטית מולטיפלקס באתרו בתוך טכנולוגיה שיש כמה הרלוונטיות הקלינית.
בשנים האחרונות, התפתחה חיסוני לטיפול בסוגים רבים של סרטן, כולל RCC מבטיח מאוד. במיוחד, חיסוני בהתבסס על עיכוב של מחסומים מעכבות כמו PD-1, CTLA-4 דווחה יהיה יעיל קלינית1,2,3,4,5, 6. נוגדנים חד-שבטיים כנגד CTLA-4, PD-1, או תוכנית מוות ליגנד 1 (PD-L1) כבר אושרו ב סרטן מספר ולהוביל לתגובות הקליניות לאורך זמן יותר מ 20% של חולים7. למרות זאת, לא כל המטופלים המגיבים, העלות של הטיפול היא גבוהה, טיפולים אלה הם רעילים, המוביל אל תופעות לוואי כמו מחלה אוטו-אימונית רציני. לכן, האתגר הנוכחי הוא לזהות סמנים חזוי כדי immunotherapies החדשים האלה. קצב מוטציות הגידול, הביטוי של PD-L1 או רמות intratumoral CD8+ תא T הסתננות דווחו לתאם עם תגובה קלינית. עם זאת, עמותה זו היא עדיין חלשה מכדי ממליצים על השימוש אלה סמנים קליניים הקלינית חוץ המבחן לוויה עבור PD-L1 לפני הנהלת Pembrolizumab תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC) חולים8 ,9,–10–11,–12. זה הוכח כי הביטוי שיתוף של רצפטורים מעכבים רבים כמו PD-1, טים-3, לג-3 ומשרה CTLA-4, של פנוטיפ תשישות תא והתנגדות טיפול13,14,15. מאז דם היקפיים אינה מייצגת microenvironment גידול, זה עניין גבוהה כדי לנתח את התכונות פנוטיפי של תאים בתוך באתרו. PD-1 וטים-3 תאים T משותפת לביטוי ידועים להיות תאים פונקציונלית לקוי מספר הקשרים13,16,17. מחקר זה, ההשפעה prognostic של ביטוי משותף של קולטני מעכבות שני PD-1 ו- 3 טים-CD8+ T תאים הוערך.
עד עכשיו, לומד את הביטוי משותף של מספר סמני הגידול שחדר לימפוציטים (הפדגוגי) בוצעה בעיקר על-ידי ניתוח cytometry זרימה, ולכן יש צורך לעבוד על גידולים טריים וניתוחים רטרוספקטיבי ולכן מסלק. עם קונבנציונאלי בחיי עיר מכתים, צביעת אחד בלבד בכל פעם יכול להתבצע, אפיון סוג התא שותף שיבטא את סמני אינה אפשרית. לדוגמה, PD-L1 מבוטא על ידי סוגי תאים רבים microenvironment tumoral, ולכן קשה להגדיר על-ידי ניתוח קונבנציונלי אימונוהיסטוכימיה התאים לבטא PD-L1 הם רלוונטיים יותר ללימודי correlative. בעבודה זאת, פיתחנו שיטה multiparametric immunofluorescence חדשנית בחיי עיר עם ספירת המחשב לתאם הביטוי שיתוף של PD-1 וטים-3 על ידי גידול שחדר CD8+ תאי-T עם התוצאות הקליניות של RCC. טכניקה זו היא בעלת מספר יתרונות, כולל את האפשרות לנתח ברמה של תא בודד, מספר סמני במקביל באמצעות מצלמה מולטי ספקטריאליות אשר יכול ללכוד במרווחי זמן מוגבל > 10 ננומטר דרך גביש נוזלי מסנן18. יתר על כן, התהליך הוא אוטומטי אשר מאפשר הפארמצבטית בין המפעיל של ניתוח מקוצרת לעומת טכניקות ידניות19. מספר מחקרים בתחום הסרטן, דיווח משכנע stainings מרובים של מולקולות מערכת החיסון כמו PD-1, PD-L1 ו CD8-מרקל קרצינומה, סרטן ריאות, ואת הראש והצוואר סרטן20,21,22, 23. ספירת אוטומטיות אפשרי עם הכשרה על-ידי המשתמש (שלב phenotyping). ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד על תאים תאים שונים (גרעינים ציטופלזמה, ממברנה).
הנה, קבוצות משנה שונים של גידולים הסתננות CD8+ T תאים לביטוי PD-1 ו/או טים-3 במדגם גדול של RCC נספרו, התוצאות היו בקורלציה עם ציונים הכבידה קליניים ופרמטרים הישרדות. גם ניתן היה לנתח ממברנה עוצמת קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה הסלולר עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) נתונים כמו cytometry. עד כמה שידוע לנו, זה מייצג הראשון דיווח prognostic תוצאות המחקר בעזרת טכניקה המבוססת על ספירת הדמיה מולטי ספקטריאליות זו.
שינויים, פתרון בעיות:
איכות רקמת הוא פרמטר חשוב; זה יכול בקלות להיבדק על ידי הגיוון hematoxylin ואאוזין.
אחד היתרונות של השיטה היא האפשרות של stainings מרובבת, אך כדי למנוע fluorophore והתאמת, מומלץ לבחור אורכי גל פליטה עם דלתא של מינימום 10 ננומטר. כאן, כי היינו stainings 4…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוט הארצי du לסרטן (האינקה) (ET), ליגה חדר מרווח וחדיש le סרטן (ET), אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex חיסונית-אונקולוגיה (ET), CARPEM SIRIC (CG, ואח ‘). הקצוות עם הגבלת זמן מומן על ידי מלגת ד’ארק Fondation. EV ו- CD, במימון של אחוות APHP (bourse באסכולה הסוציולוגית רשרש). ChB ממומן על ידי מלגת של אוניברסיטת סורבון פריז סיטה (contrat דוקטורט). המחברים מודים בריסטול מאיירס סקוויב על המימון בפרויקט זה. המחברים תודה המחלקה לפתולוגיה של חולים Européen פומפידו, נקר (Laurianne Chambolle, מישל אלודי, Gisèle Legall). המחברים תודה פלטפורמת היסטולוגיה של PARCC, חולים Européen פומפידו (קורין Lesaffre).
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |