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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells

Published: February 8, 2018 doi: 10.3791/56606
Automatic Translation
1, 2,3,4, 2,3, 2,3, 2,3,5, 6, 7, 2, 2, 2, 2,3,6, 8, 2,3, 4, 2,6, *4, *2,4
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou
* These authors contributed equally

Summary

Étudier le microenvironnement tumoral peut identifier des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs de la réponse clinique à l’immunothérapie. Présentée ici, une méthode innovatrice repose sur in situ par fluorescence multispectrale d’imagerie permettant d’analyser et de compter automatiquement différentes sous-populations de CD8+ T des cellules. Cette technique fiable et reproductible est adaptée pour les analyses de cohorte importante.

Abstract

Les cellules immunitaires sont des composantes importantes du microenvironnement tumoral et influer sur la croissance tumorale et l’évolution à toutes les étapes de la cancérogenèse. Notamment, il est maintenant bien établi que le système immunitaire infiltrent dans les tumeurs humaines peut corréler avec le pronostic et la réponse au traitement. L’analyse de l’infiltrat immunitaire dans le microenvironnement tumoral est devenu un enjeu majeur pour la classification des patients et la réponse au traitement.

La co-expression de récepteurs inhibiteurs tels que le programme Cell Death Protein 1 (PD1 ; également connu sous le nom CD279), Lymphocyte T cytotoxique associé protéines 4 (CTLA-4), lymphocytes immunoglobuline et mucine contenant des protéines-3 (Tim-3 ; également connu sous le nom CD366) lymphocytaire Activation de gènes 3 (gal-3, aussi connu sous le nom CD223), est une caractéristique de l’épuisement de lymphocytes T. Nous avons développé une immunofluorescence multiparamétriques in situ afin d’identifier et de quantifier au niveau cellulaire la co-expression de ces récepteurs inhibiteurs de coloration. Sur une série rétrospective de tissus congelés de carcinomes des cellules rénales (CCR), à l’aide d’une technologie d’imagerie multispectrale fluorescence couplée avec une analyse d’images, il a été constaté que la co-expression de PD-1 et Tim-3 sur tumeur infiltrant CD8+ T des cellules est corrélée à un mauvais pronostic dans la RCC. À notre connaissance, cela représente la première étude démontrant que cela automatisé technologie multiplex in situ peut avoir une certaine pertinence clinique.

Introduction

Dans quelques années, l’immunothérapie est devenue un traitement très prometteur pour de nombreux types de cancers, dont le RCC. En particulier, immunothérapie, basée sur l’inhibition des points de contrôle inhibiteurs comme PD-1 et CTLA-4 a été signalé à être cliniquement efficace1,2,3,4,5, 6. anticorps monoclonaux contre CTLA-4, PD-1, ou programme mort Ligand 1 (PD-L1) ont déjà été approuvés dans plusieurs types de cancers et conduire à des réponses cliniques durables dans plus de 20 % des patients7. Néanmoins, pas tous les patients sont les intervenants, le coût du traitement est élevé, et ces traitements sont toxiques, conduisant à des potentiels graves effets secondaires de type auto-immune. Par conséquent, le défi actuel est d’identifier des marqueurs prédictifs de ces nouvelles immunothérapies. Le taux de mutations dans la tumeur, l’expression de PD-L1 ou les niveaux d’intratumorale CD8+ infiltration de lymphocytes T ont été signalés en corrélation avec la réponse clinique. Cependant, cette association est encore trop faible pour recommander l’utilisation de ces biomarqueurs cliniques en pratique clinique, à l’exception de l’essai de compagnon pour PD-L1 avant l’administration de la Pembrolizumab en non-small cell lung cancer (NSCLC) patients8 ,9,1011,12. Il a été démontré que la co-expression de nombreux récepteurs inhibiteurs comme PD-1, Tim-3, 3-Lag, et CTLA-4, induit un phénotype épuisement cellulaire et la résistance à la thérapie13,14,15. Puisque le sang périphérique n’est pas représentatif du microenvironnement tumoral, c’est d’un grand intérêt à analyser les caractéristiques phénotypiques de la cellules in situ. PD-1 et Tim-3 cellules T exprimant conjointement sont connus pour être des cellules fonctionnellement altérées dans plusieurs contextes13,16,17. Dans cette étude, l’impact pronostique de la co-expression des deux récepteurs inhibiteurs PD-1 et Tim-3 sur CD8+ T des cellules a été évaluée.

Jusqu'à présent, étudier la co-expression de multiples marqueurs sur tumeur infiltrant les lymphocytes (TILs) a principalement été réalisée par analyse en cytométrie en flux, rend nécessaire de travailler sur les tumeurs fraîches et donc excluant des analyses rétrospectives. Traditionnels in situ de coloration, coloration seule à la fois peut être effectuée, et la caractérisation du type qui a exprime les marqueurs n’est pas possible. Par exemple, PD-L1 est exprimée par de nombreux types de cellules du microenvironnement tumoral, rendant difficile de définir par immunohistochimie conventionnelle analyse quelles cellules exprimant PD-L1 sont les plus pertinents pour les études de corrélation. Dans ce travail, nous avons développé une méthode d’immunofluorescence multiparamétriques innovatrice in situ avec comptage informatique pour mettre en corrélation la co-expression de PD-1 et Tim-3 par tumeur infiltrant CD8+ T-cellules, avec des résultats cliniques dans la RCC. Cette technique présente plusieurs avantages, y compris la possibilité d’analyser au niveau unicellulaire et marqueurs multiples en même temps à l’aide d’une caméra multispectrale qui peut capturer des intervalles limités > 10 nm à travers des cristaux liquides filtres18. En outre, la procédure est automatique ce qui permet une reproductibilité entre opérateurs et une analyse raccourcie par rapport aux techniques manuelles19. Dans le domaine du cancer, plusieurs études ont rapporté convaincre plusieurs salissures des molécules immunitaires comme PD-1, PD-L1 et CD8 dans la cellule de Merkel carcinome, cancer du poumon et tête et du cou du cancer20,21,22, 23. le nombre d’éléments automatisés est possible avec une formation par l’utilisateur (étape de la détermination du phénotype). La fluorescence est mesurée dans les compartiments cellulaires (membrane, cytoplasme et noyaux).

Ici, les différents sous-ensembles d’infiltration tumorale de CD8+ T des cellules exprimant PD-1 et/ou Tim-3 dans une grande cohorte de RCC étaient comptés et les résultats ont été corrélés avec des scores de gravité clinique et les paramètres de survie. Il était également possible d’analyser l’intensité de fluorescence membranaire à la résolution cellulaire avec des données de Fluorescence de moyenne intensité (MFI) comme en cytométrie en flux. Pour autant que nous le savons, cela représente les première déclaration pronostique résultats de l’étude à l’aide de cette technique de comptage des fonction d’imagerie multispectrale.

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Protocol

Cette étude a été réalisée conformément à la déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le Comité d’éthique local (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consentement éclairé a été obtenu par le participant dans les cohortes.

1. tissu matériel

  1. Recueillir des échantillons de tissus RCC le jour de la chirurgie. Gérer le spécimen chirurgical à température ambiante (département de pathologie).
  2. Prélever un échantillon de la tumeur d’environ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taille dans un tube sec. Composant logiciel enfichable congélation dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.
  3. Enrober les échantillons dans la température de coupe optimale composée. Section des échantillons avec un cryostat à-20 ° C en coupes épaisses de 4-6 µm. Laisser les échantillons d’air sec sur les diapositives pour 12 h et de les stocker directement à-80 ° C pour éviter la dessiccation.
  4. Vérifier la qualité de l’échantillon en affichant un hématoxyline et éosine teinté de section.

2. in Situ Immunofluorescence souillant de TILs

  1. Lignes directrices procédurales
    1. Exécutez toutes les étapes expérimentales à la température ambiante.
    2. Pour toutes démarches, effectuer des dilutions avec Tris tampon salin (SCT, voir Table des matières).
    3. Effectuer le lavage au SCT pour toutes les étapes sauf après l’incubation de l’anticorps primaire. Pour ces derniers, utilisez Tween20 Saline de tampon Tris (TBST, voir Table des matières). Pour la composition du tampon et reconstitution Voir le tableau1 supplémentaire.
    4. Utiliser une chambre humide pour les incubations d’anticorps et un pot de coloration pour le lavage.
    5. Ne laissez pas la section sécher au cours de la procédure.
  2. Prétraitement
    1. Décongeler la diapositive contenant l’échantillon de tissu et sécher soigneusement la lame autour de l’échantillon avec une serviette en papier. Délimiter la zone de réaction contenant le tissu avec un stylo de barrière hydrophobe (voir Table des matières). Sécher pendant 2 min.
    2. Fixer les échantillons dans l’acétone à 100 % pendant 5 min, sec pendant 2 min et laver avec le SCT pendant 10 min.
  3. Saturation et blocage
    1. Prétraitez les diapositives pendant 10 min avec 3 gouttes d’avidine 0,1 %, robinet et/ou flick la diapositive pour distribuer l’avidine et enlever les bulles d’air et ensuite traiter pendant 10 min avec 3 gouttes de biotine 0,01 % (voir Table des matières), tap, et/ou feuilleter. Laver avec les directives du SCT.
    2. Effectuer un blocus de récepteurs Fc. Déposer 100 µL d’un volume/volume de 5 % de sérum normal dilué dans du sérum de directives du SCT. utilisation de la même espèce d’hôte que l’anticorps secondaire ou tertiaire (voir Table des matières) ; ici, sérum de l’âne a été utilisé. Incuber pendant 30 minutes.
    3. Pendant l’incubation, brièvement tourner l’anti-CD8, PD-1 et des anticorps de Tim-3 (Table des matières). Préparer le mélange des anticorps primaires au SCT comme décrit dans la Table 2.
  4. Immunomarquage pour CD8, PD-1 et Tim-3
    1. Préparer le mélange de l’anticorps primaire. Reportez-vous à la Table des matières et la Table 2 pour les anticorps utilisés (anti-CD8, PD-1, Tim-3 et leurs anticorps secondaires correspondants) et leurs concentrations.
    2. TAP et/ou feuilleter le sérum âne restants (ajouté à l’étape 2.3.2). Incuber les lames avec 100 µL du mélange des anticorps primaires non marqué pendant 1 h dans une chambre humidifiée.
    3. Pendant l’incubation, brièvement tourner la Cyanine 5 anti-lapin AF488-anti-chèvre et anticorps anti-souris biotinylés et préparer le mélange des anticorps secondaires tel que décrit dans la Table 2.
    4. Laver les lames dans un mélange TBST pendant 5 min sec les diapositives.
    5. Incuber les lames avec 100 µL de l’anticorps secondaires pendant 30 min dans une chambre humidifiée.
    6. Préparer le mélange d’anticorps supérieur contenant streptavidine-Cy3 tel que décrit dans la Table 2.
    7. Laver les lames au SCT pour min. 10 sec les diapositives.
    8. Incuber les lames avec 100 µL du mélange anticorps tertiaire pendant 30 min.
    9. Laver les lames au SCT pour min. 10 sec les diapositives.
  5. Montage de la cellule
    1. Monter les lames dans un 4', 6-Diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate DAPI-contenant (1,5 µg/mL DAPI) le milieu avec un lamelle couvre-objet compatible pour la microscopie de fluorescence de montage (voir la Table des matières).
      Remarque : Comme contrôle négatif pour chaque expérience, une diapositive avec anticorps appariés selon l’isotype servait à la même concentration que les anticorps correspondants. Pour cette coloration, nous avons utilisé des souris IgG1 et lapin IgG anticorps de chèvre IgG contrôle négatif (voir Table des matières). Comme témoin positif, nous avons utilisé des amygdales hyperplasique humain qui sont appelé à être positifs pour les marqueurs testés, pour chaque expérience. Une coloration typique est décrite dans les résultats (Figure 1). Mono-coloration des CD8, PD-1 et Tim-3 doivent être réalisées individuellement (une coloration par lame) avec le même traitement préalable et sans DAPI. Une diapositive dans les mêmes conditions expérimentales sans anticorps et seulement le milieu de montage DAPI doit également être effectuée. Une diapositive doit être photographiée en utilisant des conditions expérimentales identiques sans n’importe quel anticorps ni DAPI.

3. fluorescence analyse et numération automatisée

  1. Acquisition d’images avec le microscope automatisé
    1. Création d’un protocole.
      1. Ouvrir le logiciel automatisé microscope et l’illuminateur de fluorescence.
      2. Dans la barre de menus, cliquez sur « Fichier », « créer le protocole, » sélectionnez « DAPI, » « FITC » et « TRITC. »
      3. Cliquez sur « Next », « Section de tissus » et cliquez sur « Suivant, » « Nom du protocole ». Choisir un clic de nom, par exemple, « CD8-PD-1-Tim-3, », « Next » et « enregistrer ».
      4. Manuellement, placez une lame sur la scène.
      5. Dans la barre de menus, cliquez sur « Configuration", » « paramètres ». Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur « set maison Z ».
      6. Ajuster la durée d’exposition avec un contrôle positif glisser c'est-à-dire un CD8, PD-1 et Tim-3 triple teint avec échantillon DAPI.
      7. Dans la barre de contrôle, cliquez sur « régler l’exposition. »
      8. Ajuster la durée d’exposition pour chaque filtre jusqu'à l’obtention d’un signal suffisant mais non saturante.
      9. Pour l’imagerie monochrome, procédez comme suit :
      10. Sélectionnez acquisition, puis sous « autofocus » filtre DAPI.
      11. Dans la « limite de zone de scan », déplacer l’objectif supérieur vers le coin supérieur gauche de la diapositive. Cliquez sur « Marque ». Faites de même pour le coin inférieur droit.
        Remarque : Cette étape delimitates la zone de faible puissance d’imagerie (imagerie LP) à 4 X ; n’oubliez pas de placer la marque et si quant à entourer tous les échantillons de la série.
      12. Pour haute puissance (HP) imaging, procédez comme suit :
      13. Sous « Autofocus », choisissez « DAPI ».
      14. Sous bande de « Acquisition », choisissez « DAPI », « FITC », « Cy3 » et « Cy5 ». Cliquez sur « OK ». Dans la barre de menu cliquez sur « Fichier », « enregistrer le protocole ».
    2. Numérisez les diapositives.
      1. Charger le protocole en cliquant sur « Fichier », « charger le protocole » dans la barre de menus. Cliquez sur « Démarrer ».
      2. Entrez « ID Lab » (emplacement de dossier pour le stockage de l’image). Entrez l’ID de diapositive pour identifier la diapositive. Cliquez sur « Suivant ».
      3. Cliquez sur « Monochrome Imaging » (pour balayer la diapositive entière sous la lumière du champ lumineux et d’acquérir des images séquentielles à l’aide d’un objectif 4 x).
        Remarque : Il produit une vue d’ensemble de niveaux de gris de la diapositive.
      4. Cliquez sur « Trouver ». Sélectionnez la zone de tissu à analyser à basse résolution (x 4) : maintenez enfoncée la touche « Ctrl » et cliquez sur un champ en utilisant le curseur pour sélectionner ou désélectionner les champs (Figure 2 a).
      5. Pour l’acquisition d’images rouge vert bleu fluorescente de chaque champ, cliquez sur « LP imagerie » (4 x imagerie).
      6. Pour la sélection de HP de champ, maintenez la touche « Ctrl » enfoncée et cliquez sur un champ en utilisant le curseur pour sélectionner ou désélectionner les champs qui correspondent à la zone des tissus qui seront numérisés à haute résolution (x 20). Sélectionnez 5 champs (Figure 2 b).
      7. Cliquez sur « HP Imaging » (20 x imagerie) pour une acquisition d’images multispectrales de chaque champ (Figure 2).
      8. Cliquez sur « Mémoire » pour stocker les images dans le dossier qui a été sélectionné au début en laaroussi.
        Remarque : Le processus est résumé et illustré à la Figure 2. Pour chaque étape (détection de tissu, sélection de champ), un algorithme peut être incrémenté et formé par l’utilisateur pour un processus de balayage automatisé ensemble.
  2. Analyse d’images de fluorescence et cellules automatisés avec logiciel d’analyse accouplée
    1. Construire la bibliothèque spectrale.
      1. Ouvrez le logiciel d’analyse de l’image.
      2. Dans le volet gauche, ouvrez « Construire des bibliothèques ». Sous « load image », cliquez sur « Parcourir » et sélectionnez une image teinté mono (p. ex., CD8/Cyanine 5).
      3. Sélectionnez le fluorophore, (p. ex., Cyanine 5). Cliquez sur « extraire ». Cliquez sur « Enregistrer » pour stocker dans la bibliothèque. Cliquez sur « Enregistrer ».
      4. Répétez le même processus pour PD-1, Tim-3 et lames DAPI mono afin d’intégrer le spectre de chaque molécule d’intérêt.
        NOTE : La bibliothèque spectrale de construction intègre le spectre pour chaque fluorophore utilisé pour les tissus spécifiques (ici, rein), mais « synthétiques » bibliothèques déjà existants peuvent être utilisés. Comme le spectre de l’autofluorescence est strictement par rapport au tissu, il est important d’effectuer une auto-fluorescence et bibliothèque spectrale par projet.
    2. Créez un nouveau projet.
      1. Dans la barre de menu, cliquez sur « Fichier », « Nouveau projet ». Dans l’onglet « Fonction Rechercher », sélectionnez « segmentation cellulaire ». Dans l’onglet « Phénotypage », sélectionnez « phénotypage ». Cliquez sur « Créer ».
      2. Intégrer les images représentatives dans le projet.
        1. Dans l’onglet « Fichier », cliquez sur « Ouvrir l’image ». Le choix de 10 à 30 images représentatives de toute la série. Ajouter la diapositive non teinté pour supprimer l’autofluorescence. Sur le panneau de droite : source de la bibliothèque select. Sélectionnez un fluorophore et choisir ceux qui correspondent à la bibliothèque spectrale déjà construite.
      3. Pour enlever le tissu autofluorescence, cliquez sur le bouton « AF » et puis sélectionnez la zone d’autofluorescence dans la diapositive vide.
      4. Traitement d’images et production d’image composite.
        1. Cliquez sur « Préparer ensemble » pour intégrer la bibliothèque de fluorescence et les spectres de l’autofluorescence pour générer l’image composite (Figure 3). Cliquez sur l’icône « œil » pour ouvrir le panneau « éditeur de vue » et sélectionner les données affichées : sélectionnez les marqueurs CD8, PD-1, Tim-3 et DAPI. Supprimer l’autofluorescence. Suivez les étapes présentées par le logiciel.
      5. Segmenter les cellules.
        1. Pour segmenter les cellules, dans le « Compartiment », sélectionnez « Noyaux » et « Membrane ». Dans l’onglet « Noyaux », figurant le contre-colorant nucléaire DAPI.
        2. Dans l’onglet « Maximum et Minimum taille (px) » Entrez « 40 » et « 176 » comme les tailles minimales et maximales, respectivement. Pour le signal « Minimum », définir « 0,13 ». Dans l’onglet « Split », définir « 2,60 ». Dans l’onglet « Noyaux », définir « 0.81 ». Sélectionnez « utiliser le signal de la membrane à l’aide de segmentation ».
        3. Cliquez sur le « Segment de cellules » dans la partie inférieure de l’écran. Vérifiez la segmentation des noyaux et des membranes des cellules et réessayer avec des paramètres différents, si elle ne correspond pas à la fluorescence DAPI et la membrane des cellules.
          Remarque : Le logiciel reconnaît les cellules avec le nucléaire DAPI souillant et selon la taille de la cellule. Ajustez les paramètres de la cellule (taille, split, pixels) selon le projet.
      6. Phénotype des cellules.
        1. Dans l’onglet « Phénotype », cliquez sur « Ajouter ». Créer des catégories de phénotype cellulaire : CD8 (point bleu) / CD8-PD-1 (point rouge) / CD8-PD-1-Tim-3 (point vert) / autre (point noir) (Figure 4).
        2. Sélectionner plus de 5 exemples de cellules de chaque catégorie. Cliquez sur « Classificateur de Train ».
          Remarque : Cette opération génère un algorithme de classification statistique par le logiciel.
        3. Cliquez sur « Tous de phénotype » pour obtenir le phénotype de chaque cellule.
          Remarque : Le logiciel donne le phénotype d’une cellule avec un intervalle de confiance (IC) de précision.
        4. Améliorer l’algorithme par le logiciel de formation jusqu'à ce que la différence entre le œil et décompte automatisé est concordante (erreur < 5 %). Choisissez un CI qui soit acceptable pour les cellules d’intérêt.
          NOTE : Nous avons choisi de faire la formation sur la base de 55 % CI comme acceptable.
      7. Enregistrez le projet et l’algorithme.
      8. Sous « Fichier », sélectionnez « projet ». Nommez-le et cliquez sur « Enregistrer ».
    3. Effectuer l’analyse de lots de la série.
      1. Sélectionnez « Analyse de lot ». Sélectionnez le projet. Ajouter les images à analyser. Sélectionnez un dossier de stockage pour les données. Cliquez sur « Exécuter ». Vérifier la qualité de l’image composite. Vérifiez le phénotypage pour toutes les images de la série.
        Remarque : Le logiciel d’analyse accouplée image intègre tous les signaux de compartiments (membrane/cytoplasme/noyaux) des cellules. L’étape de la détermination du phénotype est cruciale, bien que la formation de l’algorithme peut être un pas beaucoup de temps. Toutes les données de chaque image sont dans un fichier .txt. Toutes les données d’une cellule (en particulier son phénotype donné par son CI) sont sur une seule ligne. Pour chaque diapositive, l’acquisition d’images et comtes subséquentes ont été effectuées sur 5 domaines.
  3. Intégration des données brutes et de génération du comptage cellulaire automatisée
    1. Calculer les données avec un programme statistique.
      1. Calculer toutes les données à partir des 5 images correspondant aux 5 domaines analysés pour 1 patient. Utiliser une plateforme de statistique et ont un statisticien expérimenté, le gestionnaire de données ou Scientifque de l’analyse. Créer un script qui compte automatiquement les cellules selon leur phénotype, sélectionnant les CI > 55 %.
      2. Mettre tous les fichiers .txt de la série dans le même dossier.
    2. Extraire les données.
      1. Mettre tous les fichiers .txt dans un dossier. Exécutez le script automatique construit à l’étape 3.3.1. Ouvrez le fichier .csv de sortie généré par le script de R. Enregistrer en tant que format de .xl. La sortie rassemble le nombre de cellules pour chaque phénotype (c.-à-d., CD8 seul, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) pour chaque patient.
      2. Calculer le nombre moyen de cellules pour chaque patient par champ : diviser le nombre de cellules par le nombre de champs (c'est-à-dire5) pour normaliser le nombre de cellules pour chaque patient par champ.
      3. Calculer le pourcentage de cellules de PD-1+ chez total CD8+ T cellules et Tim-3 de PD-1+ + chez total CD8+ T des cellules. Voir la Figure 5 pour le résumé de cette étape.
        Remarque : R langue (ou autre logiciel de programmation de choix) est nécessaire pour créer et exécuter les commandes correctement, et un utilisateur expérimenté ou un statisticien/données scientifique est donc essentiel. Le programme de R permet de calculer les données d’un même patient, mais le nom des fichiers .txt 5 d’un patient devrait avoir un début identique, correspondant à un identifiant unique du patient.
  4. Analyse statistique
    1. Utiliser un logiciel de statistique pour l’analyse statistique des résultats.
    2. Effectuer des analyses statistiques appropriées à l’aide d’un statisticien.
      1. Utilisation du Wilcoxon non-paramétrique signé rang tests comparaison d’IFM PD-1 entre les deux phénotypes cellulaires (Figure 6). Corrélation entre les covariables et les caractéristiques histologiques et test khi-deux de Pearson, un.
      2. Utilisez une méthode de Kaplan-Meier pour estimer la survie sans progression et les modèles de régression de Cox pour estimer les effets des covariables sur les résultats de temps-à-l’événement, tels que la survie globale et la survie sans maladie.
      3. Examiner les p-valeurs inférieure à 0,05 comme significatif.

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Representative Results

En utilisant le protocole général décrit ci-dessus, l’étude visait à quantifier intratumorale CD8+ T cells co exprimant les récepteurs inhibiteurs PD-1 et Tim-3 dans les tissus de patients atteints d’hypernéphrome et de corréler les résultats avec les résultats cliniques25congelés.

Optimisation de la coloration de CD8/PD-1/Tim-3 :

Différentes espèces d’anticorps (souris, lapin et chèvre, voir Table des matières) ont été choisis afin d’éviter une réaction croisée entre les différents anticorps. Le protocole a été validé sur une amygdale, qui est un tissu lymphoïde organisé. PD-1 coloration pourrait être trouvée dans les centres germinatifs (Figure 1), tandis que CD8 et Tim-3 taches sont présents qui entourent les centres germinatifs. L’observation de cette coloration typique validé ce protocole. La coloration a été également validée sur le tissu d’intérêt (rein).

L’absence de signal de l’anticorps primaire incubés avec leurs anticorps secondaire ne correspondant (données non présentées) a été confirmée. D’analyser avec précision la coloration de la fluorescence et rendre les bibliothèques spectrales spécifiques, des diapositives individuelles ont été individuellement colorés avec chaque marqueur (CD8, PD-1, Tim-3 ou DAPI) dans les tissus d’intérêt (rein). Il faut une lame non colorés dans les mêmes conditions d’extrapoler l’autofluorescence du tissu. La coloration a été analysée par le microscope automatisé, qui intégrait les spectres des fluorophores différents ; chaque marqueur était bien différencié et pas de chevauchement des marqueurs a été observée (Figure 3).

Caractéristiques quantitatives et qualitatives de la CD8 + S’infiltrent dans 87 Patients RCC :

Résultats ont montré qu’environ la moitié des CD8+ T cells express PD-1 (moyenne 53,9 % ; SE : 30,49 %) et sur un tiers étaient double positif PD-1+ Tim-3+ (moyenne : 38,16 % ; SE : 28,11 %). Tim-3 expression sans expression de PD-1 a été détectée dans moins de 3 % des CD8+ T cells (données non présentées). Les nombres moyens de CD8+ T cell sous-populations ont été : total CD8+ T cells 116,5 (SE : 216), PD-1+ CD8+T cells 89,32 (SE : 191,8), PD-1+ + 66.9 Tim-3 (SE : 143) et PD-1+ – Tim-3 CD8 + Cellules T 22.38 (SE : 57,5) par champ. Le nombre total d’intratumorale CD8+ T cellules était corrélée positivement avec le pourcentage de PD-1+ + Tim-3 sur CD8+ T des cellules.

Caractérisation fonctionnelle de la CD8 + Cellules T selon leur phénotype PD-1 et Tim-3 :

Niveau d’expression de PD-1 est connu pour être en corrélation avec l’épuisement de lymphocytes T pour ensuite l’étude visait à mesurer l’expression de PD-1 sur CD8+ T piles selon le statut Tim-3. L’intensité de fluorescence moyenne des fluorochromes différents est envoyés au niveau cellulaire, une petite série de patients ont été analysés manuellement les données cellulaires : les résultats ont montré une corrélation de PD-1 membrane IFM avec le sous-type cellulaire. PD-1 intensité de fluorescence a été mesurée (Figure 6) au niveau cellulaire sur PD-1+ + Tim-3 contre PD-1+ CD8 Tim-3– + T cells (un panneau) et au niveau patient individuel après l’intégration de ces différents signaux cellulaires sur une section de tissu. Dans une série de 9 patients, une comparaison avec le test de Wilcoxon paire a constaté que les IMF PD-1 est plus élevé lorsque Tim-3 est exprimé conjointement, renforçant la pertinence fonctionnelle d’expression Tim-3 (groupe B).

Expression des Ligands PD-1 et Tim-3 à la Surface des cellules tumorales de multiples co coloration :

Épuisement de lymphocytes T est médiatisée par l’interaction récepteur/ligand, nous avons évalué l’expression des ligands PD-1 et Tim-3 (PD-L1 et galectine-9 (Gal-9), respectivement) sur les cellules de tumeur rénale identifiés par coloration au pan-kératine. Positivité est définie comme un seuil de 10 % des cellules tumorales exprimant le marqueur : (i) 58 sur 87 patients (66 %) étaient positifs pour PD-L1 ; (ii) tous les 15 tumeurs analysées étaient positifs pour Gal-9 (Figure 7 a, B).

Impact clinique de la co-expression de Tim-3 + PD-1 + le CD8 + Lymphocytes T :

Tumor Node Metastasis (TNM) marquant, grade de Fuhrman, taille de la tumeur et score UISS est des caractéristiques histologiques (combinés avec score clinique pour UISS) utilisés pour définir la valeur de pronostic du RCC primaire. Une corrélation positive a été observée entre le nombre et/ou le taux d’infiltration tumorale CD8+ T des cellules exprimant PD-1 et Tim-3 (mais n’expriment ne pas seulement PD-1 ne sont pas Tim-3) avec tous ces paramètres (tableau 1). Conformément à ce phénotype plus péjoratif, RCC atteintes CD8+ T des cellules exprimant conjointement PD-1 et Tim-3 ci-dessus le pourcentage médian (34,7) étaient plus susceptibles de rechute (p = 0,046 ; HR 2.9 ; IC À 95 % : 1,02-8.21). Cette corrélation n’a été observée avec le pourcentage de PD-1, le CD8+ T cellules indépendamment de statut de Tim-3 (tableau 2). Une corrélation a aussi été démontrée entre le pourcentage de CD8+ T des cellules exprimant conjointement PD-1 et Tim-3 et le taux de survie globale de 36 mois (données non présentées). Nous avons également validé l’immunomarquage triple sur tissus de paraffine amygdale (Figure 1).

Figure 1
Figure 1 : immunomarquage CD8-PD-1-Tim-3 sur un tissu de paraffine amygdale. Paraffine embarqué tissu sections au lieu de sections cryoconservées ont été sélectionnées pour immunostaining triple. Après décirage et la réhydratation, le même protocole de coloration développé antérieurement pour les sections cryopréservées a été appliqué. CD8+ T les cellules sont situées en dehors du centre germinal et non-CD8+ T cellules exprimant PD-1 sont regroupées dans le centre germinatif. Le grossissement du microscope 20 x et la barre d’échelle représente 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : automatisé d’analyse des échantillons de tissus pour le carcinome rénal. Après prise en compte dans l’image du champ lumineux tissu (A, échelle bar 1 mm), 4 x grossissement microscope l’imagerie basse résolution en RVB (rouge bleu vert classique fluorescence) permet de sélectionner les champs (B, échelle bar 500 µm. Le carré rouge complet représente un champ. Une image haute résolution (image de fluorescence multispectrale cube spécifique à cette technologie) avec grossissement x 20 interprété par le microscope multispectral est indiquée (C, échelle bar 100 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : microscopie multispectrale et logiciel couplé analyse pour la génération d’une image composite d’un carcinome à cellules rénales (20 x grossissement du microscope). L’image brute de haute résolution (A) est une image fluorescente du champ après la numérisation multispectrale en cubes de filtre de fluorescence. Signal bleu AF488, le rouge est la Cyanine 5, et vert est Cyanin3. La fusion présente des couleurs différentes par exemple, le jaune est une fusion des trois fluorophores. Cette image est incorporée dans le logiciel d’analyse de l’image. Intégration de la bibliothèque spectrale permet une séparation de spectre précis de chaque fluorophore et l’autofluorescence conduisant à une image composite fluorescente (B). Couleurs représentatives sont choisis par l’opérateur : bleu illustre la Cyanine 5 (CD8), Red Cyanine 3 (PD-1), AF488 vert (Tim-3). Fusion de couleur de mélange comme le violet est utilisée pour CD8-PD-1 double positif. La barre d’échelle représente 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : PD-1 et Tim-3 expression sur CD8 infiltration tumorale des cellules sur un spécimen de carcinome rénal à cellules claires analysé par la technologie d’imagerie multispectrale de fluorescence (20 x grossissement du microscope)+ T. CD8 (A) (bleu), PD-1 (rouge) et Tim-3 (vert) ont été colorées sur des coupes de tissus congelés provenant de patients RCC. Colocalisation de ces trois marqueurs peut être détectée en fusionnant les photos mono-coloration. Isotype contrôles ont été effectués pour chaque expérience. La barre d’échelle représente 20 µm. jaune boîtes identifient les cellules colorées co : une cellule CD8 PD-1+ – Tim-3 et une cellule CD8 Tim-3+ PD-1+ . (B) Triple coloration conjointement pour CD8, PD-1 et Tim-3 (fusionnés) sont montré sur la gauche avec la boîte indiquant que vert est CD8+ T des cellules exprimant conjointement PD-1 et/ou de Tim-3. Pour le comptage automatique avec le logiciel d’analyse de l’image, l’identification des cellules dépend de la présence d’une coloration nucléaire (DAPI) ; la segmentation cellulaire repose également sur les caractéristiques morphométriques représentées comme limites rouges (panneau central). Un algorithme formé par l’utilisateur jusqu'à ce que la concordance avec décompte visuel est effectué (à droite) et après phénotypage automatisé, identifie les points verts comme CD8+ T des cellules exprimant conjointement PD-1 et Tim-3, red dots comme CD8+ T cellules exprimant PD-1, sans Points de Tim-3 et bleus comme CD8+ T de cellules exprimant pas PD-1 ou Tim-3. La barre d’échelle représente 20 µm. jaune boîte de montre PD-1 et/ou de Tim-3 exprimant CD8+ T des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : informatique les données brutes d’analyse multispectrale. Données du comte de chaque catégorie de cellules présent dans chaque domaine(p. ex., 5 champs/patient, c'est-à-dire, 5 fichiers .txt) sont recueillies après analyse de l’image. Un script R combine les données de 5 domaines, seulement envisager de cellules phénotypées avec un intervalle de confiance > 55 %. Le grossissement du microscope 20 x et la barre d’échelle représente 100 µm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : PD-1+ + CD8 Tim-3+ T les cellules expriment des niveaux plus élevés de PD-1 par rapport aux PD-1+ CD8 Tim-3– + T les cellules de carcinome à cellules rénales. L’intensité de PD-1 est détectée au niveau cellulaire (panneau de gauche) par l’analyse d’une immunofluorescence in situ sur le PD-1+ + Tim-3 et PD-1+ CD8 Tim-3– + T des cellules. Au niveau individuel (panneau central) : résultats sont indiqués pour l’ensemble CD8+ T cell sous-ensembles PD-1+ + Tim-3 contre PD-1+ Tim-3– présent sur une section de tissu (par exemple, un patient ; Test de Mann Whitney). Analyse comparative de l’intensité moyenne de PD-1 a été mesurée en une série de 9 patients (panneau de droite) (test de Wilcoxon, p-valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives). Le grossissement du microscope 20 x et la barre d’échelle représente 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : PD-L1 et Gal-9 soit PD-1 Tim-3 ligands et coloration sur l’hypernéphrome. (A) tumeur des cellules sont identifiés par une coloration pan-kératine. A la coloration des PD-L1 et pan-kératine (un panneau) identifie l’expression de PD-L1 sur les cellules tumorales chez 58 patients hors 87 analysés. (B) galectine-9 a été exprimé dans l’ensemble des 15 tumeurs de patients RCC analysés. Positivité était considéré comme si au moins 10 % des cellules ont été coloré pour le marqueur analysé. Isotype contrôles ont été inclus pour chaque coloration. Boîtes jaunes représentent la tumeur positive (pan-kératine +) cellules pour PD-L1 (groupe A) ou la galectine-9 (groupe B). Le grossissement du microscope 20 x et la barre d’échelle représente 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Cellules T %/CD8+ PD-1+ PD1+ + Tim-3 PD-1+ Tim-3–
TNM 0,04 0,003 0,22
Furhman 0,01 0,004 0,74
Taille de la tumeur 0,08 0,01 0,37
UISS 0,01 0,01 0,63

Tableau 1 : Corrélation entre l’expression de PD-1 seul ou combiné avec Tim-3 sur CD8+ T des cellules et des paramètres pronostiques cliniques des patients RCC : p-valeurs. Le pourcentage de PD-1+, PD-1+ + Tim-3 ou PD-1+ – Tim-3 sur CD8+ T cellules sélectionnées comme une variable continue, mesurée par in situ par immunofluorescence dans la cohorte des 87 patients montre une corrélation avec différents paramètres cliniques définis comme un fichier binaire (TNM, le grade de Fuhrman, score UISS) ou une variable continue (taille de la tumeur). TNM a été divisé en deux groupes : localisée maladie (pT1 et pT2) et avancé (pT3, pT4, N+ou M+). Grade de Fuhrman a été définie comme étant faible (grade I ou II) et haute (grade III ou IV) et le score UISS était divisée en 3 classes (0, 1 et 2). P-valeurs indiquant une corrélation significative sont indiquées en caractères gras.

CD8+ T cell sous-ensemble/CD8 PD-1+ Tim-3+ PD-1+ Tim-3–
Médiane (%) 34,7 8.6
Corrélation avec PFS P = 0,046 P = 0,8

Tableau 2 : Corrélation entre PD-1 et Tim-3 la co-expression sur CD8+ T des cellules et la progression free survival. Deux groupes de patients RCC (n = 87) selon le pourcentage de PD-1 ne sont pas Tim-3 (à droite), ont été individualisées PD-1 et Tim-3 (à gauche) par rapport à la médiane. La corrélation avec le PFS a été faite avec la médiane sélectionnée comme une coupure. P-valeurs indiquant une corrélation significative sont indiquées en caractères gras.

Supplémentaire tableau 1 : composition du SCT et TBST la mémoire tampon. TBS est utilisé pour les dilutions et mélanges d’anticorps. Pour les lavages, toutes les mesures sont effectuées avec le SCT sauf pour les lavages suite anticorps primaires, où un mélange TBST est recommandé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

La Table 2 : anticorps détaillées mélangent composition pour CD8-PD-1-Tim-3 immunofluorescence souillant. Pour les mélanges de chaque anticorps primaire, secondaire et tertiaire, la dilution à effectuer dans le volume correspondant du SCT est donnée pour un volume total de 1 mL. Pour une diapositive, le volume nécessaire de réaction totale est de 100 µL pour une zone de tissu de 2 cm2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Modifications et dépannage :

La qualité du tissu est un paramètre important ; Il peut être facilement vérifiée par coloration hématoxyline et éosine.

Un des avantages de la technique est la possibilité de salissures multiplexé, mais pour éviter tout débordement de fluorophore, il est recommandé de choisir des longueurs d’onde d’émission avec delta de 10 minimum nm. Ici, parce que nous avons eu 4 salissures y compris DAPI, nous avons choisi d’étaler les longueurs d’onde (DAPI : 460 nm, AF488 : 519 nm, Cyanine 3:570 nm, Cyanine 5:670 nm). Le risque de chevauchement des signaux provenant de plusieurs fluorophores est évité en utilisant le logiciel pour calculer le spectre pur d’un fluorophore à partir d’un signal d’émission mixte, combiné à une analyse d’image automatique. Les lames mono confirment également l’absence de chevauchement entre les fluorophores et acte comme une compensation grâce à la bibliothèque spectrale.

Parfois la positivité d’un seul marqueur dans une cellule peut être difficile de déterminer si la coloration/fluorescence est faible. Le témoin négatif inclus dans chaque expérience est une bonne façon de déterminer un seuil de positivité.

Dans le logiciel couplé utilisé pour analyser les images, une étape de notation pour déterminer la positivité de la cellule existe mais il seulement peut analyser deux marqueurs simultanément. Parce que nous pouvons avoir une coloration triple sur la même cellule (CD8, PD-1 et Tim-3), nous avons choisi à l’étape de la détermination du phénotype.

L’étape de la détermination du phénotype peut être fastidieux, surtout si le type de coloration et d’arrière-plan est variable d’un échantillon à l’autre.

Limites de la Technique :

Même si le nombre de co-salissures est un avantage par rapport à fluorescence conventionnel, il n’est pas possible d’analyser beaucoup de couleurs comme en cytométrie en flux. Surtout quand on étudie la co-localisation des marqueurs multiples, sachez pour sensibilité inférieure par rapport à la microscopie confocale (pour un 20 x grossissement du microscope, environ 0,5 µm contre 0,1 µm par pixel pour confocal, selon la marque) et Recherchez un empiétement fluorophore (se reporter aux étapes critiques dans le protocole, ci-dessous).

Une limitation importante de la technique est le format de données brutes. Les fichiers RAW est des fichiers .txt qui pourraient être difficiles à utiliser. Comme le logiciel donne un fichier .txt par image avec CI pour le phénotype, le traitement manuel de chacun des 5 fichiers par patient d’une énorme série est très laborieux. Un spécialiste de la bio-informatique est tenu de calculer toutes les données dans un logiciel de statistique.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :

Analyse de coloration multiplexé est facilement possible. Par rapport à la cytométrie en flux, qui analyse les échantillons frais, cette technique permet un comptage rapide dans une méthode reproductible des sous-ensembles cellulaires présents dans le micro-environnement tumoral, de grandes cohortes d’échantillons congelés avec une procédure automatisée26 ,,27. Nous pourrions compter automatiquement infiltrer CD8+ T des cellules exprimant Tim-3 PD-1 et co exprimant ou non dans le cadre du RCC. Le comptage automatique évite plusieurs biais comme la fatigue oculaire et comte non reproductibles et ne prend pas beaucoup de temps.

Comme la grande cohorte étudiée sur des échantillons congelés, nous avons eu de données rétrospectives, alors nous pourrions relier le nombre absolu ou le pourcentage de la CD8+ T cell sous-ensembles avec paramètres biologiques et les résultats cliniques. Qu’il y a une importante hétérogénéité de l’infiltration immunitaire d’un patient à un autre28, cela représente un avantage par rapport à fluorocytometry qui ne signale que MFI et pourcentage mais pas le degré d’infiltration.

L’intensité de la fluorescence est quantitativement mentionnée pour chaque cellule, et dans les compartiments cellulaires (membrane/cytoplasme/noyaux), nous pourrions évaluer le niveau de PD-1 taches provoquées par les IMF à la membrane. Il s’agit d’un autre outil intéressant qui est similaire à la cytométrie en flux. Nous avons constaté que le PD-1+ CD8+ T les cellules exprimant Tim-3 avait une expression plus élevée de PD-1 et ont été associés à un mauvais pronostic (impact sur la survie sans progression). À notre connaissance, c’est la première étude à l’aide de cette méthode qui montre une signification clinique d’un sous-ensemble de cellules spécifiques.

Applications futures :

Le champ d’application est immense. Nous avons également mis en évidence dans microenvironnement de la tumeur du cancer du poumon un autre sous-ensemble de cellules spécifiques : la mémoire résidente de tissu T cellules appelé CRT (CD103+ CD49a+), et elles sont corrélées avec une meilleure global survival21,29 ,,30. Dans un autre ouvrage en utilisant cette technique, notre équipe a trouvé que PD-L1 était surexprimé sur un sous-type de cancer du poumon avec un réarrangement de lymphome anaplasique kinase (ALK), les cellules tumorales, et cette expression a été corrélée avec CD8+ T infiltrer10. Cette technique convient pour l’évaluation des paramètres biologiques critiques dans plusieurs contextes et peut représenter un outil précieux pour la découverte de biomarqueurs. Puisque les coordonnées xy sont administrées, c’est un des premiers outils pour étudier la topographie et de la cellule/cellule interactions avec facilité,31.

Étapes critiques au sein du protocole :

Une des étapes essentielles est l’optimisation de la coloration Co, qui peut être très longue. Le choix d’un bon anticorps est crucial, par exemple plusieurs clones ont été testés pour Tim-3 dans la présente affaire. En outre, fluorophores différents pour le même repère peut donner des résultats différents, il est donc important d’essayer plusieurs combinaisons. Est recommandé d’examiner la spécificité de coloration avec des anticorps qui ne devrait pas réagir ensemble. Malgré la possibilité d’analyser plusieurs fluorophores en même temps, il est recommandé de recherchant à débordement avec les lames mono. Une autre étape cruciale est l’étape de détermination du phénotype qui s’appuie sur le manuel de formation pour effectuer avec soin.

Au total, l’utilisation de cette technique multiplexée par un opérateur habile représente un outil élégant d’analyser plusieurs sous-ensembles de cellules de l’infiltrat immunitaire locale, qui est d’importance puisque l’analyse de sang périphérique ne peut pas être représentatif de la tumeur locale environnement.

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Disclosures

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut National du Cancer (INCA) (HE), Ligue contre le Cancer (HE), Université Sorbonne Paris Cité (HE), ANR (Selectimmunco) (HE), Labex Immuno-oncologie (HE), SIRIC CARPEM (CG, ET). GDE a été financée par une bourse de la Fondation ARC. EV et CD ont été financées par une bourse de l’APHP (recherche de bourse d’année). ChB est financé par une bourse de recherche de l’Université Sorbonne Paris Cité (contrat doctoral). Les auteurs remercient Bristol Myers Squibb pour leur financement dans ce projet. Les auteurs remercient le département de pathologie de l’Hôpital Européen Georges Pompidou et Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel et Gisèle Legall). Les auteurs remercient la plate-forme de l’histologie des rendez-vous, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging  Perkin Elmer CLS142338
inForm cell analysis 2.1. Perkin Elmer CLS135781
R software https://www.r-project.org
Dakopen delimiting pen Dako S2002
Tris Buffer Salin TBS Tablets Takara, Bio Inc. TAKT9141Z pH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) Takara, Bio Inc. TAKT9142Z pH 7.6 100 tablets
Biotin blocking system Dako X0590 Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serum Jackson Immunoresearch 017-000-001 5% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPI Sigma-aldrich F6057 1.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslip Knittel Gläser, 100039 24x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V novus NBP1-79055 use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT abcam ab52587 use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3 R&D AF2365 use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 Roche 7309457001 use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 Cell Signalling 4528 use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9 R&D AF2045 use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-175-152 use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 715-066-150 use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG abcam ab150133 use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidin Amersham PA43001 use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1 Dako X0931 use at 2 µg/mL
IgG from goat serum Sigma-aldrich I5256 use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serum Sigma-aldrich I5006 use at 4µg/mL

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References

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Immunologie numéro 132 Multiplex in situ imagerie multispectrale technique d’immunofluorescence imagerie numérique carcinome à cellules rénales Tim-3 PD-1 microenvironnement tumoral inhibiteurs de point de contrôle l’analyse in situ unicellulaire
Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1<sup>+</sup> <sup>+</sup> Tim-3 CD8<sup>+</sup> T Cells
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