Summary
종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.
Abstract
면역 세포 종양 microenvironment의 중요 한 구성 요소 이며 발암의 모든 단계에서 종양 성장과 진화에 영향. 특히, 그것 지금 잘 설립 인간의 종양에 면역 침투 예 후와 치료에 응답을 상호 연결할 수 있습니다. 종양 microenvironment에 면역 침투의 분석은 환자와 치료에 대 한 응답의 분류에 대 한 주요 도전 되고있다.
억제 수용 체 프로그램 세포 죽음 단백질 1 (PD1; 일컬어 CD279), 세포 독성 T 림프 구 관련 4 (CTLA-4) 단백질, T 세포 면역 글로불린 및 Mucin 포함 단백질-3 (팀 3, 일컬어 CD366), 림프 구 등의 공동 식 활성화 유전자 3 (지연-3, 일컬어 CD223), T 세포 소모의 특징 이다. 우리는 multiparametric 제자리에 면역 형광 식별 하 고 이러한 억제 수용 체의 공동 식 세포 수준에서 계량 얼룩을 개발 했다. 신장 세포 carcinomas (RCC)의 냉동된 조직의 회고전 시리즈, 이미지 분석 소프트웨어와 결합 된 형광 multispectral 이미징 기술을 사용 하 여, 종양 CD8 침투에 PD 1 팀 3의 공동 식 찾아냈다+ T 세포 RCC에서 가난한 예 후와 상관 된다. 하 우리의 지식,이 대표가 자동 멀티플렉스 현장 기술 시연 첫 번째 연구는 몇 가지 임상 관련성 있을 수 있습니다.
Introduction
지난 몇 년 동안, immunotherapy RCC를 포함 하 여 암의 많은 종류에 대 한 매우 유망 치료로 등장 했습니다. 특히, immunotherapy 금지 검사점의 억제에 따라 PD 1 좋아하고 CTLA-4은 임상적으로 효과적인1,2,3,,45, 것으로 보고 되었습니다. 6. 단일 클론 항 체 CTLA-4에 대 한 PD-1, 또는 프로그램 죽음 Ligand 1 (PD-L1) 이미 여러 암에 승인 되 고 오래 견 딘 임상 응답 환자7의 20% 이상으로 이어질. 그럼에도 불구 하 고, 모든 환자는 초 동 조치, 치료의 비용은 높다, 되며 이러한 치료 독성, 잠재적인 심각한 면역 같은 부작용을 선도. 따라서, 현재 도전 예측 마커 그 새로운 immunotherapies 식별 것입니다. 종양, PD-L1, 표현 또는+ T 세포 침투 intratumoral CD8의 수준에서 돌연변이의 속도와 임상 응답 상관 관계를 보고 되었습니다. 그러나,이 협회는 아직도 너무 약 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 환자8 에서에서 Pembrolizumab의 관리 전에 PD L1 동반자 테스트 제외 임상 연습에서 이러한 임상 생체의 사용을 권장 해 ,91011,12. 그것은 많은 금지 수용 체의 공동 식 같은 PD-1, 팀 3, 지연-3, 고 CTLA-4 유도 세포 소모 형 그리고 치료13,,1415저항 증명 되었습니다. 말 초 혈액 종양 microenvironment의 대표 이므로, 셀 제자리의 phenotypic 특징을 분석 하 고 관심입니다. PD-1 팀-3 공동 표현 T 세포 기능 장애가 여러 컨텍스트13,,1617셀 수 알려져 있습니다. 이 연구에서 두 금지 수용 체 PD 1의 공동 식과 CD8-3 팀의 전조 영향+ T 세포를 평가 했다.
종양 침투 림프 톨 (TILs)에 여러 마커의 공동 식 공부는 지금까지 최대 주로 신선한 종양 및 따라서 제외 회고전 분석에 작동 하는 데 필요한 만드는 흐름 cytometry 분석에 의해 수행 되었습니다. 기존의 현장에 얼룩, 한 번에 하나의 얼룩 수행할 수 있습니다와 공동 마커를 표현 하는 셀 형식의 특성은 불가능 하다. 예를 들어 PD L1 기존의 immunohistochemistry 분석 표현 PD L1 셀은 더 많은 상호 연구 관련 하 여 정의 하 고 어려운 종양 microenvironment의 많은 세포 유형으로 표현 됩니다. 이 작품에서는, 우리는 혁신적인 위치에 multiparametric 면역 형광 검사 방법을 개발 CD8 침투 종양에 의해 PD-1 팀-3의 공동 식 연결할 컴퓨터 계산+ T-세포 RCC에서 임상 결과. 이 기술은 여러 이점이 있다, 단일 셀 수준 및 여러 표식에 제한 된 간격을 캡처할 수 있는 multispectral 카메라를 사용 하 여 동시에 분석 하는 가능성을 포함 하 여 > 10 nm 액정을 통해 필터18. 또한, 절차는 자동 간 연산자 재현성 및 수동 기법19에 비해 단축된 분석 수 있습니다. 암 분야에서 여러 연구 보고에 메르켈 세포 암, 폐 암, 머리와 목 암20,,2122, 같은 PD-1, PD-L1, 및 CD8 면역 분자의 여러 stainings를 설득 23. 자동된 세포 수는 사용자 (형질 단계) 교육 가능 하다. 형광은 다른 세포 격실 (핵, 세포질, 막)에서 측정 됩니다.
여기, CD8 종양 침투의 다른 하위 집합+ T 세포 표현 PD-1 및 RCC의 대형 코 호트에서 팀-3 계산 했다 고 결과 임상 중력 점수 및 생존 매개 변수 연관 되었다. 그것은 또한 cytometry에 같은 의미 형광 강도 (MFI) 데이터는 셀룰러 해상도에서 막 형광 강도 분석 가능. 우리가 아는 첫 번째 연구 보고 전조 결과를이 multispectral 영상 기반된 수 기술을 사용 하 여 나타냅니다.
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Protocol
이 연구는 헬싱키의 선언에 따라 실시 되었다과 지역 윤리 위원회 (CPP Ile 드 프랑스 nr. 2012-05-04)에 의해 승인 되었다. 동의 동료에 포함 된 참가자 로부터 얻은 것입니다.
1. 조직 자료
- 수술 당일에 RCC 조직 샘플을 수집 합니다. 실 온 (병 리과)에서 외과 견본을 처리 합니다.
- 약 0.5 c m x 0.5 cm x 건조 관에 0.5 cm 크기의 종양 샘플을 수집 합니다. 스냅 액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장
- 최적의 절삭 온도 화합물 샘플 코트. 4-6 µ m 두께 섹션으로-20 ° C에서 cryostat와 샘플 섹션. 12 h에 대 한 슬라이드에 건조 한 공기를 직접 건조를 피하기 위해-80 ° C에서 그들을 저장 하는 예제를 보자.
- 보고는 되며 샘플의 품질을 확인 하 고 오신 스테인드 섹션.
2. 제자리에서 TILs의 면역 형광 염색
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절차 지침
- 실 온에서 모든 실험 단계를 수행 합니다.
- 모든 단계에 대 한 희석 Tris 버퍼 염 분 (TBS, 참조 테이블의 재료)를 수행 합니다.
- 1 차적인 항 체 외피 후 제외 하 고 모든 단계에 대 한 큰 술에 씻어를 수행 합니다. 후자에 대 한 사용 Tris 버퍼 염 Tween20 (TBST, 재료의 표참조). 버퍼 구성 및 재구성에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오.
- 습도 챔버를 사용 하 여 항 체 외피와 세척을 위한 착 색 병에 대 한.
- 섹션을 절차 동안 건조 하지 마십시오.
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전처리
- 조직 샘플을 포함 하는 슬라이드를 해 동 하 고 신중 하 게 건조 종이 타월 견본 주위 슬라이드. 소수 성 장벽 펜 조직을 포함 하는 반응 지역 delimitate ( 재료의 표참조). 2 분 동안 건조입니다.
- 5 분, 2 분, 건조에 대 한 100% 아세톤에 샘플을 수정 하 고 10 분 TBS로 세척.
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채도 봉쇄
- Avidin 0.1%의 3 방울과 10 분에 대 한 슬라이드를 pretreat, 탭 및/또는 영화는 avidin 배포 공기 방울을 제거 하 고 다음 biotin 0.01%의 3 방울과 10 분 동안 치료를 슬라이드 (참조 테이블의 자료), 탭, 및/또는 영화. 워시와 함께 tbs.
- Fc 수용 체 봉쇄를 수행 합니다. 100 µ L의 정상적인 혈 청에 tbs. 사용 레이블된 2 차 또는 3 차 항 체로 동일한 호스트 종에서 혈 청 희석의 5% 볼륨/볼륨 적용 ( 재료의 표참조). 여기, 당나귀 혈 청 사용 되었다. 30 분 동안 품 어.
- 부 화, 동안 안티 CD8, PD-1, 그리고 팀-3 항 체 (자료 테이블)을 스핀 짧게. 추가 표 2에 설명 된 대로 TBS에서 기본 항 체의 믹스를 준비 합니다.
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면역 염색 법으로 CD8, PD-1, 그리고 팀-3
- 1 차적인 항 체 혼합물을 준비 합니다. 사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 와 보충 표 2 를 참조 하십시오 (안티 CD8, PD-1 팀-3, 그리고 그들의 해당 보조 항 체) 및 그들의 농도.
- 탭 및 나머지 당나귀 혈 청 (단계 2.3.2에서에서 추가) 영화. 100 µ L 1 h 습도 챔버에 대 한 1 차 항 체 라는 비 혼합의와 슬라이드를 품 어.
- 부 화, 동안 짧게 Cyanine 5 반대로 토끼, AF488-안티-염소, 그리고 biotinylated 반대로 마우스 항 체, 회전 하 고 보충 표 2에 설명 된 대로 2 차 항 체의 믹스를 준비.
- 워시 5 분 건조에 대 한 TBST에 슬라이드 슬라이드.
- 습도 상공에서 30 분 2 차 항 체의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.
- 보충 표 2에 설명 된 대로 Cy3 streptavidin를 포함 하는 제 3 항 체의 혼합물을 준비 합니다.
- 씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.
- 30 분 동안 3 차 항 체 혼합물의 100 µ L로 슬라이드를 품 어.
- 씻고 10 분 건조에 대 한 TBS에 슬라이드 슬라이드.
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셀 마운트
- 슬라이드 4'를 탑재, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-포함 된 매체 (1.5 µ g/mL DAPI) 형광 현미경 검사 법에 대 한 호환 coverslip로 장착 (참조 테이블의 자료).
참고: 각 실험에 대해 부정적인 컨트롤, 항 체 isotype 일치 한 슬라이드가 해당 항 체로 같은 농도에서 사용 되었다. 이 착 색 사용 마우스 IgG1, 토끼 IgG, 및 염소 IgG 부정적인 제어 항 체 ( 재료의 표참조). 긍정적인 통제로 우리는 각 실험에 대 한 테스트 표식에 대 한 긍정적인 것으로 알려져 인간 hyperplasic 편도 선 사용. 전형적인 얼룩 결과 (그림 1)에 설명 되어 있습니다. 모노-CD8의 얼룩, PD-1, 그리고 팀-3 수행 해야 개별적으로 (슬라이드 당 한 얼룩) 같은 전처리와 DAPI 없이. 어떤 항 체만 DAPI 장착 매체 없이 동일한 실험 조건에서 슬라이드도 수행 되어야 합니다. 슬라이드는 어떤 항 체와 DAPI 없이 동일한 실험 조건을 사용 하 여 몇 군데 한다.
- 슬라이드 4'를 탑재, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride DAPI-포함 된 매체 (1.5 µ g/mL DAPI) 형광 현미경 검사 법에 대 한 호환 coverslip로 장착 (참조 테이블의 자료).
3. 형광 분석 및 자동화 된 셀 수
- 자동 현미경 이미지 수집
- 프로토콜을 만듭니다.
- 자동된 현미경 소프트웨어 및 형광 조명 기를 켭니다.
- 메뉴 모음에서 "파일", "프로토콜을 만들기"를 클릭 선택 "DAPI," "FITC," 및 "TRITC"
- "다음," "조직 섹션," 클릭 하 고 클릭 합니다 "," "프로토콜 이름입니다." 선택한 이름, 예를 들어 "CD8-PD-1-팀-3," 클릭 "다음" "저장."
- 직접 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 메뉴 모음에서 "설정", "설정" 클릭 새 창에서 "홈 Z 설정"을 클릭 합니다.
- 노출 시간 조정 긍정적인 제어 즉 는 CD8 슬라이드, PD-1, 팀-3 트리플-스테인드 DAPI 샘플.
- 제어 막대에서 클릭 "설정 노출."
- 충분 하지만 포화 하지 신호를 얻을 때까지 각 필터에 대 한 노출 시간을 조정 합니다.
- 흑백 영상에 대 한 다음을 수행 합니다.
- 인수를 선택 하 고 '자동 초점'에서 DAPI 필터를 선택 합니다.
- "검색 지역 제한"에서 객관적인 상단 슬라이드의 상단 왼쪽된 모서리에 이동 합니다. "마크"를 클릭 합니다. 오른쪽 아래 모서리에 대 한 같은 마십시오.
참고:이 단계 delimitates 저전력 (lp로 영상) 4 X; 이미징의 영역 시리즈의 모든 샘플을 서라운드로 잘 마크를 알고 있어야 합니다. - 고 출력 (HP) 이미징에 대 한 다음을 수행 합니다.
- '자동 초점'에서 "DAPI"을 선택 합니다.
- '수집' 밴드에서 "DAPI", "FITC", "Cy3", 및 "Cy5"를 선택 합니다. "확인"을 클릭 합니다. 메뉴 모음에서 "프로토콜" 저장 "파일"을 클릭 합니다.
- 슬라이드를 검사 합니다.
- "파일" 메뉴 막대에서 "프로토콜 로드"를 클릭 하 여 프로토콜을 로드 합니다. "시작"을 클릭 합니다.
- ' 실험실 ID' (이미지 저장을 위한 폴더 위치)를 입력 합니다. 슬라이드 슬라이드를 식별 하기 위해 ID를 입력 합니다. "다음"을 클릭 합니다.
- "흑백 영상" (필드 밝은 빛 아래에서 전체 슬라이드를 스캔 4 x 목표를 사용 하 여 순차 이미지)를 클릭 합니다.
참고:이 슬라이드의 회색조 개요를 생성합니다. - "표본 찾기"를 클릭 합니다. 낮은 해상도 (4 배)에서 스캔을 조직 영역 선택: 'Ctrl' 키를 누른 클릭 필드는 커서를 사용 하 여 선택 하거나 선택 취소 필드 (그림 2A).
- 각 필드의 형광 레드 블루 그린 이미지 수집을 위한 "LP 이미징" (영상 x 4)을 클릭 합니다.
- HP 필드 선택 'Ctrl' 키 고 선택 하거나 선택 취소 (20 배)의 높은 해상도에서 스캔 될 조직의 영역에 해당 하는 필드는 커서를 사용 하 여 필드에 클릭 하십시오. 5 분야 (그림 2B)를 선택 합니다.
- 각 필드 (그림 2C)의 multispectral 이미지 수집을 위한 "HP 이미징" (영상 x 20)을 클릭 합니다.
- LabID에서 처음에 선택 된 폴더에 이미지를 저장 하려면 "데이터 저장"을 클릭 합니다.
참고: 프로세스 요약 이며 그림2. (조직 감지, 필드 선택) 각 단계에 대 한 알고리즘 증가 고 전체 자동 검색 프로세스에 대 한 사용자에 의해 훈련 될 수 있습니다.
- 프로토콜을 만듭니다.
- 형광 이미지 분석 및 자동화 된 셀 결합된 분석 소프트웨어와 계산
- 스펙트럼 라이브러리를 빌드하십시오.
- 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 왼쪽된 패널에서 "라이브러리"를 구축 엽니다. '이미지 로드', 아래 "찾아보기"를 클릭 하 고 하나의 모노-스테인드 이미지 (예를 들어, CD8/Cyanine 5)를 선택 합니다.
- (예를 들어, Cyanine 5) fluorophore를 선택 합니다. "추출"을 클릭 합니다. 라이브러리에 저장할 수 "저장" 클릭 합니다. "저장"을 클릭 합니다.
- PD-1, 같은 과정을 반복 팀-3, 그리고 DAPI 모노 스테인드 슬라이드의 각 fluorophore의 스펙트럼을 통합 하기 위하여.
참고: 각 fluorophore (여기, 신장), 특정 조직에 대 한 사용에 대 한 스펙트럼 통합 스펙트럼 라이브러리를 구축 하지만 이미 존재 하는 "합성" 라이브러리를 사용할 수 있습니다. Autofluorescence 스펙트럼은 조직 기준으로 엄격 하 게, 그것은 하나의 자동 형광 스펙트럼 라이브러리 프로젝트를 수행 하는 것이 중요.
- 새 프로젝트를 만듭니다.
- 메뉴 모음에서 "파일", "새로운 프로젝트"를 클릭 합니다. '찾기 기능' 탭에서 "셀 분할"을 선택 합니다. '형질' 탭에서 "형질"을 선택 합니다. "생성"을 클릭 합니다.
- 통합 프로젝트에서 대표 이미지.
- '파일' 탭에서 "이미지 열기"를 클릭 합니다. 전체 시리즈의 10 ~ 30 대표 이미지를 선택 합니다. Autofluorescence 제거 하 비-얼룩진 슬라이드를 추가 합니다. 오른쪽 패널에서: 선택 라이브러리 소스. Fluorophore를 선택 하 고 이전 빌드 스펙트럼 라이브러리에 해당 하는 그를 선택.
- 조직 autofluorescence를 제거 하려면 "AF 버튼"을 클릭 하 고 빈 슬라이드에 autofluorescence의 영역을 선택 합니다.
- 이미지 처리와 합성 이미지 생성
- "모든" 형광 라이브러리와 복합 이미지 (그림 3)를 생성 하는 autofluorescence 스펙트럼 통합 준비를 클릭 합니다. '눈' 아이콘 '보기 편집기' 패널을 열고 표시 하는 데이터 선택을 클릭: 선택 마커 CD8, PD-1, 팀-3, 및 DAPI. autofluorescence를 제거 합니다. 소프트웨어에 의해 제시 하는 단계를 따릅니다.
- 세그먼트 셀.
- '칸'에 셀 세그먼트 "핵"과 "막"을 선택 합니다. "핵" 탭에 DAPI 핵 counterstain로 설정 합니다.
- '최대 및 최소 크기 (픽셀)' 탭에서 입력 "40"와 "176" 최소 및 최대 크기로 각각. '최소' 신호에 대 한 "0.13"을 설정 합니다. "분할" 탭에서 "2.60"을 설정 합니다. "핵" 탭에서 "0.81"을 설정 합니다. "막 신호 사용 하 여 분할을 지원"을 선택 합니다.
- "세그먼트 셀" 화면의 하단 부분을 클릭 합니다. 핵의 세분화 및 세포의 막을 확인 하 고 셀의 DAPI과 막 형광 일치 하지 않는 경우 다른 매개 변수와 함께 다시 시도.
참고: 소프트웨어 핵 DAPI 얼룩 및 셀 크기를 기준으로 셀을 인식 합니다. 프로젝트에 따라 셀 매개 변수 (크기, 분할, 픽셀)를 조정 합니다.
- 형 셀.
- '표현 형' 탭에서 "추가"를 클릭 합니다. 셀 형 카테고리 생성: CD8 (블루 도트) / CD8-PD-1 (빨간 점) / CD8-PD-1-팀-3 (녹색 점) / 기타 (검은 점) (그림 4).
- 각 카테고리의 셀의 5 개 이상의 예제를 선택 합니다. "분류자 기차"를 클릭 합니다.
참고:이 소프트웨어는 통계 분류 알고리즘을 생성합니다. - "모든" 각 세포의 표현 형을 얻기 위해 형을 클릭 합니다.
참고: 소프트웨어는 정확도의 신뢰 구간 (CI)와 함께 한 셀의 표현 형을 제공합니다. - 눈 및 자동된 수의 차이 조화 된 때까지 소프트웨어를 학습 하 여 알고리즘을 개선 (오류 < 5%). 선택은 관심의 셀에 대 한 CI.
참고: 우리는 허용으로 55 %CI 기초 훈련을 만들 하기로 결정 했습니다.
- 알고리즘 및 프로젝트를 저장 합니다.
- '파일' 아래에서 "프로젝트"를 선택 합니다. 이름을 지정 하 고 "저장"을 클릭 합니다.
- 일괄 처리는 일련의 분석을 수행 합니다.
- "일괄 분석"을 선택 합니다. 프로젝트를 선택 합니다. 분석 이미지를 추가 합니다. 데이터 저장소의 폴더를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다. 복합 이미지의 품질을 확인 합니다. 시리즈의 모든 이미지에 대 한 형질을 확인 합니다.
참고: 결합 된 이미지 분석 소프트웨어는 모든 셀 구획 (막/세포질/핵) 신호를 통합합니다. 형질 단계 알고리즘의 훈련 수 시간이 걸리는 단계 이기는 하지만 결정적 이다. 각 이미지의 모든 데이터는 한.txt 파일에 있습니다. 한 셀 (특히 그것의 표현 형의 CI와 주어진)의 모든 데이터는 한 줄에 있습니다. 각 슬라이드는 이미지 수집 및 후속 5 필드에 수행 했다.
- "일괄 분석"을 선택 합니다. 프로젝트를 선택 합니다. 분석 이미지를 추가 합니다. 데이터 저장소의 폴더를 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다. 복합 이미지의 품질을 확인 합니다. 시리즈의 모든 이미지에 대 한 형질을 확인 합니다.
- 스펙트럼 라이브러리를 빌드하십시오.
- 원시 데이터와 자동된 세포 수의 세대의 통합
- 통계 프로그램을 사용 하 여 데이터를 계산 합니다.
- 1 환자에 대 한 분석 5 필드에 해당 하는 5 이미지에서 모든 데이터를 계산 합니다. 통계 플랫폼을 사용 하 고 경험된 통계, 데이터 관리자 또는 분석을 수행 하는 데이터 과학자. 자동으로 CI > 55%를 선택 하면, 그들의 표현 형에 따라 셀을 계산 하는 스크립트를 빌드하십시오.
- 시리즈의 모든.txt 파일을 같은 폴더에 넣어.
- 데이터를 압축을 풉니다.
- 한 폴더의 모든.txt 파일을 넣어. 3.3.1 단계에서 내장 자동 스크립트를 실행 합니다. R 스크립트에 의해 생성 된 출력.csv 파일을 엽니다. .Xl 형식으로 저장 합니다. 출력 각 환자에 대 한 (즉, CD8 혼자, CD8-PD-1, CD8-PD-1-팀-3) 각 표현 형에 대 한 셀의 수를 수집합니다.
- 필드 당 각 환자에 대 한 셀의 평균 수를 계산: 필드 각 환자에 대 한 셀의 수를 정규화 (즉, 5) 필드의 수는 셀 수를 나눕니다.
- 총 CD8 중 PD-1+ 세포의 비율을 계산+ T 세포, 및 총 CD8 중 PD-1+ 팀-3+ 셀+ T 세포. 이 단계의 요약 그림 5 를 참조 하십시오.
참고: R 언어 (또는 선택의 다른 프로그래밍 소프트웨어) 제대로 작성 하 고, 명령을 실행 하는 데 필요한 이며 그래서 경험 많은 사용자 또는 통계/데이터 과학자 필수적 이다. R 프로그램 같은 환자 데이터를 계산할 수 있습니다 하지만 한 환자의 5.txt 파일의 이름을 고유한 환자 id에 해당 하는 동일한 시작 있어야 합니다.
- 통계 프로그램을 사용 하 여 데이터를 계산 합니다.
- 통계 분석
- 통계 소프트웨어를 사용 하 여 결과의 통계 분석을 위해.
- 통계의 도움으로 적절 한 통계 분석을 수행 합니다.
- 사용 비패라메트릭 Wilcoxon 두 셀 고기 (그림 6) 경찰-1 MFI의 비교에 대 한 순위 테스트 서명. Pearson의 카이 제곱 테스트 covariate 및 조직학 특성 상관.
- 진행 성 자유로운 생존, 그리고 콕스 회귀 모델 등 전반적인 생존과 질병-무료 생존 시간 이벤트 결과에 covariate 효과 추정을 추정 하는 카 플 란-마이어 메서드를 사용 합니다.
- 고려 하십시오 p-값은 중요 한로 0.05 보다 낮은.
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Representative Results
위에서 설명한 일반적인 프로토콜을 사용 하 여, 우리 intratumoral CD8 계량을 목적으로+ T 세포 금지 수용 체 PD-1, 팀-3와 상관 관계를 결과 임상 결과25RCC, 환자에서 냉동된 조직에 공동 표현.
CD8/PD-1/팀-3 얼룩의 최적화:
종 항 체 (마우스, 토끼, 염소, 재료의 표참조)의 다른 항 체 간의 교차 반응을 피하기 위하여 선택 되었다. 프로토콜은 편도 선, 인 조직된 림프 조직에 확인 했다. PD-1 얼룩에서 찾을 수 본 원 센터 (그림 1), 반면 CD8과 팀-3 어린 싹 센터를 둘러싼 있는지 얼룩. 이 일반적인 얼룩이 지기의 관찰이이 프로토콜 검증. 얼룩은 또한 관심 (신장)의 조직에는 유효성이 검사 됩니다.
그들의 대응 비 이차 항 체 (데이터 표시 되지 않음)와 함께 알을 품을 주 항 체의 신호의 부재를 확인 했다. 개별 슬라이드 각 표시와 함께 단독으로 얼룩진 했다 얼룩 형광 정확 하 게 분석 하 고 특정 스펙트럼 라이브러리, (CD8, PD-1 팀-3, 또는 DAPI) 관심 (신장)의 조직에. 동일한 조건에서 비 스테인드 슬라이드 조직의 autofluorescence 추정 필요가 있다. 다른 fluorophores;의 스펙트럼을 통합 자동된 현미경에 의해 분석은 얼룩 각 마커 잘 분화 되었고 마커의 아무 오버랩 (그림 3) 관찰 되었다.
CD8의 양적 및 질적 특성 + 87 RCC 환자에 침투:
결과 보여주는 approximatively CD8의 절반+ T 세포 표현 PD-1 (평균 53.9%; SE: 30.49%)에 대 한 1/3 했다 두 배 긍정적인 PD-1+ 팀-3+ (의미 38.16%; SE: 28.11%). 팀-3 식+ T 세포 (데이터 표시 되지 않음) 없이 PD-1 식 CD8의 3% 미만에서 검색 되었습니다. CD8의 평균 숫자+ T 세포 모집단 했다: CD8 총+ T 세포 116.5 (SE: 216), PD-1+ CD8+T 세포 89.32 (SE: 191.8), PD-1+ + 66.9 팀-3 (SE: 143), 및 PD-1+ 팀-3- CD8 + T 세포 22.38 (SE: 57.5) 필드. Intratumoral CD8의 총 수+ T 세포 PD-1+ + 팀-3에 CD8 비율와 긍정적으로 상관 했다+ T 세포.
CD8의 기능 특성 + T 세포에 따라 그들의 표현 형 PD-1 팀-3:
PD-1 식 수준 상관 될 알려져 있다 T 세포 소모와 그래서 우리는 다음 CD8에 PD 1 식 측정 목적+ T 세포 팀-3 식 상태에 따라. 다른 형광의 평균 형광 강도 세포 수준에서 보고는, 환자의 작은 시리즈 수동으로 셀룰러 데이터에 대 한 분석 했다: 결과 셀 하위와 PD-1 막 MFI의 상관 관계를 보였다. PD 1 형광 강도 측정된 (그림 6) PD-1+ 팀-3- CD8 대 PD-1+ 팀-3+ + T 세포 수준에서 세포 (패널)이 다양 한 통합 후 개별 환자 수준에서 조직 섹션에 세포 신호입니다. 9 환자의 시리즈, Wilcoxon 대응된 테스트와 비교 발견 PD 1 MFI 높은 팀-3 공동 표현 팀-3 식 (B 패널)의 기능적 관련성을 강화.
여러 공동 얼룩에서 종양 세포의 표면에 PD 1과 팀 3 Ligands의 표현:
T 세포 소모는 수용 체/리간드 상호 작용을 통해 중재 된다로 우리 PD-1, 팀 3 ligands의 식 평가 (PD L1, Galectin-9 (Gal-9), 각각) 팬 각 질 얼룩으로 식별 되는 신장 종양 세포에. 양성 마커를 표현 하는 종양 세포의 10%의 인하로 정의 됩니다: (i) 87 환자 (66%)에서 58 PD-L1;에 대 한 긍정적인 했다 (분석 ii) 모든 15 종양 여자-9 (그림 7A, B)에 대 한 긍정적인 했다.
팀 3의 공동 식의 임상 영향 + PD-1 + CD8에 + T 세포:
종양 노드 전이 (TNM) 점수, Fuhrman 등급, 종양 크기 및 UISS 점수 조직학 특징 (UISS에 대 한 임상 점수 결합) 기본 RCC의 예 후 값을 정의 하는 데 사용입니다. 번호 또는 CD8 종양 침투의 비율 사이 긍정 상호 관계 관찰 되었다+ T 세포 표현 PD-1 팀-3 (하지만 하지만 PD-1 팀-3를 표현) 모든 이러한 매개 변수 (표 1). 이 더 경멸적 인 표현 형, CD8 RCC 환자에 따라+ T 세포 공동 표현 PD-1과 팀-3 평균 비율 (34.7) 위에 재발 확률이 높았다 (p = 0.046; HR 2.9; 95 %CI: 1.02-8.21). 이 상관 관계 CD8에 PD 1의 비율로 관찰 하지 팀-3 상태 (표 2) 별도로+ T 세포. 상관 관계는 CD8 비율 사이 또한 입증 되었다+ T 세포 공동 표현 PD-1 팀-3와 36 개월 전반적인 생존 율 (데이터 표시 되지 않음). 우리는 또한 편도 선 파라핀 조직 (그림 1)에 트리플 immunostaining를 확인.
그림 1: 편도 선 파라핀 끼워 넣어진 조직에서 CD8-PD-1-팀-3 immunostaining. Cryopreserved 섹션 대신 섹션 트리플 immunostaining 선정 임베디드 조직 파라핀 Dewaxing 고 재 후 cryopreserved 섹션에 대 한 이전 개발 된 얼룩의 동일한 프로토콜 적용 되었습니다. CD8+ T 세포는 어린 싹 센터 밖에 서 있으며 표현 PD-1 비-+ CD8 T 세포는 어린 싹 센터에서 클러스터 된. 현미경 배율 20 배 이며 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 신장 세포 암 조직 표본의 분석 자동화. 밝은 분야 이미지에 조직 인식 후 (A, 스케일 바 1 m m), RGB (빨간색 파란색 녹색 기존의 형광)에 낮은 해상도 이미지 (B, 500 µ m 바 규모 필드 선택을 사용 하는 현미경 배율 x 4. 전체 빨간색 사각형 필드를 나타냅니다. 20 배 확대 multispectral 현미경에 의해 수행으로 고해상도 이미지 (multispectral 큐브 형광 이미지가이 기술에) (C, 눈금 막대 100 µ m) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Multispectral 현미경 및 소프트웨어 신장 세포 암 (현미경 배율 x 20)의 복합 이미지의 생성에 대 한 분석을 결합. 높은 해상도 raw 이미지 (A)는 형광 필터 큐브 여 multispectral 검색 후 필드의 형광 이미지. 파란 신호는 AF488, 레드 Cyanine 5 이며 녹색은 Cyanin3. 병합 등 다양 한 색상을 보여줍니다 노란색 3 fluorophores의 병합이 이다. 이 이미지는 이미지 분석 소프트웨어에 통합 됩니다. 스펙트럼 라이브러리 통합 각 fluorophore 및 형광 합성 이미지 (B)에 지도 하는 autofluorescence의 정확한 스펙트럼 분리를 수 있습니다. 운영자 대표 색상 선택: 블루 설명 Cyanine 5 (CD8), 레드 Cyanine 3 (PD-1), 녹색 AF488 (팀-3). 혼합 색깔 보라색 등 병합 CD8-PD-1 더블 긍정적인 사용 됩니다. 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: PD-1, 팀 3 식 종양 침투 CD8+ T 세포 형광 multispectral 이미징 기술 (현미경 배율 x 20)에 의해 분석 명확한 세포 신장 세포 암 종 견본에. (A) CD8 (파란색), PD-1 (빨강), 그리고 팀-3 (녹색) 했다 스테인드 RCC 환자에서 파생 된 언된 조직 단면도에. 이러한 세 가지 마커의 colocalization 모노 얼룩 사진을 병합 하 여 검색할 수 있습니다. Isotype 컨트롤은 각 실험에서 수행 했다. 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 노란색 공동 스테인드 셀을 식별 하는 상자: 팀-3- PD-1+ CD8 셀 및 PD 1 팀-3+ + CD8 셀. (B) 트리플 공동 CD8 위한 얼룩, PD-1, 그리고 팀-3 (병합) 상자 나타내는 왼쪽에 녹색 표시는 CD8 공동 표현 PD-1 또는 팀-3+ T 세포. 이미지 분석 소프트웨어와 함께 자동 계산에 대 한 셀의 id는 핵 얼룩 (DAPI);의 존재에 의존 셀 분할 또한 형태학 특성 빨간 경계 (중간 패널)로 표시 기반으로 합니다. 시각 수 색인 (오른쪽), 수행 됩니다 때까지 사용자가 자동화 된 형질, 후 훈련 알고리즘 식별 녹색 점 CD8 공동 표현 PD-1 팀-3+ T 세포, CD8로 레드 도트+ T 세포 표현 하지 않고 PD-1 CD8로 팀-3, 및 파랑 점+ T 세포 표현 하지 PD-1 또는 팀-3. 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 노란색 상자 표시 PD-1 또는 CD8 표현 팀-3+ T 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: multispectral 분석의 원시 데이터를 컴퓨팅. 데이터의 각 필드 (즉, 5 분야/환자, 즉, 5.txt 파일)에 있는 셀의 개수는 이미지 분석 후 수집 됩니다. R 스크립트만 셀을 신뢰 구간 > 55 %phenotyped 고려 5 필드 데이터를 결합 합니다. 현미경 배율 20 배 이며 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: PD-1+ + CD8 팀-3+ T 세포 표현 PD-1+ 팀-3- CD8 PD-1에 비해 높은 수준의+ T 세포 신장 세포 암 종. PD 1의 강도 감지 되 면 (왼쪽된 패널)의 세포 수준에서 PD-1+ 팀-3+ + 팀-3- CD8 PD-1에 스 라 면역 형광 분석+ T 세포. 개별 수준 (중간 패널): 결과 전체 CD8 표시 됩니다+ T 세포 부분 집합 PD-1+ + 팀-3 PD-1+ 팀-3- 현재 조직 섹션 (즉, 한 환자;에 대 만 휘트니 테스트)입니다. 말은 PD 1 강도 비교 분석 9 환자 (오른쪽 패널)의 시리즈에서 측정 되었다 (Wilcoxon 테스트, p-값 0.05로 중요 하 게 고려 되었다 보다 낮은). 현미경 배율 20 배 이며 눈금 막대 나타냅니다 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: PD L1 및 Gal-9 즉 PD-1, 팀 3 ligands 신장 세포 암 종에 얼룩. (A) 종양 세포 팬 각 질 얼룩에 의해 식별 됩니다. 공동 PD L1 및 팬-각 질 (패널)의 얼룩 PD-L1 87 분석에서 58 환자에서 종양 세포의 식을 식별 합니다. (B) Galectin-9 모든 RCC 환자 분석에서 15 종양에 표현 했다. 양성 세포의 10% 이상 분석 표식에 대 한 스테인드 했다 경우 고려 되었다. Isotype 컨트롤 각 얼룩에 포함 되었습니다. 노란색 상자 대표 긍정적인 종양 (팬-각 질 +) PD-L1 (패널 A) 또는 Galectin-9 (패널 B) 세포. 현미경 배율 20 배 이며 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| %/CD8+ T 세포 | PD-1+ | PD1+ 팀-3+ | PD-1+ 팀-3- |
| TNM | 0.04 | 0.003 | 0.22 |
| Furhman | 0.01 | 0.004 | 0.74 |
| 종양 크기 | 0.08 | 0.01 | 0.37 |
| UISS | 0.01 | 0.01 | 0.63 |
PD-1 혼자 또는 결합 된 팀-3에 CD8 표현 사이의 상관 관계 표 1:+ T 세포 및 RCC 환자의 임상 전조 매개 변수: p-값. PD-1+, PD-1+ 팀-3+ 또는 PD-1+ 팀-3- 에 CD8 비율+ T 셀 연속 변수 87 환자의 코 호트에서 면역 형광 제자리에 의해 측정 된 상관으로 선정 이진 (TNM, Fuhrman 학년, UISS 점수)으로 정의 하는 다양 한 임상 매개 변수와 함께 또는 연속 변수 (종양 크기). TNM은 두 그룹으로 분할 되었다: 지역화 질병 (pT1, pT2) 및 고급 질병 (pT3, pT4, N+, 또는 M+). Fuhrman 등급 낮은 정의 되었다 (등급 I 또는 II)와 높은 (등급 III 또는 IV)와 UISS 점수 (0, 1 및 2) 3 종류로 분할 되었다. P-값이 중요 한 상관 관계를 나타내는 굵게 표시 됩니다.
| CD8+ T 세포 부분 집합/CD8 | PD-1+ 팀-3+ | PD-1+ 팀-3- |
| 중간값 (%) | 34.7 | 8.6 |
| PFS와 상관 관계 | P = 0.046 | P = 0.8 |
PD-1 팀-3 공동 식 CD8 사이의 상관 관계 표 2:+ T 세포 그리고 진행 성 자유로운 생존. RCC 환자의 두 그룹 (n = 87) PD-1 팀-3 (오른쪽)의 비율에 따라 PD-1, 팀-3 (왼쪽) 중간에 상대는 개별화 했다. PFS와 상관 관계를 잘라 선정 중간값으로 되었다. P-값이 중요 한 상관 관계를 나타내는 굵게 표시 됩니다.
보충 표 1: TBS와 TBST의 구성 버퍼. TBS는 항 체의 혼합과 희석에 사용 됩니다. 워시, 모든 단계는 기본 항 체, TBST 좋습니다 다음 세척 제외 TBS와 함께 수행 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: 상세한 항 체 혼합 CD8-PD-1-팀-3 면역 형광 염색 법에 대 한 구성. 각 기본, 보조, 및 제 3 항 체 믹스에 대 한 TBS의 해당 볼륨에서 수행을 희석 1 mL의 전체 볼륨에 대 한 제공 됩니다. 하나의 슬라이드에 대 한 필요한 총 반응 볼륨 2 c m2의 조직 영역에 대 한 100 µ L입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
수정 및 문제 해결:
조직의 품질은 중요 한 매개 변수; 그것은 쉽게 되며 고 오신 채색에 의해 확인할 수 있습니다.
기술의 장점 중 하나는 다중화 된 stainings의 가능성 하지만 10 nm 최소의 델타 방출 파장을 선택 하는 것 권장 fluorophore 넘침을 방지 하려면. 여기, 우리가 4 stainings DAPI를 포함 하기 때문에, 우리는 하기로 파장 밖으로 확산 (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, Cyanine 3: 570 nm, Cyanine 5: 670 nm). 자동된 이미지 분석을 함께 혼합된 방출 신호에서 fluorophore의 순수한 스펙트럼을 계산 하는 소프트웨어를 사용 하 여 다양 한 fluorophores에서 신호를 중복의 위험을 피 한다. 모노 스테인드 슬라이드는 또한 스펙트럼 라이브러리 덕분에 보상으로 fluorophores 행위 사이 오버랩의 부재를 확인합니다.
때로는 하나의 셀에 하나의 표식에 대 한 양성 얼룩/형광 약한 인지 확인 하기 어려울 수 있습니다. 각 실험에 포함 하는 부정적인 제어 양성의 임계값을 결정 하는 좋은 방법입니다.
결합 된 소프트웨어 이미지를 분석 하는 데 사용, 셀의 양성을 결정 하기 위한 득점 단계 존재 하지만 그것만 동시에 두 개의 마커 분석할 수 있습니다. 우리는 같은 셀에 트리플 얼룩 수 있기 때문에 (CD8, PD-1, 그리고 팀-3), 형질 단계 선택.
형질 단계 힘 드는, 얼룩이 지 고 배경의 유형이 다른 하나의 샘플에서 변수 경우에 특히 될 수 있습니다.
기술의 한계:
경우에 공동-stainings의 수는 기존의 형광에 비해 장점, cytometry로 다양 한 색상을 분석할 수 아니다. 여러 마커의 colocalization 공부 하는 때에 특히 유의 confocal 현미경 검사 법에 비해 낮은 감도 대 한 (현미경 배율, 픽셀에 대 한 당 0.1 µ m 대 약 0.5 µ m x 20에 대 한 브랜드에 따라 confocal) 및 fluorophore 파급에 대 한 확인 (아래 중요 한 단계에서의 프로토콜, 참조).
기술의 큰 한계는 원시 데이터 형식입니다. 원시 데이터는.txt 파일을 사용 하 여 까다로운 수 있습니다. 표현 형에 대 한 ci 이미지 당 한.txt 파일을 제공 하는 소프트웨어, 거 대 한 시리즈의 환자 당 5 파일의 각각의 수동 치료에 매우 힘 드는 것입니다. 생물 정보학 전문가 통계 소프트웨어의 모든 데이터를 계산 해야 합니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
멀티플렉스 얼룩 분석은 쉽게 가능 합니다. 신선한 샘플을 분석, cytometry에 비해이 기술은 자동화 된 절차26 냉동된 샘플의 큰 동료에서 종양 microenvironment에 있는 다른 셀 하위 집합의 재현 방법에 급속 한 계산 허용 ,27. 우리는 자동으로 침투 하는 CD8 셀 수+ T 세포 표현 PD-1, 공동 표현 팀-3 나 RCC의 설정. 자동 카운트 재현할 수, 눈의 피로 등 여러 가지 편견을 방지 하 고 시간이 소요 되지 않습니다.
대형 코 호트 연구는 냉동된 샘플에 있었다면, 우리는 했다 회고전 데이터 그래서 우리 절대 번호 또는 백분율은 CD8의 링크 수+ T 세포 생물학 매개 변수 및 임상 결과 하위 집합. 다른28한 환자에서 면역 침투의 중요 한이 있기 때문에,이 보고만 MFI와 백분율 하지만 하지 침투 학년 fluorocytometry에 비해 이점을 나타냅니다.
형광 강도 각 셀에 대 한 양적 보고 되 고 다른 셀 구획 (막/세포질/핵)에 우리 PD-1 막에서 MFI에 의해 얼룩의 수준을 평가 수 있습니다. 이 cytometry와 비슷한 또 다른 재미 있는 도구를 나타냅니다. 우리 PD-1+ CD8 발견+ T 팀-3를 표현 하는 세포 PD 1의 더 높은 식 졌고 빈약한 예 지 (진행 성 자유로운 생존에 미치는 영향)과 관련 된 했다. 우리의 지식, 그것은 특정 셀 집합의 임상 중요성을 보여주는이 방법을 사용 하 여 첫 번째 연구 이다.
미래의 응용 프로그램:
응용 프로그램의 필드는 거 대 한입니다. 우리 또한 폐 암 종양의 microenvironment에 다른 특정 셀 집합 강조: 조직 상주 메모리 T 세포 라는 TRM (CD103+ CD49a+), 그리고 그들은 더 나은 전반적인 생존21,29와 상관 있다 ,30. 다른 작품에서는이 기술을 사용 하 여, 우리의 팀 PD L1 anaplastic 림프 종 키나 제 (ALK) 재배치와 폐암의 하위에 종양 세포에 overexpressed 했다 그리고이 식은 CD8 상관 했다 발견+ T10을 침투. 이 기술은 여러 컨텍스트에서 중요 한 생물 학적 매개 변수 평가 적합 하 고 바이오 마커 발견을 위한 유용한 도구를 나타낼 수 있습니다. Xy 좌표 부여 됩니다, 이후 지형 연구 셀 쉽게31와 상호 작용 하는 첫 번째 도구 중 하나입니다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계:
중요 한 단계 중 하나는 시간이 많이 소요 될 수 있는 공동 얼룩의 최적화입니다. 좋은 항 체의 선택은 중요 한, 예를 들어 여러 클론에서에서 테스트 된 팀-3에 대 한 현재의 경우. 또한, 몇 가지 조합을 시도 하는 것이 중요 하다 그래서 다른 fluorophores 동일한 표식에 대 한 다른 결과 줄 수 있습니다. 함께 반응 한다 항 체와 얼룩 특이성을 검사 하는 것이 좋습니다. 동시에 여러 fluorophores 분석 가능성에도 불구 하 고 모노 스테인드 슬라이드 유출 확인 것이 좋습니다. 또 다른 중요 한 단계는 신중 하 게 수행 매뉴얼 교육에 의존 하는 형질 단계가입니다.
총, 숙련 된 운영자에 의해이 다중화 기술 사용 하 여가 나타냅니다 이후 주변 혈액 분석 로컬 종양의 대표 될 수 없는 중요성의 이다 지역 면역 침투의 여러 셀의 하위 집합을 분석 하는 우아한 도구를 환경입니다.
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Disclosures
모든 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
이 작품은 인 국가 뒤 암 (잉카) (동부 표준시), 리그 죄수 르 암 (동부 표준시), 대학교 소 르 본 파리 시 테 (동부 표준시), ANR (Selectimmunco) (동부 표준시), Labex 면역-종양학 (동부), SIRIC CARPEM (CG, 동부 표준시)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. EdG은 Fondation 아크의 친교에 의해 투자 되었다. EV 및 CD APHP (증권 거래소 검색 대회)의 친교에 의해 투자 되었다. 조흥은 대학교 소 르 본 파리 시 테 (성립 박사)의 친교에 의해 자금이 다. 저자는이 프로젝트에 그들의 자금에 대 한 브리스톨 마이어스 스 퀴 브를 감사 합니다. 저자는 병원 Européen 조르주 퐁피두의 병 리 및 Necker (Laurianne 챔 블, 엘 로디 미셸 Gisèle Legall)의 부를 감사합니다. 저자는 PARCC, 병원 Européen 조르쥬 퐁피두 (코 린 Lesaffre)의 조직학 플랫폼을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24x60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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