دراسة ورم المكروية يمكن تحديد المؤشرات الحيوية تشخيصية أو التنبؤي للاستجابة السريرية للعلاج المناعي. قدم هنا، هو طريقة مبتكرة تستند إلى في الموقع الأسفار المتعددة الأطياف التصوير لتحليل وحساب تلقائياً مختلف الفئات السكانية الفرعية من CD8+ تي الخلايا. هذا الأسلوب استنساخه وموثوق به مناسبة لتحليلات فوج كبير.
الخلايا المناعية هي مكونات هامة لورم المكروية والتأثير على نمو الورم وتطور في جميع مراحل التسرطن. جدير بالذكر أن الآن ثبت أن التغلغل محصنة في الأورام البشرية يمكن أن ترتبط بالتشخيص والاستجابة للعلاج. تحليل ارتشاح محصنة في ورم المكروية أصبح تحديا رئيسيا لتصنيف المرضى والاستجابة للعلاج.
التعبير المشترك عن المستقبلات المثبطة مثل برنامج موت الخلية البروتين 1 (PD1؛ ويعرف أيضا باسم CD279) والسامة للخلايا اللمفاويات T المرتبطة البروتين 4 (كتلاً-4)، تي خلية الغلوبولين المناعي والميوسين التي تحتوي على البروتين-3 (تيم-3؛ ويعرف أيضا باسم CD366) واللمفاويات تنشيط الجين 3 (تأخر-3؛ المعروف أيضا CD223)، سمة مميزة لاستنفاد الخلايا T. لقد طورنا الفلورة مولتيباراميتريك في الموقع تلطيخ لتحديد وقياس على المستوى الخلوي التعبير المشترك عن هذه المستقبلات المثبطة. في سلسلة أثر رجعي من الأنسجة المجمدة من سرطانات الخلايا الكلوية (مجلس قيادة الثورة)، استخدام تكنولوجيا تصوير المتعدد الأطياف fluorescence مقترنة ببرنامج تحليل صورة، وأنه تم العثور على هذا التعبير المشارك PD-1 و 3-تيم على الورم تسلل CD8+ تي الخلايا يرتبط بسوء تشخيص في مجلس قيادة الثورة. لدينا المعرفة، ويمثل هذا الدراسة الأولى مما يدل على أن هذه الآلية التكنولوجيا المتعددة في الموقع قد يكون لها بعض الأهمية السريرية.
في السنوات القليلة الماضية، برز العلاج المناعي لعلاج العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك مجلس قيادة الثورة واعدة جداً. خاصة، مثل العلاج المناعي استناداً إلى تثبيط نقاط التفتيش المثبطة PD-1 وتم الإبلاغ عن 4 كتلاً تكون فعالة سريرياً1،2،3،،من45، 6-الأجسام المضادة ضد كتلاً-4، PD-1، أو برنامج الموت [ليغند] 1 (PD-L1) التي أقرت بالفعل في العديد من أنواع السرطان وتؤدي إلى استجابات سريرية طويلة الأمد في أكثر من 20 في المائة من المرضى7. ومع ذلك، ليس جميع المرضى من المستجيبين وتكلفة العلاج مرتفعة، وهذه العلاجات مواد سامة، مما يؤدي إلى احتمال آثار جانبية خطيرة في المناعة الذاتية مثل. ذلك التحدي الحالي لتحديد علامات التنبؤية لهذه إيمونوثيرابيس الجديدة. أبلغ عن معدل الطفرات في الورم أو التعبير عن PD-L1 مستويات intratumoral CD8+ تسلل خلية T ترتبط باستجابة سريرية. ومع ذلك، هذه الرابطة لا تزال ضعيفة للغاية للتوصية باستخدام هذه المؤشرات الحيوية السريرية في الممارسة السريرية باستثناء اختبار رفيق PD-L1 قبل إدارة بيمبروليزوماب في الخلية غير الصغيرة الرئة مرضى السرطان (NSCLC)8 ،،من91011،12. وقد ثبت أن التعبير المشترك عن العديد من المستقبلات المثبطة مثل PD-1، تيم 3، 3 متخلفة، وكتلاً-4، الحث النمط الظاهري استنفاد الخلايا ومقاومة للعلاج13،،من1415. منذ الدم الطرفية لا يمثل ورم المكروية، أنها ذات الأهمية العالية لتحليل السمات المظهرية للخلايا في الموقع. خلايا تي المشترك أعرب PD-1 و 3-تيم معروفة لتكون خلايا البصر وظيفيا في عدة سياقات13،،من1617. في هذه الدراسة، وأثر تنبؤاتها للتعبير المشترك عن المستقبلات المثبطة اثنين PD-1 وتيم-3 في CD8+ تي تم تقييم الخلايا.
تم أداء أعلى حتى الآن دراسة التعبير المشترك عن عدة علامات على الورم التسلل إلى الخلايا الليمفاوية (تيلس) أساسا بتحليل التدفق الخلوي، مما يجعل من الضروري العمل على أورام جديدة وتحليل استعادي النافية لذلك. مع التقليدية في الموقع تلطيخ، يمكن أن يؤديها تلطيخ واحد فقط في كل مرة، وليس من الممكن وصف نوع الخلية التي شاركت تعرب العلامات. على سبيل المثال، أعرب PD-L1 بالعديد من أنواع الخلايا للأورام المكروية، مما يجعل من الصعب على تعريف بواسطة immunohistochemistry التقليدية تحليل الخلايا التي تعرب عن PD-L1 هي أكثر صلة بالدراسات الارتباطية. في هذا العمل، قمنا بتطوير أسلوب الفلورة مولتيباراميتريك مبتكرة في الموقع مع العد الكمبيوتر للربط بين التعبير المشارك PD-1 و 3-تيم بورم في التسلل إلى CD8+ خلايا تي مع النتائج السريرية في مجلس قيادة الثورة. هذا الأسلوب له العديد من المزايا، بما في ذلك إمكانية لتحليل على مستوى خلية واحدة وعلامات متعددة في نفس الوقت باستخدام كاميرا متعددة الأطياف التي يمكن القبض على فترات محدودة > 10 نانومتر من خلال الكريستال السائل مرشحات18. وعلاوة على ذلك، هذا الإجراء التلقائية التي تمكن إمكانية تكرار مشغل بين نتائج وتحليل مختصر مقارنة بالتقنيات اليدوية19. وأفادت عدة دراسات في مجال السرطان، مقنعة ستينينجس العديد من الجزيئات المناعية مثل PD-1 و PD-L1 و CD8 في سرطان خلايا ميركل، وسرطان الرئة والرأس والرقبة سرطان20،،من2122، 23-عدد الخلايا الآلي ممكن مع التدريب من جانب المستخدم (الخطوة phenotyping). ويقاس الأسفار في المقصورات خلية مختلفة (نويات والسيتوبلازم والغشاء).
هنا، مجموعات فرعية مختلفة من الورم–تسلل CD8+ تي الخلايا تعرب عن PD-1 و/أو أحصى تيم-3 في مجموعة كبيرة من مجلس قيادة الثورة والنتائج كان يرتبط بدرجات الخطورة السريرية والمعلمات البقاء على قيد الحياة. كما أنه من الممكن لتحليل الغشاء fluorescence كثافة في القرار الخلوية مع كثافة Fluorescence يعني (MFI) البيانات مثل في الخلوي. وبقدر ما نعلم، وهذا يمثل أول الإبلاغ تنبؤاتها نتائج الدراسة باستخدام هذه التقنية استناداً إلى عدد مرات التصوير المتعدد الأطياف.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
نوعية الأنسجة معلمة هامة؛ أنه يمكن التحقق بسهولة من تلوين الهيماتوكسيلين وويوزين.
ميزة واحدة من هذه التقنية هو إمكانية ستينينجس متعدد، ولكن لتجنب امتداد فلوروفوري، يوصي باختيار الأطوال الموجية الانبعاثات مع د…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من du المعهد الوطني للسرطان (الإنكا) (ET)، الدوري الفرنسي le مكافحة السرطان (ET)، جامعة السوربون باريس Cité (ET)، الوكالة الوطنية للمعلومات (سيليكتيمونكو) (ET)، والأورام المناعية لابيكس (ET)، كاربيم SIRIC (الفريق الاستشاري، وآخرون). ومولت مجموعة المناقشة الإلكترونية على زمالة من “مؤسسة قوس”. EV ومؤتمر نزع السلاح كانت تمولها زمالة أفب (البورصة بحوث). وتمول ChB زمالة من جامعة السوربون باريس Cité (contrat الدكتوراه). يشكر المؤلفون بريستول مايرز سكويب لتمويلها في هذا المشروع. يشكر المؤلفون قسم علم الأمراض في مستشفى الأوروبي جورج بومبيدو ونيكر (لورين كامبل وميشيل الودي وليجال جيزيل). يشكر المؤلفون في منهاج علم الأنسجة باركك، “مستشفى الأوروبي جورج بومبيدو” (شركة Lesaffre كورين).
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |