Summary
Hydrodynamische Schweif Vene Injektion von Transposon-basierte Integration Vektoren ermöglicht stabile Transfektion von murinen Hepatozyten in-vivo. Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Protokoll für die Transfektion Systeme, die der langfristigen konstitutive Ausdruck von einem einzigen Transgen oder kombinierte konstitutiven und Doxycyclin-induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MiR-ShRNA in der Leber ermöglicht.
Abstract
In Forschungsmodelle von Leberkrebs, Regeneration, Entzündung und Fibrose sind flexible Systeme für in Vivo Genexpression und zum Schweigen bringen sehr nützlich. Hydrodynamische Schweif Vene Injektion Transposon-basierte Konstrukte ist eine effiziente Methode für die genetische Manipulation von Hepatozyten bei Erwachsenen Mäusen. Neben der konstitutiven Transgene Ausdruck kann dieses System für erweiterte Anwendungen, z. B. ShRNA-mediated Gene Knock-down-Implikation der CRISPR/Cas9 System induzieren Genmutationen oder induzierbaren Systeme verwendet werden. Hier präsentiert sich die Kombination von konstitutiven CreER Ausdruck zusammen mit induzierbaren Ausdruck ein Transgen oder MiR-ShRNA Wahl als ein Beispiel für diese Technik. Wir decken das mehrstufige Verfahren ausgehend von der Vorbereitung der Dornröschen-Transposon konstruiert, um die Injektion und die Behandlung von Mäusen und die Vorbereitung des Lebergewebes zur Analyse von Immunostaining. Das vorgestellte System ist eine zuverlässige und effiziente Vorgehensweise zu komplexen genetischen Manipulationen in Hepatozyten. Es ist besonders nützlich in Kombination mit Cre/LoxP-basierte Mausstämme und kann auf eine Vielzahl von Modellen in der Erforschung von Lebererkrankungen angewendet werden.
Introduction
Chronischer Lebererkrankung stellt eine große gesundheitliche Belastung weltweit1. Tierforschung Modelle sind wichtige Werkzeuge in der Studie von Lebererkrankungen und haben dazu beigetragen, die Leberregeneration, hepatischen Entzündung sowie Steatose und Leberkrebs2komplexe Fragen. Eine beträchtliche Anzahl von diesen Tiermodellen verlassen sich auf die gentechnische Veränderung von Leberzellen. Deshalb sind effiziente Werkzeuge zur Genexpression in Hepatozyten manipulieren hilfreich3. Bewährte Methoden wie die Zucht von gentechnisch veränderte Mausstämme oder die Erzeugung von viralen Vektoren für Hepatozyten Infektion sind entweder zeitaufwendig, Hafen Sicherheitsbedenken oder liefern schlechte Transgene Ausdruck in Hepatozyten in vivo 4 , 5. hydrodynamischen Schweif Vene Injektion (HTVI) ist eine alternative Methode zur in Vivo Transfektion von Hepatozyten ermöglicht einfach, schnell und kostengünstig Verhör der Genfunktion in der Leber. Für HTVI ist ein Vektor mit der gewünschten DNA-Sequenz in einem Volumen von Kochsalzlösung entspricht 10 % des Körpergewichts des injizierten Tieres aufgelöst. Die Lösung wird dann in die Rute Vene innerhalb von 5-10 s6injiziert. Herzzeitvolumen überschreiten, fließt die Kochsalzlösung aus der minderwertigen Vena Cava in die Leber Venen, führt zur Erweiterung der Leber und hydrodynamischen Transfektion von Hepatozyten7. Um stabile genomischen Integration zu erreichen, wurde die Methode mit Transposon-basierte Vektoren, wie die Schönheit -Transposon Schlafsystem kombiniert. Diese Systeme vermittelt die Rekombination von Ziel Vektoren mit genomischen Rekombination katalysiert durch ein schlafen Schönheit -Transposase8,9. Für Modelle der Leberfibrose oder Karzinogenese ist es oft wünschenswert, Overexpress oder Stille Gene zu bestimmten Zeitpunkten das Krankheitsmodell. Zu diesem Zweck Werkzeuge für induzierbaren Genexpression wie das Cre/LoxP-System oder Tetracyclin-induzierbaren gen Expressionssystems (Tet-On) können gebrauchte10sein.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für in Vivo Transfektion von murinen Hepatozyten mit HTVI ein Dornröschen Transposon-basiertes System. Zusätzlich ein Protokoll für stabil, konstitutive Expression des Transgens unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors, beschreiben wir eine erweiterte Vektorsystem, das konstitutive Tamoxifen-abhängige Cre-Rekombinase (CreER) Ausdruck mit vereint die induzierbaren Ausdruck eines Transgen oder MicroRNA angepasst ShRNA (MiR-ShRNA), genannt der pTC TET-System11. In dieses Vektorsystem werden induzierbaren transgene oder MiR-ShRNAs für Tetracyclin-abhängigen Ausdruck in den Backbone-Vektor mit einem recombinational Klonen-System ermöglicht die schnelle und einfache Generation neuen Vektoren12geklont. In diesem Video-basierte Führer werden Zubereitung von geeigneten Vektoren, Injektion und Behandlung von Mäusen, induzierbaren Transgen/MiR-ShRNA Ausdruck zu erreichen, und schließlich die Vorbereitung des Lebergewebes für die Analyse. In diesem Protokoll beschriebene Methode wurde entwickelt, um die Kombination eines Cre/LoxP vermittelte Maus Systems mit dem Ausdruck oder Knock-down-Wahl, so dass es ein allgemein einsetzbares System in der Forschung von Lebererkrankungen-gen zu aktivieren.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurde vom zuständigen Behörden (Regierung von Oberbayern, München und Stanford institutionelle Tier Pflege und verwenden Ausschuss genehmigt Stanford, CA, USA). Eine Liste der alle Plasmide zum Klonen (Schritt 1 bis 4) ist in ergänzenden Tabelle S1 zur Verfügung gestellt.
1. Klonen ein Transgen konstitutive Genexpression
- Design-Primer für Transgene Verstärkung13,14.
- Fügen Sie Restriktionsschnittstellen für PacI (TTAATTAA), 5'-Ende des Primers vorwärts. 5'-Ende des rückwärts-Primer Restriktionsschnittstellen für AscI (GGCGCGCC) oder FseI (GGCCGGCC) hinzufügen.
- Verstärken Sie Transgene durch PCR mit Hilfe von Bedingungen, die für die gewünschte Transgen14optimiert. Reinigen Sie mit einem im Handel erhältlichen DNA-Reinigung-Kit.
Hinweis: Glühen Zeit richtet sich nach den Primer im Schritt 1.1 entworfen., Dehnung Zeit richtet sich nach der Länge des Konstrukts. Zum Beispiel für ein Konstrukt von 1.000 bp Länge Verwendung 60 s Dehnung Zeit. - Verdauen Sie Transgen und Vektor für konstitutive gen Ausdruck15 mit jeweiligen Einschränkung Nukleasen (siehe Schritt 1.2) und Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µL bei 37 ° C über Nacht. Zum Beispiel, verdauen Konstrukt mit 5 Einheiten PacI und 5 Einheiten FseI gegebenenfalls (siehe Schritt 1.2).
- Gel reinigen verdauten Vektor und Insert mit einem kommerziellen Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie eine standard Ligatur der 100 ng des Vektors und 100 – 1.000 ng Insert mit 400 U T4 Ligase bei 14 ° C 16 h Wärme inaktivieren bei 65 ° C für 10 Minuten.
- Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.
- Platte auf Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin. Inkubation bei 30 ° C für 24 h.
- Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Miniprep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und überprüfen Sie die Reihenfolge von Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Grundierung: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Verwenden Sie positive Kolonien für Maxi Verstärkung von Plasmid DNA zu skalieren und reinigen, mit einem Endotoxin-freie Plasmid Vorbereitung Kit18 gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Konstrukt ist fertig für die Injektion, so fahren Sie mit Schritt 5 fort.
2. Klonen ein Transgen induzierbaren Genexpression
- Design-Primer für Transgene Verstärkung13,14.
- 5'-Ende des Primers vorwärts Restriktionsschnittstellen für SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) oder KpnI (GGTACC) hinzufügen. 5'-Ende des rückwärts-Primer Restriktionsschnittstellen für NotI (GCGGCCGC) oder XhoI (CTCGAG) hinzufügen.
- Verstärken Sie Transgene durch PCR mit Hilfe von Bedingungen, die für die gewünschte Transgen14optimiert. Reinigen Sie mit einem kommerziellen DNA-Reinigung-Kit.
- Die gereinigten Transgen und 4 µg Eintrag Vektors zu verdauen (pEN_TTmcs-Vektor, siehe Tabelle der Materialien)19 separat mit entsprechenden Einschränkung Nukleasen (siehe Punkt 2.2) und Puffer in einem Gesamtvolumen von 50 µL bei 37 ° C über Nacht.
- Gel reinigen verdauten Vektor und Insert mit einem kommerziellen Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie standard Ligatur mit 100 ng des Vektors und 100 – 1.000 ng Insert mit 400 U T4 Ligase bei 14 ° C 16 h Wärme inaktivieren bei 65 ° C für 10 Minuten.
- Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.
- Platte auf Agar-Platten mit 15 µg/mL Gentamicin. Inkubation bei 37 ° C 16 h.
- Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid DNA zu reinigen und überprüfen einfügen durch Sequenzierung17 mit dem pCEP forward Primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Hinweis: PCR auf einzelne Kolonien kann durchgeführt werden, ohne vorherige Reinigung mit Primer pCEP vorwärts und pCEP umkehren (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Dieser Schritt kann nützlich für die Vorauswahl der positiven Kolonien. - Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
(3) Klonen von einer MiR ShRNA für induzierbarer Gene Knock-down
- MiR-ShRNA Oligonukleotide nach dem Klonen Protokoll19pSLIK zu entwerfen. Tempern Sie und reinigen Sie Oligonukleotide und verdünnen Sie 01:20 in DdH2O.
- Digest 3 µg Eintrag Vektors mit 5 U BfuAI bei 50 ° C für 3 h dann inaktivieren die Reaktion bei 65 ° C für 20 Minuten.
Hinweis: Wenn Co Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) gewünscht wird, verwenden Sie pEN_TTGmiRc19 , als ein Eintrag Vektor, sonst Verwendung pEN_TTmiRc219. - Gel reinigen verdauten Vektor wie in Schritt 2.5. Führen Sie standard Ligatur der 100 ng des Vektors und 1 µL gereinigt und verdünnt ShRNA Oligonukleotide (Schritt 3.1) mit 400 U T4 Ligase bei Raumtemperatur für 1 h Wärme bei 65 ° C für 10 Minuten inaktivieren.
- Zuständigen Bakterien mit einer standard-Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.
- Platte auf Agar-Platten mit 15 µg/mL Gentamicin. Inkubation bei 37 ° C 16 h.
- Wählen Sie einzelne Kolonien, Plasmid DNA zu reinigen und überprüfen Einfügen von Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Grundierung: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
4. recombinational Klonen um bereit für Injection-Klone zu erzeugen
- Mix-150 ng Eintrag Vektors (aus Schritt 2 oder Schritt 3) und 150 ng von pTC-TET-Vektor-20.
- Hinzufügen ein Gesamtvolumen von 8 µL TE-Puffer (pH = 8).
- Die LR-Clonase-Enzym-Mix II (siehe Tabelle der Materialien) zu Eis, inkubieren 2 min. Vortex zweimal zu übertragen.
- Die Reaktion 2 µL der LR-Clonase-Enzym-Mix II hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 1 h.
- Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 µL Proteinase K-Lösung. Inkubation bei 37 ° C für 10 Minuten.
- Stbl3 zuständigen Bakterien mit 2 µL recombinational Klonen Mischung mithilfe einer standard Hitze-Schock-Protokoll16zu verwandeln.
- Platte auf Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin. Inkubation bei 30 ° C für 24 h.
- Wählen Sie einzelne Kolonien, reinigen Sie Plasmid-DNA mit Hilfe einer Endotoxin-freie Plasmid Vorbereitung Kit18 gemäß den Anweisungen des Herstellers zu und bestätigen Vektor Integrität durch Sanger-Sequenzierung17 (Sequenzierung Primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Konstrukt ist fertig für die Injektion, fahren Sie mit Schritt 5 fort.
5. Vorbereitung Lösung für hydrodynamische Tail Vene Injektion
Hinweis: Vorbereitung der Konstrukte für die konstitutiven und induzierbaren Genexpression in Schritt 1, 2, 3 und 4 beschrieben.
- Injektion sterilen 0,9 % Kochsalzlösung vorbereiten (tun Sie nicht Gebrauch PBS). Verwenden Sie Volumen entspricht etwa 10 % des Körpergewichts Maus. Beispiel: für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g, bereiten Sie 2 mL der Lösung vor.
- Bereiten Sie die Injektion Vektoren, die gereinigt wurden mit einem Endotoxin-freie Plasmid Reinigung Kit18 (siehe Schritt 1,8 oder 4,8, beziehungsweise).
- Fügen Sie 10 µg oder 15 µg von Endotoxin-freie Dornröschen Vektor Konstrukt (aus Schritt 1 Einsatz 10 µg aus Schritt 4 Verwendung 15 µg, beziehungsweise) und 1 µg von Endotoxin-freien pc-HSB521 pro mL steriler Kochsalzlösung.
- Shop-Lösung für bis zu 4 h bei 4 ° C. Nicht einfrieren.
6. Durchführung der hydrodynamischen Tail Vene Injektion
- Verwenden Sie eine einschränkende Injektionslösung Schweif Vene (kommerzielle oder aus einem 50 mL konische Rohr mit Löchern für die Atmung und die Rute bereit). Füllen Sie Boden des Röhrchens mit Seidenpapier.
- Zur Injektion verwenden Sie Mäuse von ca. 8 – 10 Wochen alt mit Gewichten von 20 – 25 g.
- Mäuse vor der Injektion zu wiegen und bereiten Injektionsvolumen nach dem Körpergewicht (entspricht 10 % des Körpergewichts, siehe Punkt 5.1). Bereiten Sie eine sterile 3 mL-Spritze mit einer 27 G-Nadel für Einspritzung und füllen sich mit der erforderlichen Menge.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in die Restrainer. Passen Sie die Höhe der Tissue-Papier (siehe Punkt 6.1), nur minimalen Raum für Bewegung lassen aber genügend Platz zum Atmen.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus regelmäßig atmet.
- Warm die Rute mit einer Infrarotlampe für 30-60 s. sorgfältig achten Sie auf Anzeichen einer Überhitzung.
- Reinigen Sie das Heck mit einem Alkoholtupfer.
- Stechen Sie die Nadel fast horizontal in einer der zwei seitlichen Schweif Venen in der Nähe der Schwanzwurzel.
Hinweis: Wenn erfolgreich, könnte eine kleine Menge Blut zurück in den Konus der Nadel fließen. Es empfiehlt sich nicht aktiv abzusaugen, da jede zusätzliche Bewegung der Nadel zu seiner Vertreibung und/oder Verletzung der Vene führen kann. - Injizieren Sie das Gesamtvolumen in den Schweif Vene innerhalb von 8-10 s.
- Entfernen Sie sofort die Maus aus die Restrainer. Komprimieren der Injektion gewickelt für mindestens 30 s oder bis eine Blutung nachlässt.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem separaten Käfig. Sobald die Maus aus dem Verfahren (ca. 30 – 60 min) erholt hat, übertragen Sie die Maus zurück zu seinem ursprünglichen Käfig. Schauen Sie auf die Maus regelmäßig für die nächsten 24 h.
Hinweis: Leichter Sedierung der Maus wird routinemäßig für bis zu 2 Stunden nach der Injektion beobachtet. - Warten Sie bevor Sie mit weiteren Experimenten (d.h. Schritt 7) 10-15 Tage für die Abfertigung von nichtintegrierten Vektoren.
(7) Induktion von transfizierten CreER mit Tamoxifen
Achtung: Tamoxifen ist schädlich kann, Krebs oder Fruchtbarkeit Schaden. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
- Planen Sie intraperitoneale Tamoxifen Injektionen an drei aufeinanderfolgenden Tagen.
- Am 1. Tag 10 mg Tamoxifen in 40 µL Ethanol zu lösen. Inkubieren Sie bei 55 ° C für 10 min. Vortex mehrere Male, bis die Tamoxifen aufgelöst hat.
- Nachfüllen Sie 960 µL Maisöl. 5 min. bei 55 ° c inkubieren Vortex mehrmals, um eine eindeutige Lösung zu erhalten.
- Bereiten Sie die Lösung in einer 1-mL Insulin-Spritze mit einer Nadel 27 G.
- SCRUFF der Maus durch den Hals der Maus vorsichtig mit dem Daumen und dem zweiten Finger greifen Befestigung das Heck zwischen der Hand und den vierten und fünften Finger.
- Injizieren Sie 0,1 mL (= 1 mg Tamoxifen) der Lösung intraperitoneal in der linken unteren Quadranten des Abdomens.
- Wiederholen Sie die Injektionen an den Tagen zwei und drei.
8. die Induktion der Tetracyclin-abhängige gen oder ShRNA Ausdruck
Achtung: Doxycyclin kann schädlich sein. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
Hinweis: Je nach Art und Dauer des Experiments, Doxycyclin in Trinkwasser (Schritt 8.1) oder Chow (Schritt 8.2) lieferbar
-
Für kurzfristige Experimente (< 10 Tage) Doxycyclin über das Trinkwasser über das folgende Protokoll zu verwalten.
- 5 g Saccharose in 100 mL Wasser auflösen. Autoklaven.
- 100 mg Doxycycline Hyclate in 5 mL Zuckerlösung (Schritt 8.1.1) in einem 15 mL konische Rohr zu lösen.
- Eine 10-mL-Spritze, Sterilfilter die Lösung durch einen 0,2 µm-Filter verwenden. Hinzufügen der Saccharose-Lösung im Schritt 8.1.1 vorbereitet.
- Doxycyclin-Zuckerlösung als Trinkwasser für die Maus zu liefern. Überprüfen Sie täglich und ersetzen, wenn die Lösung trüb Angabe bakterielle Überwucherung (ersetzen klare Lösung nach spätestens drei Tagen) wird.
- Für langfristige Experimente (> 10 Tage) oder Experimente, die empfindlich auf metabolische Veränderungen verwenden kommerzielle Doxycyclin-Chow (z.B.Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg), Dehydrierung und/oder Saccharose-induzierten Veränderungen in der Leber von behandelten Tieren zu vermeiden.
9. Vorbereitung der Maus Leber für die Analyse von Immunostaining
Achtung: Paraformaldehyd kann schädlich sein. Entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.
Hinweis: Das Timepoint wenn Mäuse analysiert werden richtet sich auf das Experiment. Es wird empfohlen, nach nicht weniger als drei Tagen Doxycyclin Behandlung Sicherstellung ausreichender Induktion von Transgen oder ShRNA Ausdruck Lebergewebe zu analysieren.
- Bereiten Sie eine 1 mL Spritze mit einer 27 G Nadel mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd Lösung (PFA).
- Die Maus durch eine geeignete Methode nach einem genehmigten Prüfplan Tier einschläfern.
Hinweis: Richtlinien für die geeigneten Methoden der Euthanasie variieren je nach Hochschule. - Öffnen Sie die Bauchhöhle mit sezierenden Schere und anatomische Pinzette sorgfältig mit eine mediane Laparotomie, die Leber verfügbar zu machen. Bewegen Sie den Dünndarm nach rechts, um die Pfortader und der unteren Hohlvene (IVC) aussetzen.
- Stechen Sie die Nadel der Spritze vorbereitet (siehe Punkt 9.1) in die IVC und Schnitt die Pfortader. Injizieren Sie 1 mL der PFA in die IVC perfundieren das Lebergewebe und entfernen Auto-fluoreszierende Erythrozyten (wünschenswert, wenn immunofluorescent Färbung durchgeführt wird) langsam.
- Entfernen Sie die Leber. Spülen Sie mit Wasser und übertragen Sie auf 5 – 10 mL 4 % PFA-Lösung.
- Für Paraffin Abschnitte ist Fix Gewebe für 36 – 48 h Gewebe bereit für Dehydrierung und Paraffin einbetten.
-
Fix für Gefrierschnitte, Gewebe in 4 % PFA für 1 h.
- Für Cryoprotection auf 10 % Saccharoselösung übertragen. Inkubieren Sie 60 min.
- Auf 20 % Saccharoselösung übertragen. Inkubieren Sie 60 min.
- Transfer zum 30 % Saccharoselösung. 12 – 16 h. Embed Einbettung zusammengesetzte für Gefrierschnitte inkubieren und Einfrieren bei-20 ° C.
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Representative Results
Transfection Wirksamkeit durch hydrodynamische Schweif Vene Injektion: Der Anteil der murinen Hepatozyten, die von einer einzigen Injektion hydrodynamisch transfiziert sind ist variabel und hängt von mehrere Parameter wie Einspritzmenge, Einspritzzeit, Menge des injizierten DNA und Größe des injizierten Konstrukt6, 22,23. Darüber hinaus ist die Transfektion Effizienz bei größeren Tieren, wo eine größere vaskuläre Durchmesser sowie sinusförmige Großraum führt zu einem Rückgang der Gesamtdruck in der Regel niedriger. Um Transfektion Effizienz zu visualisieren, wurde HTVI eines CreER Transposon Konstrukts Mäuse beherbergen ein Rosa26mTmG Reportergen gefolgt von Tamoxifen-vermittelte Aktivierung des Konstrukts CreER durchgeführt. Niedrigen Einspritzmenge oder längere Einspritzzeit für aus technischen Gründen führt zu reduzierten Transfektion Effizienz mit nur wenigen transfizierten Hepatozyten in die gesamte Leber nachweisbar, während höhere Transfection optimale Einspritzbedingungen ergeben Effizienz durch Reporter Färbung nach HTVI ein CreER Transposon (Abbildung 1A) dargestellt. Um die Transfektion Wirksamkeit zu beurteilen, wird Immunostaining der transfizierten Transgen oder – wie im Fall von CreER - von einem geeigneten Reportergen dringend empfohlen. Alternativ könnte Transfection Leistungsfähigkeit von mRNA Expressionsanalyse des Transgens transfizierten geschätzt werden.
Transfektion von Pericentral Hepatozyten: Nach der hydrodynamischen Injektion führen ein Druckgefälle entlang der sinusförmigen Raum - wo der Druck in der Nähe der Zentralvene höchste und die niedrigste in der Periportal areal ist - bevorzugte Transfektion im Bereich Pericentral. Wir Leber mit einem geringen Anteil des Transgens exprimierenden Hepatozyten analysiert und bewertet ihre relative Position in der Leber Lobule von co-Immunostaining für Glutamin Synthestase (GS), ein Marker für Pericentral Hepatozyten. Interessant ist, die Mehrheit der Hepatozyten, die Reporter Genexpression zeigte, nachdem HTVI eines Konstrukts CreER rund um die zentrale Vene aber nicht Portalbereich (Abbildung 1 b) zeigt höheren Transfection Effizienz rund um die zentrale Vene gruppierten.
In vivo nach HTVI eine Luciferase Transposon imaging: Um festzustellen, ob die Urschrift Integration nach HTVI Transposon24 Konstrukte zu beobachten ist injiziert ausreichend für in-Vivo imaging, wir ein Transposon-Konstrukt beherbergen eine Luciferase Expressionskassette unter der Kontrolle einer bestimmten Leber Veranstalter-Konstrukt. Mäuse wurden mit Luciferin injiziert und über ein in-Vivo imaging-System zwei Wochen nach HTVI (Abbildung 2A) abgebildet. Bildgebung zeigte robuste und stabile Luciferase Biolumineszenz in der Leber 15 Tage nach der Injektion und zu späteren Zeitpunkten (Abb. 2 b und Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass das System erfolgreich eingesetzt werden kann, das Vorhandensein von transfizierten Zellen in Vivo zu folgen durch Biolumineszenz-Bildgebung.
Kombiniert CreER und induzierbaren Transgen oder ShRNA Ausdruck: Wir zuvor generiert ein Transposon-Konstrukt, das die konstitutive Expression von einen induzierbaren Cre-Rekombinase (CreER) mit induzierbaren Ausdruck ein Transgen oder eine ShRNA Wahl20 (Abb. 3A kombiniert). Injektion von diesem Konstrukt in Rosa26mTmG-Reporter Mäuse und CreER Aktivierung durch Tamoxifen zeigte robuste Expression des Reportergens vergleichbar mit den Ergebnissen mit einem Transposon-Konstrukt für einzelne Transgene Ausdruck ( Abb. 3 b). Nach der Behandlung mit Doxycyclin kann induzierbaren Transgene Ausdruck durch geeignete Antikörper in transfizierten Hepatozyten (Abbildung 3) visualisiert werden. Für induzierbaren ShRNA Ausdruck empfiehlt die Verwendung von GFP-ShRNA Konstrukt wie zytoplasmatischen GFP Ausdruck von Immunostaining erkannt als ein Surrogat-Marker für ShRNA Ausdruck (Abbildung 3D) verwendet werden kann. Der Hinweis ist Transgen oder ShRNA Ausdruck, bzw. nur nachweisbar in einer Teilmenge von Hepatozyten, die aufgrund der relativ hohen Protein-Expression zur Erkennung von Immunostaining20erforderlich sein könnten.
Abbildung 1: Transfektion von Hepatozyten durch HTVI. (A) Variable Transfektion Effizienz nach HTVI CreER-Transposon in Mäuse beherbergen eine Rosa26mTmG / + Reporter und anschließender Behandlung mit Tamoxifen. Transfizierte Hepatozyten sind positiv für Membrane-springen grün fluoreszierendes Protein (GFP, grün). (B) Co Färbung für CreER aktiviert Hepatozyten (grün) bei Mäusen beherbergen einen Rosa26mTmG Reporter mit der Zentralvene Marker Glutamin Synthestase (GS, rot). Hier PV: Pfortader, CV: zentrale Vene. Maßstabsleisten darstellen 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: In-Vivo Bildgebung der Luciferase. (A) Transposon konstruieren, enthält eine Luciferase Expressionskassette (nicht maßstabsgetreu dargestellt). Injektion und Behandlung Schema zur Visualisierung der hepatischen Luciferase Ausdruck. SB: sleeping Beauty Anerkennung Websites, HTVI: hydrodynamische Schweif Vene Injektion. (B) repräsentatives Bild der hepatischen Luciferase Biolumineszenz 15 Tage nach HTVI ein Transposon-Luciferase-Konstrukt zusammen mit pHSB5 über ein in-Vivo imaging-System. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: kombinierte CreER und induzierbaren gen/ShRNA Ausdruck. (A) Transposon Konstrukt für die Expression der induzierbaren Cre-Rekombinase zusammen mit Ausdruck eines Tetracyclin-induzierbaren Transgen oder ShRNA (pTC Tet), nicht maßstabsgetreu gezeichnet. (B) grüne Membran Färbung zeigt transfizierte Hepatozyten nach Injektion des pTC Tet Konstrukt in Rosa26mTmG / + Reporter Mäuse und CreER Aktivierung mit Tamoxifen. Maßstabsleiste entspricht 100 µm. (C) induzierbaren Genexpression 5 Tage nach Doxycyclin Behandlung von Immunostaining für das Transgen (YAP, rot) in transfizierten Hepatozyten visualisiert werden kann. (D) induzierbaren MiR ShRNA Ausdruck 5 Tage nach Doxycyclin Behandlung von zytoplasmatischen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Färbung des GFP-ShRNA Konstrukts angegeben. Transfizierte Hepatozyten werden durch Membrane-springen GFP dargestellt. Skalieren Sie Bars in C) und D) sind 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Transfektion von Hepatozyten mit hydrodynamischen Schweif Vene Injektion ist eine etablierte Methode seit seiner Einführung vor mehr als 15 Jahren geworden6. Das injizierte Volumen übersteigt das Herzzeitvolumen und der Sinusoide der Leber7, führt zur Transfektion von etwa 10-20 %, in einigen Fällen bis zu 40 % der Hepatozyten25,26von der minderwertigen Vena Cava mündet. Prädiktoren für eine erfolgreiche Transfektion sind das injizierte Volumen pro injizierten Zeit22,23. Daher ist eine geringe Transfektion Effizienz (Abbildung 1A, linken) in der Regel aufgrund des Ausfalls der Einspritzgeschwindigkeit in dem Verfahren7weiterhin. Selbst mit einer optimalen Technik bleibt die Transfektion Effizienz, die durch HTVI erreicht werden kann jedoch unter der Quote durch die virale Infektion mit Adenoviren oder Adeno-assoziierten Viren, die fast 100 %5,27 erreichen können . Um erfolgreiche Schweif Vene Injektionen zu erreichen, ist es wichtig, eine stabile Positionierung der Nadel in den Blutgefäßen zu gewährleisten. Dies lässt sich in Adern mit größerem Durchmesser näher an der Schwanzwurzel. Dilatation der Vene durch die Erwärmung das Protokollfragment wird darüber hinaus dringend empfohlen. Die besten Ergebnisse werden mit einer Infrarotlampe erreicht, aber ein nicht-Infrarot-Wärmelampe oder Eintauchen der Rute in warmem Wasser kann auch verwendet werden. In einigen Fällen Ergänzung bis zu 200 µL der Saline durch intraperitoneale Injektion ca. 30 Minuten vor HTVI die Flüssigkeitszufuhr Status der Tiere, die Dilatation der Blutgefäße führt verbessern wird. Um eine konstante Einspritzgeschwindigkeit zu erhalten, sollte Ende der Maus gründlich zurückgehalten werden, vermeiden jede Bewegung der Rute, die Verschiebung der Nadel führen kann. Zur Validierung empfehlen wir ein Konstrukt, das durch Immunostaining nachgewiesen werden kann. Alternativ Transfektion Wirksamkeit von mRNA Ausdruck Analyse abgeschätzt werden oder Sequenzierung der DNA28integriert.
Unsere Daten zeigen, dass Transposon Integration vorzugsweise im Bereich der Leber Lobule Pericentral beobachtet wird. Die vorherrschende Transfektion von Hepatozyten um die Zentralvene ist wahrscheinlich wegen der einzigartigen Hämodynamik HTVI, wie es auch in nicht-Transposon basierend Transfektion29beobachtet wird. Dieser Befund könnte für einige Anwendungen wie Induktion von akuten Leberschäden durch CCl4, von Bedeutung, die betrifft vor allem Pericentral Hepatozyten. Im Rahmen der niedrigen Transfektion Effizienz könnte CCl4 Behandlung daher zu signifikanten Verringerung der Zahl der transfizierten Hepatozyten führen. Darüber hinaus ist HTVI von begrenztem Nutzen an Zielzellen Periportal einschließlich Gallengang Zellen15.
Neben Systemen, die HTVI Transposon Konstrukte um stabile Expression von einem einzigen Transgen zu erreichen nutzen, haben wir vor kurzem ein System, das die Co Meinungsäußerung CreER und induzierbaren Ausdruck eines Gens oder einer MiR ShRNA aus einem einzigen Vektor11 . Dieses System ist besonders nützlich, um bestimmte Gene in Cre/LoxP-basierte Mausstämme zu verhören. Wie transgene oder ShRNA Konstrukte durch eine schnelle und zuverlässige recombinational Klonen Verfahren eingeführt werden, kann das System leicht für das screening von Ansätzen angepasst werden. Das Vektorsystem vermittelt zuverlässige induzierbaren Ausdruck in Vivo , die die Lieferung von Doxycyclin11,30völlig abhängig ist. Dieser praktische Leitfaden videobasierte enthält detaillierte Anweisungen von Klonen von geeigneten Vektoren über Induktion der Genexpression zur Analyse des Lebergewebes.
Aber, um die Effizienz des Systems zu gewährleisten, verschiedene Aspekte sollte im Verstand gehalten werden: um langfristig Ausdruck zu erhalten, ist genomischen Integration an TA-Standorten von Dornröschen Transposase8,11vermittelt. Da Integration Effizienz Transposon Größe abhängt, ist es wichtig, die Größe des Transgens Konstrukts im Auge zu behalten, beim Entwerfen von Vektor-31. Darüber hinaus ist Ausdruck Effizienz der induzierbaren Genprodukt in der Leber abhängig von der rtTA3-Promotor-11. Verwenden Sie für optimalen Ausdrucksergebnisse eines Konstrukts Vektor mit einer Leber spezifischen ApoE.HCR.hAAT-Promotor wird empfohlen (Addgene #85578), da es die höchste Effizienz im Vergleich der drei Promotoren11zeigt. Mit einer optimierten Promoter-Konstrukt kann induzierbaren Transgen/ShRNA Ausdruck von Immunostaining in bis zu 30 % der transfizierten Zellen20erkannt werden. Gäbe es induzierbaren Protein-Ebene unterhalb einer bestimmten Schwelle, die für die Erkennung von Immunostaining erforderlich ist, muss dies ermittelt werden. Wichtig ist, kann kein Transgen/ShRNA Ausdruck von Immunostaining bei Mäusen erkannt werden, die mit Doxycyclin nicht behandelt wurden. Schließlich ist die Expression von Genen unter Kontrolle der Tetracyclin-Response-Element (TRE) abhängig von der Dosis von Doxycyclin32,33. Für kurzfristige Experimente ist Doxycyclin Verabreichung über das Trinkwasser gut etablierte34,35. Saccharose ist in der Regel hinzugefügt, um einen besseren Geschmack zu geben. Allerdings kann dies zu Polydipsie und Austrocknung führen, und der Einsatz von Doxycyclin Chow ist sehr empfehlenswert für langfristige Experimente36,37.
Zusammenfassend ist hydrodynamische Schweif Vene Injektion eine weithin etablierte Methode in der Leber Forschung. Seine Anwendung reicht von Studien von Hepatitis B Leber Fibrose oder hepatozellulären Karzinom Modelle38,39,40,41. In diesem Manuskript beschriebene System eignet sich besonders in der Befragung der spezifischen Zielgene in Cre/LoxP-basierte Modelle von Lebererkrankungen. Überexpression in der Leber kann darüber hinaus auch für die Forschung der hämatologischen Krankheiten42,43 oder gegen immunologische Fragen44,45verwendet werden. Über die Analyse bestimmter Gene von Interesse kann das vorgestellte System auch leicht angepasst werden, zum screening oder Multiplexen Ansätze. Dieses Video-basiertes Handbuch wird daher für eine große Gemeinschaft von Forschern hilfreich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Krebshilfe, Deutschland (Grant-Nummer 111289, UE), Lucile Packard Foundation für die Gesundheit von Kindern (Ernest und Amelia Gallo ausgestattet Postdoctoral Fellowship - CTSA Grant-Nummer UL1 RR025744, UE) unterstützt. Wir danken Dr. Mark A. Kay für Vektor-Konstrukte und experimentelle Beratung und Dr. Julien Sage für Mäuse und experimentelle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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