Summary
Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde integratie vectoren kan stabiele transfectie van lymfkliertest hepatocyten in vivo. Hier presenteren we een praktische protocol voor Transfectie systemen waarmee de langdurige constitutieve uitdrukking van een enkele transgenic of gecombineerde constitutieve en doxycycline-afleidbare expressie van een transgenic of miR-shRNA in de lever.
Abstract
In onderzoeksmodellen van leverkanker, regeneratie, ontsteking en fibrose zijn flexibele systemen voor in vivo genexpressie en zwijgen zeer nuttig. Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde constructies is een efficiënte methode voor genetische manipulatie van hepatocyten in volwassen muizen. Naast constitutieve transgenic expressie, kan dit systeem worden gebruikt voor meer geavanceerde toepassingen, zoals gene shRNA-gemedieerde knock-down, implicatie van het CRISPR/Cas9-systeem voor het opwekken van genmutaties, of afleidbare systemen. Hier, is de combinatie van constituerende CreER expressie samen met afleidbare uitdrukking van een transgenic of miR-shRNA van keuze gepresenteerd als een voorbeeld van deze techniek. We hebben betrekking op de procedure van de scriptingregel vanaf de voorbereiding van het Doornroosje-transposon construeert, aan de injectie en de behandeling van muizen, en de voorbereiding van leverweefsel voor analyse door immunokleuring. Het systeem gepresenteerd is een betrouwbare en efficiënte aanpak om te bereiken van complexe genetische manipulaties in hepatocyten. Het is bijzonder nuttig in combinatie met Cre/loxP gebaseerde muis stammen en kan worden toegepast op een verscheidenheid van modellen in het onderzoek van de leverziekte.
Introduction
Chronische leverziekte presenteert een belangrijke gezondheid last wereldwijd1. Dierlijk onderzoeksmodellen zijn essentiële instrumenten in de studie van de leverziekte en hebben geholpen om complexe vragen in lever regeneratie, hepatische ontsteking, en steatosis, alsmede leverkanker2te beantwoorden. Een aanzienlijk aantal van deze dierlijke modellen, is afhankelijk van de genetische modificatie van levercellen. Efficiënte tools voor het manipuleren van genexpressie in hepatocyten zijn daarom nuttig3. Gevestigde methodes zoals het kweken van genetisch gemanipuleerde muis stammen of het genereren van virale vectoren voor hepatocyte infectie zijn beide tijdrovend, haven bezorgdheid over de veiligheid, of oogst van arme transgenic expressie in hepatocyten in vivo 4 , 5. hydrodynamische staart veneuze injectie (HTVI) is een alternatieve methode voor in vivo transfectie van hepatocyten toestaan voor gemakkelijk, snel en kostenefficiënt ondervraging van de genfunctie in de lever. Voor HTVI, wordt een vector die de gewenste opeenvolging van DNA opgelost in een volume zoutoplossing overeenkomt met 10% van het lichaamsgewicht van het dier, ingespoten. De oplossing wordt vervolgens geïnjecteerd in de ader van de staart binnen 5-10 s6. Meer dan de cardiale output, mondt de zoutoplossing van de vena cava inferior uit in de lever aderen, wat leidt tot uitbreiding van de lever en hydrodynamische transfectie van hepatocyten7. Om te bereiken van stabiele genomic integratie, heeft de methode transposon gebaseerde vectoren, zoals het transposon sleeping beauty -systeem zijn samengevoegd. Deze systemen bemiddelt de recombinatie van doel vectoren met genomic recombinatie sites gekatalyseerd door een sleeping beauty -transposase8,9. Voor modellen van leverfibrose of carcinogenese is het vaak wenselijk aan overexpress of stilte genen op bepaalde tijdstippen van de ziekte-model. Voor dit doel, tools voor afleidbare genexpressie zoals het Cre/LoxP-systeem of het tetracycline-afleidbare gen expressie systeem (Tet-On) gebruikte10kan worden.
Hier beschrijven we een protocol voor in vivo transfectie van lymfkliertest hepatocyten met behulp van de HTVI van een schone slaapster transposon-gebaseerd systeem. Naast een protocol voor stabiele, constitutief uitdrukking van een transgenic onder de controle van een lever-specifieke promotor, beschrijven we een meer geavanceerde vector systeem dat constitutieve tamoxifen-afhankelijke Cre recombinase (CreER) expressie met combineert de afleidbare uitdrukking van een transgenic of microRNA-aangepast shRNA (miR-shRNA), genaamd de pTC TET-systeem11. In dit systeem vector zijn afleidbare transgenen of miR-shRNAs voor tetracycline-afhankelijke expressie gekloond in de ruggengraat vector met een recombinational klonen systeem, waardoor het snel en gemakkelijk generatie van nieuwe vectoren12. Deze gids videogebaseerd vindt de voorbereiding van geschikte vectoren, injectie en behandeling van muizen om afleidbare transgenic/miR-shRNA expressie, en ten slotte voorbereiding van leverweefsel voor analyse. De methode die wordt beschreven in dit protocol werd ontworpen om de combinatie van elk Cre/loxP gemedieerde muis systeem met de uitdrukking of knock-down van een gen van keuze, waardoor het een breed toepasbaar systeem in het onderzoek van de leverziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland en Stanford institutionele dier zorg en gebruiken Comité, Stanford, CA, USA). Een lijst van alle plasmiden voor klonen (stap 1 t/m 4) vindt u in de aanvullende tabel S1.
1. het klonen van een transgenic voor constitutieve genexpressie
- Inleidingen voor transgenic amplificatie13,14te ontwerpen.
- Beperkingsplaatsen voor PacI (TTAATTAA) aan het einde 5' van de voorwaartse primer toevoegen. Beperkingsplaatsen voor AscI (GGCGCGCC) of FseI (GGCCGGCC) toevoegen aan het einde 5' van de omgekeerde primer.
- Amplify transgenic door PCR voorwaarden geoptimaliseerd voor de gewenste transgenic14gebruiken. Zuiveren met behulp van een commercieel beschikbare DNA zuivering kit.
Opmerking: Onthardende tijd hangt af van de inleidingen ontworpen in stap 1.1., rek tijd hangt af van de lengte van de constructie. Bijvoorbeeld voor een constructie van 1000 bp lengte gebruik 60 s rek tijd. - Verteren transgenic en vector voor constitutieve gen expressie15 met respectieve beperking nucleasen (zie stap 1.2) en buffer in een totaal volume van 50 µL bij 37 ° C's nachts. Bijvoorbeeld, te verteren construct met 5 eenheden PacI en 5 stuks FseI, indien van toepassing (zie stap 1.2).
- Gel zuiveren verteerd vector en invoegen met behulp van een commerciële gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant. Het uitvoeren van een standaard Afbinding van 100 ng van vector en 100-1000 ng van invoegen met behulp van 400 U T4 inactivering van ligase bij 14 ° C gedurende 16 h. warmte bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
- Transformeren bevoegde bacteriën met behulp van een standaard warmte-schok-protocol16.
- Plaat op agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur.
- Kies één kolonies, zuiveren plasmide DNA met behulp van een commerciële miniprep kit volgens de instructies van de fabrikant en de volgorde controleren door Sanger sequencing17 (sequencing primer: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Gebruik positieve kolonies voor maxi schaal versterking van plasmide DNA en zuiveren met behulp van een endotoxine-vrije plasmide voorbereiding kit18 volgens de instructies van de fabrikant.
- Construct is klaar voor de injectie, dus ga verder met stap 5.
2. het klonen van een transgenic voor afleidbare genexpressie
- Inleidingen voor transgenic amplificatie13,14te ontwerpen.
- Beperkingsplaatsen voor SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) of KpnI (GGTACC) toevoegen aan het einde 5' van de voorwaartse primer. Beperkingsplaatsen voor kennisgevingen (GCGGCCGC) of XhoI (CTCGAG) toevoegen aan het einde 5' van de omgekeerde primer.
- Amplify transgenic door PCR voorwaarden geoptimaliseerd voor de gewenste transgenic14gebruiken. Zuiveren met behulp van een commerciële DNA zuivering kit.
- Verteren de gezuiverde transgenic en 4 µg Entry vector (pEN_TTmcs-Vector, Zie Tabel van materialen)19 afzonderlijk met geschikte beperking nucleasen (zie stap 2.2) en buffer in een totaal volume van 50 µL bij 37 ° C's nachts.
- Gel zuiveren verteerd vector en invoegen met behulp van een commerciële gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant. Het uitvoeren van standaard afbinding met 100 ng van vector en 100-1000 ng van invoegen met behulp van 400 U T4 inactivering van ligase bij 14 ° C gedurende 16 h. warmte bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
- Transformeren bevoegde bacteriën met behulp van een standaard warmte-schok-protocol16.
- Plaat op agar platen bevatten 15 µg/mL gentamicine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Kies één kolonies, zuiveren plasmide DNA, en Bevestig wachtwoord invoegen door sequentiebepaling17 met behulp van de pCEP naar voren primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Opmerking: PCR op één kolonies kan worden uitgevoerd zonder voorafgaande zuivering met inleidingen pCEP vooruit en pCEP reverse (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Deze stap kan nuttig zijn voor de voorselectie van positieve kolonies. - Ga verder met stap 4.
3. het klonen van een miR-shRNA voor afleidbare Gene Knock-down
- Het ontwerp van miR-shRNA oligonucleotides volgens het pSLIK protocol19klonen. Anneal oligonucleotides zuiveren en verdunnen 1:20 in ddH2O.
- Digest 3 µg Entry vector met 5 U BfuAI bij 50 ° C gedurende 3 uur, vervolgens inactivering van de reactie bij 65 ° C gedurende 20 min.
Opmerking: Indien co uitdrukking van groen fluorescent proteïne (GFP) is gewenst, gebruik pEN_TTGmiRc19 als een vermelding vector, anders gebruiken pEN_TTmiRc219. - Gel zuiveren verteerd vector zoals in stap 2.5. Uitvoeren van standaard Afbinding van 100 ng van vector en 1 µL van gezuiverd en shRNA oligonucleotides (stap 3.1) verdund met behulp van 400 U T4 ligase bij kamertemperatuur voor 1 h. warmte inactivering van 65 ° c gedurende 10 minuten.
- Transformeren bevoegde bacteriën met behulp van een standaard warmte-schok-protocol16.
- Plaat op agar platen bevatten 15 µg/mL gentamicine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Kies één kolonies, zuiveren plasmide DNA, en Bevestig wachtwoord invoegen door Sanger sequencing17 (sequencing primer: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Ga verder met stap 4.
4. recombinational klonen voor het genereren van klaar-voor-injectie klonen
- Mix 150 ng van post vector (vanaf stap 2 of stap 3) en 150 ng van pTC TET-vector20.
- TE buffer toevoegen aan een totaal volume van 8 µL (pH = 8).
- Overdracht van de LR-clonase enzym mix II (Zie Tabel van materialen) om het ijs, Incubeer gedurende 2 min. Vortex tweemaal.
- Voeg 2 µL van LR-clonase enzym mix II met de reactie en Incubeer bij 25 ° C gedurende 1 uur.
- Zet de reactie stop door toevoeging van 1 µL van proteïnase K-oplossing. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Stbl3 bevoegde bacteriën met 2 µL van recombinational klonen mengen met behulp van een standaard warmte-schok-protocol16transformeren.
- Plaat op agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer bij 30 ° C gedurende 24 uur.
- Kies één kolonies, zuiveren plasmide DNA met behulp van een endotoxine-vrije plasmide voorbereiding kit18 volgens de instructies van de fabrikant, en bevestigen van vector integriteit door Sanger sequencing17 (sequencing primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Construct is klaar voor de injectie, gaat u verder met stap 5.
5. voorbereiden oplossing door hydrodynamische staart veneuze injectie
Opmerking: Voorbereiding van constructies voor constitutieve en afleidbare genexpressie zijn beschreven in stap 1, 2, 3 en 4.
- Bereiden van steriele zoutoplossing 0,9% voor injectie (doen niet gebruik PBS). Gebruik volume dat overeenkomt met ongeveer 10% van het lichaamsgewicht van de muis. Voorbeeld: voor een muis met een gewicht van 20 g, bereiden 2 mL oplossing.
- Bereiden injectie vectoren die werden gezuiverd met behulp van een plasmide endotoxine-gratis reiniging kit18 (zie stap 1.8 of 4.8, respectievelijk).
- Voeg 10 µg of 15 µg voor Doornroosje endotoxine-vrije vector construct (uit stap 1 gebruik 10 µg, uit stap 4 gebruik 15 µg, respectievelijk) en 1 µg endotoxine-gratis pc-HSB5,21 per mL steriele zoutoplossing.
- Winkel oplossing voor maximaal 4 uur bij 4 ° C. Niet invriezen.
6. het uitvoeren van hydrodynamische staart veneuze injectie
- Gebruik een afdekking voor staart-veneuze injectie (commercieel of bereid uit een conische buis van 50 mL met gaten voor de ademhaling en de staart). Vul de onderkant van de buis met papieren zakdoekje.
- Gebruik voor injectie, muizen van ongeveer 8 – 10 weken oud met een gewicht van 20 tot 25 g.
- Weeg muizen vóór injectie en bereiden van geïnjecteerde volume volgens lichaamsgewicht (overeenkomt met 10% van het lichaamsgewicht, zie stap 5.1). Een steriele 3 mL-spuit met een 27 G-naald voorbereiden door injectie en vulling met de vereiste volume.
- Plaats de muis in de afdekking. De hoeveelheid papieren zakdoekje aanpassen (zie stap 6.1) te verlaten slechts minimale ruimte voor beweging maar genoeg ruimte om te ademen.
- Zorg ervoor dat de muis regelmatig ademt.
- Warm de staart met behulp van een infrarood lamp voor 30-60 s. zorgvuldig letten op tekenen van oververhitting.
- Reinig de staart met een alcohol doekje.
- Steek de naald bijna horizontaal in een van de twee zijdelingse staart aderen dicht bij de basis van de staart.
Opmerking: Indien succesvol geplaatst, kan een kleine hoeveelheid bloed stromen terug in de conus van de naald. Het is niet aanbevolen om actief gecombineerd zoals elke extra beweging van de naald leiden de verplaatsing en/of letsel van de ader tot kan. - Injecteer het totale volume in de ader van de staart binnen 8-10 s.
- Onmiddellijke verwijdering van de muis van de afdekking. Comprimeren van injectie wond voor ten minste 30 s of totdat een bloeding afneemt.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een aparte kooi. Zodra de muis is hersteld van de procedure (ongeveer 30-60 min), de muis ook terug overzetten naar zijn oorspronkelijke kooi. Sortie voort naar de muis regelmatig gedurende de volgende 24 uur.
Opmerking: Milde sedatie van de muis wordt regelmatig waargenomen voor maximaal 2 uur na de injectie. - Voordat u verdergaat met verdere experimenten (d.w.z., stap 7), wacht 10 tot 15 dagen voor de goedkeuring van de niet-geïntegreerde vectoren.
7. de inductie van Transfected CreER met Tamoxifen
Let op: Tamoxifen schadelijk is kan, worden kanker of schade van vruchtbaarheid. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad.
- Plan intraperitoneaal tamoxifen injecties op drie opeenvolgende dagen.
- Los op dag 1, 10 mg van tamoxifen in 40 µL ethanol. Incubeer bij 55 ° C gedurende 10 min. Vortex meerdere malen totdat de tamoxifen heeft opgelost.
- Toevoegen van 960 µL maïsolie. Incubeer gedurende 5 minuten bij 55 ° C. Vortex meerdere malen om een heldere oplossing.
- Bereid de oplossing in een 1-mL insuline-injectiespuit met een naald 27 G.
- Nekvel de muis door grijpen de hals van de muis zorgvuldig met de duim en de tweede vinger, tot vaststelling van de staart tussen de basis van de hand en de vierde en vijfde vinger.
- Injecteren 0,1 mL (= 1 mg van tamoxifen) van de oplossing intraperitoneally in het linker onderste kwadrant van het abdomen.
- Herhaal de injecties op dag twee en drie.
8. de inductie van Tetracycline-afhankelijke gen of shRNA expressie
Let op: Doxycycline schadelijk kan zijn. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad.
Opmerking: Afhankelijk van het type en de duur van het experiment, doxycycline kan geleverd worden in drinkwater (stap 8.1) of de chow (stap 8.2)
-
Voor korte termijn experimenten (< 10 dagen) beheer van de doxycycline via drinkwater met behulp van de onderstaande voorschriften.
- Los 5 g sacharose in 100 mL leidingwater. Autoclaaf.
- Los 100 mg doxycycline-hyclate in 5 mL sacharoseoplossing (stap 8.1.1) in een conische buis 15 mL.
- Behulp van een 10 mL spuit, steriele filter de oplossing door een 0,2 µm filter. Voeg toe aan de sacharoseoplossing bereid in stap 8.1.1.
- Doxycycline-sacharoseoplossing verstrekken als drinkwater voor de muis. Controleer dagelijks en vervangen wanneer de oplossing wordt bewolkt met vermelding van bacteriële overgroei (heldere oplossing vervangen na drie dagen uiterlijk).
- Voor lange termijn experimenten (> 10 dagen) of experimenten gevoelig voor metabole veranderingen, gebruik commerciële doxycycline-chow (bijvoorbeeldDoxycycline Hyclate Chow 0.625 g/kg) om te voorkomen dat uitdroging en/of sacharose-geïnduceerde veranderingen in de lever van behandelde dieren.
9. voorbereiding van muis lever voor analyse door immunokleuring
Let op: Paraformaldehyde schadelijk kan zijn. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad.
Opmerking: Het timepoint wanneer muizen zal worden geanalyseerd is afhankelijk van het experiment. Het is aanbevolen om het analyseren van leverweefsel na maar liefst drie dagen van doxycycline behandeling om voldoende inductie van transgenic of shRNA expressie.
- Bereiden een spuit van 1 mL met een 27 G naald met 1 mL van 4% paraformaldehyde-oplossing (PFA).
- De muis door een geschikte methode volgens een goedgekeurde dierlijke protocol euthanaseren.
Opmerking: Richtsnoeren voor passende methoden voor euthanasie kunnen variëren afhankelijk van de instelling. - Open de buikholte met ontleden schaar en anatomische pincet, zorgvuldig met een mediane laparotomie bloot van de lever. De dunne darm naar rechts om de portal-ader en de vena cava (IVC), inferior bloot te verplaatsen.
- De naald van de spuit bereid invoegen (zie stap 9.1) in het IVC en snijd de ader van de portal. Injecteren 1 mL PFA langzaam het IVC perfuse het leverweefsel en verwijderen van auto-belichting fluorescerende rode bloedcellen (wenselijk als immunefluorescentie kleuring worden uitgevoerd).
- Het verwijderen van de lever. Spoelen in water en breng aan 5-10 mL van 4% PFA-oplossing.
- Voor paraffine secties is fix weefsel voor 36 – 48 h. weefsel klaar voor uitdroging en paraffine insluiten.
-
Voor bevroren secties, vast weefsel in 4% PFA gedurende 1 uur.
- Draag voor een cryoprotection, naar 10% sacharoseoplossing. Incubeer 60 min.
- Transfer naar 20% sacharoseoplossing. Incubeer 60 min.
- Transfer naar 30% sacharoseoplossing. Incubeer 12 – 16 h. Embed in te embedding samengestelde voor bevroren secties en bevriezen bij-20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transfectie werkzaamheid door hydrodynamische staart veneuze injectie: Het percentage van lymfkliertest hepatocyten die door een enkele injectie hydrodynamica zijn transfected is variabel en hangt af van meerdere parameters zoals het geïnjecteerde volume, de injectie tijd, de hoeveelheid ingespoten DNA, en de grootte van de geïnjecteerde construct6, 22,23. Bovendien, is de efficiëntie van de transfectie over het algemeen lager in grotere dieren, waar een grotere vasculaire diameter evenals groter sinusvormige gebied leidt tot een afname van de totale druk. Om te visualiseren transfectie efficiëntie, werd HTVI voor een CreER transposon construct uitgevoerd bij muizen herbergen een Rosa26mTmG verslaggever gen gevolgd door tamoxifen-gemedieerde activering van de CreER constructie. Lage geïnjecteerde volume of langdurige injectie tijd voor technische redenen resulteert in verminderde transfectie efficiëntie met slechts een paar transfected hepatocyten aantoonbaar in de gehele lever, terwijl optimale injectie omstandigheden leiden hogere transfectie tot efficiencyverbeteringen zoals afgebeeld door verslaggever kleuring na HTVI van een CreER transposon (figuur 1A). Om te beoordelen werkzaamheid van de transfectie, wordt immunokleuring van de transfected transgenic of – zoals in het geval van CreER - van een geschikt verslaggever gen sterk aanbevolen. Als alternatief kan transfectie efficiëntie van mRNA uitdrukking analyse van de transfected transgenic worden geschat.
Transfectie van pericentral hepatocyten: Na hydrodynamische injectie, kan een drukverschil langs de sinusvormige ruimte - waar het druk is dicht bij de centrale ader hoogste en laagste in de periportal areal - leiden tot voorkeur transfectie in het pericentral gebied. We geanalyseerd levers met een laag percentage van hepatocyten transgenic-uiten en hun relatieve positie in de lever lobule door co-immunokleuring voor glutamine synthetase (GS), een marker voor pericentral hepatocyten beoordeeld. Interessant is dat de meerderheid van de hepatocyten die verslaggever genexpressie toonde na HTVI voor een CreER construct geclusterd rond de centrale ader maar niet de portal-gebied (figuur 1B) met vermelding van hogere efficiëntie van de transfectie rond de centrale ader.
In vivo na HTVI van een transposon luciferase imaging: Om te beoordelen of de integratie van de enkel exemplaar waargenomen na HTVI van transposon24 construeert is voldoende voor in vivo imaging geïnjecteerd we een transposon construct herbergen een luciferase expressie cassette onder de controle van een specifieke lever promotor-constructie. Muizen werden ingespoten met luciferine en beeld met een in vivo imaging systeem twee weken na HTVI (figuur 2A). Imaging toonde robuust en stabiel luciferase bioluminescentie in de lever 15 dagen na de injectie en op latere tijdstippen (figuur 2B en gegevens niet worden weergegeven). Deze resultaten tonen aan dat het systeem met succes kan worden gebruikt om te volgen van de aanwezigheid van transfected cellen in vivo door bioluminescentie imaging.
Gecombineerd CreER en afleidbare transgenic of shRNA expressie: We hebben eerder gemeld een transposon-constructie waarbij de constitutieve uitdrukking van een afleidbare Cre recombinase (CreER) met afleidbare uitdrukking van een transgenic of een shRNA van keuze20 (figuur 3A combineert). Injectie van deze constructie in Rosa26mTmG-reporter muizen en CreER activering door tamoxifen toonde krachtige uitdrukking van het gen verslaggever vergelijkbaar is met de resultaten die verkregen met een transposon construct voor één transgenic expressie ( Figuur 3B). Na de behandeling van doxycycline, kan afleidbare transgenic expressie worden gevisualiseerd door geschikte antilichamen in transfected hepatocyten (Figuur 3 c). Voor afleidbare shRNA expressie verdient het gebruik van een constructie GFP-shRNA zoals cytoplasmatische GFP expressie gedetecteerd door immunokleuring kan worden gebruikt als een marker surrogaat voor shRNA expressie (figuur 3D). Van de nota is transgenic of shRNA expressie respectievelijk alleen aantoonbaar in een subset van hepatocyten, die mogelijk te wijten aan de relatief hoge niveau van eiwit expressie nodig voor de detectie van immunokleuring20.
Figuur 1: transfectie van hepatocyten door HTVI. (A) de efficiëntie van de variabele transfectie na HTVI van een CreER-transposon in muizen herbergen een Rosa26mTmG / + verslaggever en gevolgd door behandeling met tamoxifen. Transfected hepatocyten zijn positief voor membraan-gebonden groen fluorescente proteïne (GFP, groen). (B) mede kleuring voor CreER geactiveerd hepatocyten (groen) in muizen herbergen een verslaggever Rosa26mTmG met de centrale ader marker glutamine synthetase (GS, rood). Hier PV: portal vein, CV: centrale ader. Schaal staven 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: In vivo imaging van luciferase. (A) Transposon construeren waarin een luciferase expressie cassette (niet op schaal getekend). Injectie en behandeling regeling voor de visualisatie van hepatische luciferase expressie. SB: schoonheid erkenning slaapplaatsen, HTVI: hydrodynamische staart veneuze injectie. (B) representatieve afbeelding van hepatische luciferase bioluminescentie 15 dagen na HTVI voor een transposon-luciferase construct samen met pHSB5 met een in vivo imaging systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gecombineerd CreER en afleidbare gen/shRNA expressie. (A) Transposon construct voor expressie van afleidbare Cre recombinase samen met de expressie van een tetracycline-afleidbare transgenic of shRNA (pTC Tet), niet getrokken moet worden geschaald. (B) groene membraan kleuring geeft aan transfected hepatocyten na injectie van de pTC Tet construct in Rosa26mTmG / + verslaggever muizen en CreER activering met tamoxifen. Schaal staaf vertegenwoordigt 100 µm. (C) afleidbare genexpressie 5 dagen nadat doxycycline behandeling kan worden gevisualiseerd door immunokleuring voor de transgenic (YAP, rood) in transfected hepatocyten. (D) afleidbare miR-shRNA expressie 5 dagen na de behandeling van de doxycycline aangegeven door cytoplasmatische groen fluorescente proteïne (GFP) kleuring van het GFP-shRNA construct. Transfected hepatocyten worden afgebeeld door membraan-gebonden GFP. Schaal bars in C) en D) vertegenwoordigen 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De transfectie van hepatocyten met hydrodynamische staart veneuze injectie is een gevestigde methode geworden sinds de invoering ervan meer dan 15 jaar geleden6. Het geïnjecteerde volume overschrijdt van de cardiale output en stroomt de sinusoïdes van de lever7, leiden tot de transfectie van ongeveer 10-20%, in sommige gevallen oplopen tot 40% van hepatocyten25,26van de vena cava inferior. Voorspellers van een succesvolle transfectie zijn het geïnjecteerde volume per ingespoten tijd22,23. Vandaar dat een lage transfectie efficiëntie (figuur 1A, linkerpaneel) is meestal te wijten aan het falen de injectie om snelheid te houden tijdens de procedure-7. Zelfs met een optimale techniek blijft de efficiëntie van de transfectie die kan worden bereikt door HTVI echter lager zijn dan het verkregen door virale infectie met adenovirussen of adeno-geassocieerde virussen die oplopen bijna 100%5,27 tot kunnen . Om te bereiken succes staart ader injecties, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat een stabiele positionering van de naald in het bloedvat. Dit wordt gemakkelijk bereikt in aderen met grotere diameter dichter naar de onderkant van de staart. Bovendien, is verwijding van de ader door het opwarmen van de staart sterk aanbevolen. De beste resultaten worden behaald met behulp van een infrarood lamp, maar een niet-infrarood warmte lamp of onderdompeling van de staart in warm water kan ook worden gebruikt. In sommige gevallen, ter aanvulling van maximaal 200 µL zoutoplossing door intraperitoneale injectie ongeveer 30 minuten voordat de HTVI zal verbeteren de hydratatie status van de dieren die zijn verkregen in de verwijding van de bloedvaten. Om te behouden een constante injectie-snelheid, moet de staart van de muis grondig worden gefixeerd om te voorkomen dat elke beweging van de staart, die in verplaatsing van de naald resulteren kan. Voor validatie doeleinden raden we u een constructie die kan worden gedetecteerd door immunokleuring. Als alternatief, transfectie werkzaamheid kan worden geschat door mRNA uitdrukking analyse of rangschikken van DNA28geïntegreerd.
Onze gegevens blijkt dat de integratie van transposon bij voorkeur op het gebied van de pericentral van de lever lobule wordt nageleefd. De overheersende transfectie van hepatocyten rond de centrale ader is waarschijnlijk te wijten aan de unieke hemodynamica van HTVI, zoals er ook in niet-transposon gebaseerde transfectie29is opgemerkt. Deze bevinding misschien wel van belang zijn voor sommige toepassingen, zoals inductie van acute leverschade door CCl4, die voornamelijk pericentral hepatocyten treft. In het kader van lage transfectie efficiëntie, kan CCl4 behandeling dus leiden tot aanzienlijke vermindering van het aantal transfected hepatocyten. Daarnaast is de HTVI van beperkt nut voor de doelcellen van de periportal met inbegrip van gal duct cellen15.
Naast systemen die gebruikmaken van HTVI van transposon constructies om stabiele uitdrukking van een enkele transgenic, voorgesteld wij onlangs een systeem dat de co uitdrukking van CreER en afleidbare uitdrukking van een gen of een miR-shRNA uit een enkele vector11 toelaat . Dit systeem is vooral nuttig om te ondervragen van specifieke genen in Cre/LoxP gebaseerde muis stammen. Zoals transgenen of shRNA constructies worden door een snelle en betrouwbare recombinational klonen procedure ingevoerd, kan het systeem eenvoudig worden aangepast voor het screenen van benaderingen. Het systeem van de vector bemiddelt betrouwbare afleidbare expressie in vivo dat is volledig afhankelijk van de levering van doxycycline11,30. Deze praktische videogebaseerd handleiding bevat stapsgewijze instructies van klonen van geschikte vectoren over inductie van genexpressie analyse van leverweefsel.
Echter, teneinde de efficiëntie van het systeem, verschillende aspecten moeten rekening worden gehouden: om lange termijn expressie, genomic integratie is bemiddeld bij TA-sites door de Doornroosje transposase8,11. Aangezien integratie efficiëntie transposon grootte afhankelijk is, is het belangrijk de grootte van de transgenic constructie in gedachten te houden bij het ontwerpen van de vector-31. Expressie-efficiëntie van het product afleidbare gen in de lever is bovendien afhankelijk van de rtTA3-promotor11. Voor optimale expressie resultaten, gebruik van een vector constructie met een lever specifieke ApoE.HCR.hAAT-promotor wordt aanbevolen (Addgene #85578), omdat het toont de hoogste efficiëntie in een vergelijking van drie promotoren11. Met een geoptimaliseerde promotor construct, kan afleidbare transgenic/shRNA expressie worden gedetecteerd door immunokleuring van transfected cellen20tot 30%. Als afleidbare eiwitniveaus beneden een bepaalde drempel die is nodig voor de detectie van immunokleuring bestaat, dient dit te worden bepaald. Nog belangrijker is, kan geen transgenic/shRNA uitdrukking worden gedetecteerd door immunokleuring in muizen die niet werden behandeld met doxycycline. Ten slotte, uitdrukking van genen onder controle van de tetracycline respons-element (TRE) is afhankelijk van de dosis van doxycycline32,33. Voor korte termijn experimenten is beheer van de doxycycline via drinkwater goed ingeburgerd34,35. Sacharose wordt meestal toegevoegd aan geven een betere smaak. Echter, dit kan leiden tot Polydipsie en uitdroging, en het gebruik van doxycycline chow is een aanrader voor de lange termijn experimenten36,37.
Kortom is hydrodynamische staart veneuze injectie een grote schaal in de Gemeenschap gevestigde methode in lever onderzoek. Haar toepassing varieert van studies over hepatitis B tot lever fibrose of hepatocellulaire carcinoom modellen38,39,40,41. Het systeem zoals beschreven in dit manuscript is vooral handig in de ondervraging van specifieke doelgenen in Cre/LoxP-gebaseerde modellen van de leverziekte. Overexpressie in de lever kan daarnaast ook worden gebruikt voor onderzoek of om aan te pakken van immunologische vragen44,45hematologic ziekten42,43 . Na de analyse van specifieke genen van belang, kan het voorgestelde systeem ook gemakkelijk aangepast worden aan screening of multiplexing benaderingen. Daarom zal deze videogebaseerd handleiding nuttig zijn voor een grote gemeenschap van onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Deutsche Krebshilfe, Duitsland (subsidie getal 111289 UE), de Lucile Packard Foundation voor de gezondheid van kinderen (Ernest en Amelia Gallo begiftigd Postdoctoral Fellowship - CTSA subsidie nummer UL1 RR025744 UE). Wij danken Dr Mark A. Kay voor vector constructies en experimentele advies en Dr. Julien Sage voor muizen en experimentele ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
