Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.
Modelos de pesquisa de câncer de fígado, regeneração, inflamação e fibrose, sistemas flexíveis para a expressão do gene na vivo e silenciamento são altamente úteis. Injeção de veia cauda hidrodinâmica de construções baseadas em transposon é um método eficiente para manipulação genética dos hepatócitos em ratos adultos. Além de expressão constitutiva do transgene, este sistema pode ser usado para aplicações mais avançadas, tais como implicação de knock-down, mediada por shRNA gene do sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações genéticas, ou sistemas inducible. Aqui, a combinação de expressão constitutiva de CreER juntamente com expressão inducible de um transgene ou miR-shRNA de escolha é apresentado como um exemplo dessa técnica. Cobrimos o processo de várias etapa, a partir da preparação da bela adormecida-transposon constrói, a injeção e o tratamento de ratos e a preparação do tecido do fígado para análise por imunocoloração. O sistema apresentado é uma abordagem eficiente e confiável para realizar manipulações genéticas complexas nos hepatócitos. É especialmente útil em combinação com cepas de rato Cre/loxP-baseado e pode ser aplicado a uma variedade de modelos na pesquisa de doença hepática.
Doença hepática crônica apresenta um fardo de saúde em todo o mundo1. Modelos de pesquisas com animais são ferramentas essenciais no estudo da doença hepática e ajudaram a responder questões complexas na regeneração hepática, inflamação hepática, esteatose hepática e câncer de fígado2. Um número substancial desses modelos animais depende da modificação genética das células do fígado. Portanto, ferramentas eficientes para manipular a expressão gênica em hepatócitos são úteis3. Estabelecidos métodos tais como a reprodução de linhagens geneticamente modificados do mouse ou a geração de vetores virais para a infecção do hepatócito são ou demorado, Porto preocupações de segurança, ou produzem expressão do transgene pobre em hepatócitos na vivo 4 , 5. injeção de veia de cauda hidrodinâmica (HTVI) é um método alternativo para transfeccao na vivo dos hepatócitos, permitindo a fácil, rápido e eficiente de interrogatório da função do gene no fígado. Para HTVI, um vetor carregando a sequência de DNA desejada é dissolvido em um volume de solução salina, correspondente a 10% do peso corporal do animal injetado. A solução então é injetada na veia da cauda dentro de 5-10 s6. Excedendo o débito cardíaco, o soro flui da veia cava inferior nas veias hepáticas, levando a expansão do fígado e transfection hidrodinâmico de hepatócitos7. Para conseguir a integração estável de genômica, o método foi combinado com transposon-com base em vetores, como o sistema de transposon dormir beleza. Este sistemas Medeia a recombinação de vetores de alvo com sites de recombinação genômica catalisadas por uma de8,de transposase dormir beleza –9. Para modelos de fibrose hepática ou carcinogênese, muitas vezes é desejável para genes overexpress ou silêncio em determinados pontos do tempo do modelo de doença. Para esta finalidade, ferramentas para expressão de gene inducible, tais como o sistema Cre/LoxP ou o sistema de expressão de gene tetraciclina-inducible (Tet-On) pode ser usado10.
Aqui, descrevemos um protocolo para transfeccao na vivo de hepatócitos murino usando HTVI de um sistema baseado em transposon bela adormecida . Além de um protocolo para a expressão estável, constitutiva de um transgene sob o controle de um promotor específico fígado, descrevemos um sistema mais avançado de vetor que combina expressão constitutiva da recombinase (CreER) do Cre tamoxifeno-dependente com o expressão inducible de um transgene ou microRNA-adaptado de shRNA (miR-shRNA), chamado o pTC TET-sistema11. Neste sistema de vetor, inducible transgenes ou miR-shRNAs para expressão dependente de tetraciclina são clonados no vetor coluna vertebral com um sistema de clonagem recombinational, permitindo a geração de novos vetores12rápida e fácil. Este guia em vídeo abrange a preparação de vetores apropriados, injeção e tratamento de ratos para alcançar expressão inducible do transgene/miR-shRNA e, finalmente, a preparação do tecido do fígado para análise. O método descrito neste protocolo foi projetado para permitir a combinação de qualquer sistema de rato Cre/loxP mediada com a expressão ou batida para baixo de qualquer gene de escolha, tornando-se um sistema amplamente aplicável na investigação de doença hepática.
Transfecção de hepatócitos com injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se um método estabelecido desde a sua introdução há mais de 15 anos6. O volume injetado excede o débito cardíaco e flui da veia cava inferior para os sinusoides do fígado7, levando a transfeccao de cerca de 10-20%, em alguns casos até 40% dos hepatócitos25,26. Preditores de um bem sucedida do transfection são o volume injeta…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Krebshilfe, Alemanha (número de concessão 111289 a UE), a Lucile Packard Foundation para a saúde das crianças (Ernest e Amelia Gallo dotado Postdoctoral Fellowship – número de concessão CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos o Dr Mark A. Kay para construções de vetor e suporte experimental conselhos e Dr Julien Sage para ratos e experimental.
General Material | |||
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction Enzymes | |||
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
FseI | New England BioLabs | R0588S | |
SacI | New England BioLabs | R0156S | |
SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits | |||
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for Mouse Experiments | |||
Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |