JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

Published: February 02, 2018
doi:
10.3791/56613
, , , , ,
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar,Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine,Medical Center University of Freiburg

Summary

Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte integrering vektorer gjør stabil transfection murine hepatocytes i vivo. Her presenterer vi en praktisk protokoll for transfection systemer som gjør det muliggjør langsiktige grunnleggende uttrykk for en enkelt transgene eller kombinert konstituerende og doxycycline-induserbart uttrykk av transgene eller miR-shRNA i leveren.

Abstract

I forskning modeller av leverkreft, gjenfødelse, betennelse og fibrose er fleksibel systemer for i vivo genuttrykk og stanse svært nyttig. Etter halen blodåre injeksjon av transposon-baserte konstruksjoner er en effektiv metode for genetisk manipulering av hepatocytter som voksen mus. I tillegg til grunnleggende transgene uttrykk, kan dette systemet brukes til mer avanserte programmer, for eksempel shRNA-mediert genet sammenleggbare, Implikasjonen av CRISPR/Cas9 systemet å indusere genet mutasjoner eller induserbart systemer. Her er kombinasjonen av grunnleggende CreER uttrykk med induserbart uttrykk for en transgene eller miR-shRNA av valget presentert som et eksempel på denne teknikken. Vi dekker flere trinn prosedyren fra utarbeidelse av Tornerose-transposon konstruerer, injeksjon og behandling av mus og utarbeidelse av leveren vev for analyse av immunostaining. Systemet presentert er en pålitelig og effektiv tilnærming til å oppnå komplekse genetisk manipulasjon i hepatocytter. Det er spesielt nyttig i kombinasjon med grobunn/loxP-baserte musen stammer og kan brukes til en rekke modeller med forskning rundt leversykdom.

Introduction

Kronisk leversykdom presenterer store helse byrden verden1. Forsøksdyrutvalget modeller er viktige verktøy i studiet av leversykdom og har bidratt til å svare på komplekse spørsmål i leveren gjenfødelse, hepatic betennelse, og Steatose samt leverkreft2. Et betydelig antall av disse dyremodeller avhengige genmodifisering av leverceller. Effektive verktøy for å manipulere byggkorn under hepatocytter er derfor nyttig3. Etablerte metoder som oppdrett av genmodifiserte musen stammer eller generering av viral vektorer for hepatocyte infeksjon er enten tidkrevende, havn sikkerhet bekymringer, eller gir dårlig transgene uttrykk i hepatocytter i vivo 4 , 5. etter halen blodåre injeksjon (HTVI) er en alternativ metode for i vivo transfection hepatocytes muliggjør enkel, rask og kostnadseffektiv avhør av gen funksjon i leveren. For HTVI oppløses en vektor bærer ønsket DNA sekvensen i et volum saltoppløsning tilsvarende 10% av kroppsvekten til injisert dyret. Løsningen er deretter sprøytes inn hale venen i 5-10 s6. Overstiger blodsirkulasjon, flyter saltkildene fra de mindreverdige vena cava i leveren vener, fører til utvidelse av leveren og etter transfection av hepatocytter7. For å oppnå stabil genomisk integrasjon, blitt metoden kombinert med transposon-baserte vektorer, slik som sove skjønnhet –transposon systemet. Denne systemer formidler rekombinasjon målet vektorer med genomisk rekombinasjon nettsteder katalysert av en sovende skjønnhet –transposase8,9. Modeller av leveren fibrosis eller kreft er det ofte ønskelig å overexpress eller stillhet gener på bestemte tidspunkt av sykdom modell. For dette formålet, verktøy for induserbart genuttrykk som grobunn/LoxP-systemet eller tetracyclin-induserbart gene expression systemet (Tet-på) kan være brukt10.

Her beskriver vi en protokoll for i vivo transfection murine hepatocytes bruker HTVI av en Tornerose transposon-basert system. I tillegg til en protokoll for stabil, konstituerende uttrykk for en transgene under kontroll av en lever-spesifikke promoter, beskriver vi en mer avansert vektor-system som kombinerer grunnleggende tamoxifen-avhengige grobunn recombinase (CreER) uttrykk med den induserbart uttrykk av transgene eller microRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kalt pTC TET-systemet11. I dette vektor systemet samsvarer induserbart effekter av transgener eller miR-shRNAs for tetracycline-avhengige uttrykket i av ryggrad vektor med en recombinational kloning system, gir rask og enkel generering av nye vektorer12. Denne video-basert veiledningen dekker forberedelse egnet vektorer, injeksjon og behandling av mus å oppnå induserbart transgene/miR-shRNA uttrykk, og endelig utarbeidelse av leveren vev for analyse. Metoden beskrevet i denne protokollen ble utformet slik at kombinasjonen av grobunn/loxP mediert musen system med uttrykket eller sammenleggbare av noen genet valgfrihet, noe som gjør det til et allment gjeldende system i forskning av leversykdom.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av ansvarlig myndigheter (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institusjonelle dyr omsorg og bruke komiteen, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trinn 1 til 4) angis i supplerende tabell S1. 1. kloning av et Transgene for grunnleggende genuttrykk Utforme primere for transgene forsterkning13,…

Representative Results

Hva effekten av etter halen blodåre injeksjon: Andelen murine hepatocytter som er transfekterte hydrodynamically av en enkelt injeksjon er variabel og avhenger av flere parametere som injeksjon volum, injeksjon tid, mengden injisert DNA og størrelsen på de injiserte konstruere6, 22,23. Dessuten er hva effektivitet generelt lavere i større dyrene, der en større vaskulær dia…

Discussion

Hva hepatocytes med etter halen blodåre injeksjon har blitt en etablert metode siden introduksjonen mer enn 15 år siden6. Injisert volumet overskrider blodsirkulasjon og munner fra de mindreverdige vena cava sinusoids av leveren7, fører til transfection på ca 10-20%, i noen tilfeller opp til 40% av hepatocytter25,26. Prediktorer for en vellykket hva er injisert volumet per injisert tid22<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Krebshilfe, Tyskland (bevilgning nummer 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for barns helse (Ernest og Amelia Gallo utstyrt postdoktorstipend – CTSA bevilgning nummer UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruksjoner og eksperimentelle råd og Dr Julien Sage for mus og eksperimentell støtte.

Materials

General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

In VivoGenetic ModificationMouse HepatocytesHydrodynamic Tail Vein InjectionConstitutive SystemInducible SystemCreERShRNAVector ConstructLiver ResearchLiver CancerLiver Regeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image