Summary
Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baseret integration vektorer giver stabil Transfektion af murine hepatocytter in vivo. Vi præsenterer her, en praktisk protokol til Transfektion systemer, der giver mulighed for den langsigtede konstitutiv udtryk for en enkelt transgen eller kombinerede konstitutiv og doxycyclin-inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA i leveren.
Abstract
I forskning modeller af leverkræft, regenerering, inflammation og fibrose er fleksible systemer for i vivo genekspression og silencing meget nyttig. Hydrodynamisk hale vene injektion af transposon-baserede konstruktioner er en effektiv metode til genetisk manipulation af hepatocytter i voksen mus. Ud over konstitutiv transgen udtryk, kan dette system bruges til mere avancerede applikationer, såsom shRNA-medieret gen knock-down, konsekvenser af CRISPR/Cas9-systemet til at fremkalde genmutationer eller inducerbar systemer. Her, er kombinationen af konstituerende CreER udtryk sammen med inducerbar udtryk for en transgen eller miR-shRNA valg præsenteret som et eksempel på denne teknik. Vi dækker Multi-trins procedure fra udarbejdelsen af Tornerose-transposon konstruktioner, injektion eller behandling af mus, og forberedelse af levervævet til analyse af immunfarvning. Systemet præsenteret er en pålidelig og effektiv tilgang til at opnå komplekse genetiske manipulationer i hepatocytter. Det er specielt nyttig i kombination med Cre/loxP-baserede mus stammer og kan anvendes til en bred vifte af modeller i forskning af leversygdom.
Introduction
Kronisk leversygdom præsenterer en større sundhed byrde på verdensplan1. Dyreforskning modeller er uundværlige redskaber i studiet af leversygdom og har hjulpet med at besvare komplekse spørgsmål i leveren regenerering, hepatisk betændelse, og steatose samt leverkræft2. Et betydeligt antal af disse dyremodeller er afhængige af den genetiske modifikation af leverceller. Derfor, effektive værktøjer til at manipulere genekspression i hepatocytter er nyttigt3. Etablerede metoder såsom opdræt af gensplejsede mus stammer eller generation af virale vektorer for hepatocyt infektion er enten tidskrævende, harbor sikkerhedsproblemer, eller give fattige transgen udtryk i hepatocytter i vivo 4 , 5. hydrodynamiske hale vene injektion (HTVI) er en alternativ metode til i vivo Transfektion af hepatocytter giver mulighed for nem, hurtig og omkostningseffektiv forhør af genet fungerer i leveren. For HTVI opløses en vektor, bærer det ønskede DNA-sekvens i en mængde af saltvand svarende til 10% af kropsvægten af det injicerede dyr. Løsningen er derefter sprøjtet ind i halen vene inden for 5-10 s6. Overstiger minutvolumen, løber saltvand fra den ringere vena cava i leveren venerne, fører til udvidelse af leveren og Hydrodynamisk Transfektion af hepatocytter7. For at opnå stabil genomisk integration, har metoden været kombineret med transposon-baserede vektorer, som den sovende skønhed -transposon system. Denne systemer medierer rekombination af target vektorer med genomisk rekombination websteder katalyseret af en sovende skønhed -transposase8,9. Modeller af leverfibrose eller carcinogenese er det ofte ønskeligt at overexpress eller stilhed gener på visse tidspunkter af sygdom model. Til dette formål, værktøjer til inducerbar genekspression som Cre/LoxP-system eller tetracyklin-inducerbar gen expression system (Tet-On) kan være brugt10.
Her, beskriver vi en protokol for i vivo Transfektion af murine hepatocytter ved hjælp af HTVI af en sovende skønhed transposon-baseret system. Ud over en protokol for stabil, konstituerende udtryk for en transgen under kontrol af en lever-specifikke promotor, vi beskriver en mere avanceret vektorsystem, der kombinerer konstitutiv tamoxifen-afhængige Cre recombinase (CreER) udtryk med den inducerbar udtryk for en transgen eller mikroRNA-tilpasset shRNA (miR-shRNA), kaldet pTC TET-systemet11. I denne vektorsystem er inducerbar transgener eller miR-shRNAs for tetracyclin-afhængige udtryk klonet i rygraden vektor med en recombinational kloning ordning, tillade den hurtige og nem generation af nye vektorer12. Denne video-baserede vejledning omfatter udarbejdelsen af passende vektorer, injektion og behandling af musene at opnå inducerbar transgen/miR-shRNA udtryk, og endelig forberedelse af levervævet til analyse. De i denne protokol beskrevne metode var designet til at aktiverer kombinationen af enhver Cre/loxP medieret mus system med udtrykket eller knock-down af enhver gene af valg, hvilket gør det til et almindeligt gældende system i forskning af leversygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført efter retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af myndighederne (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland og Stanford institutionelle dyrs pleje og bruge udvalget, Stanford, CA, USA). En liste over alle plasmider for kloning (trin 1-4) er fastsat i supplerende tabel S1.
1. kloning af et transgen til konstituerende genekspression
- Design primere for transgen forstærkning13,14.
- Tilføje begrænsning websteder for PacI (TTAATTAA) til 5' enden af den fremskudte primer. Tilføje begrænsning websteder for AscI (GGCGCGCC) eller FseI (GGCCGGCC) til 5'-enden af den omvendte primer.
- Forstærke transgenet ved PCR ved hjælp af betingelser, der er optimeret til den ønskede transgen14. Rense, ved hjælp af en kommercielt tilgængelig DNA rensning kit.
Bemærk: Udglødning tid afhænger af primere designet i trin 1.1., strækforlængelse tid afhænger af længden af konstruktionen. For eksempel, for en konstruktion af 1.000 bp længde brug 60 s brudforlængelse tid. - Fordøje transgenet og vektor for konstituerende gen expression15 respektive begrænsning nukleaser (Se trin 1.2) og buffer i en samlet maengde paa 50 µL ved 37 ° C natten over. For eksempel, fordøje konstruktion med 5 enheder PacI og 5 enheder FseI eventuelt (Se trin 1.2).
- Gel rense fordøjet vektor og insert ved hjælp af en kommerciel gel udvinding kit ifølge producentens anvisninger. Udføre en standard ligatur af 100 ng af vektor og 100-1.000 ng af Indsæt ved hjælp af 400 U T4 ligase på 14 ° C i 16 h. varme inaktivere ved 65 ° C i 10 min.
- Omdanne kompetente bakterier ved hjælp af en standard heat-shock-protokol16.
- Plade på agar plader der indeholder 100 µg/mL ampicillin. Der inkuberes ved 30 ° C i 24 timer.
- Vælge enkelt kolonier, rense plasmid DNA ved hjælp af en kommerciel miniprep kit ifølge producentens anvisninger og kontrollere rækkefølgen af Sanger sekventering17 (sekventering primer: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
- Brug positiv kolonier for maxi skala forstærkning af plasmid DNA og rense, ved hjælp af en endotoxin-fri plasmid forberedelse kit18 ifølge producentens anvisninger.
- Konstruktionen er klar til injektion, således fortsætte med trin 5.
2. kloning af et transgen for inducerbar genekspression
- Design primere for transgen forstærkning13,14.
- Tilføje begrænsning websteder for SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) eller KpnI (GGTACC) til 5' enden af den fremskudte primer. Tilføje begrænsning websteder for NotI (GCGGCCGC) eller XhoI (CTCGAG) til 5'-enden af den omvendte primer.
- Forstærke transgenet ved PCR ved hjælp af betingelser, der er optimeret til den ønskede transgen14. Rense, ved hjælp af en kommerciel DNA rensning kit.
- Fordøje renset transgenet og 4 µg af posten vektor (pEN_TTmcs-vektor, se Tabel af materialer)19 separat med passende begrænsning nukleaser (Se trin 2.2) og buffer i en samlet maengde paa 50 µL ved 37 ° C natten over.
- Gel rense fordøjet vektor og insert ved hjælp af en kommerciel gel udvinding kit ifølge producentens anvisninger. Udføre standard ligatur med 100 ng af vektor og 100-1.000 ng af Indsæt ved hjælp af 400 U T4 ligase på 14 ° C i 16 h. varme inaktivere ved 65 ° C i 10 min.
- Omdanne kompetente bakterier ved hjælp af en standard heat-shock-protokol16.
- Plade på agar plader der indeholder 15 µg/mL gentamicin. Der inkuberes ved 37 ° C i 16 h.
- Vælge enkelt kolonier, rense plasmid DNA og kontrollere Indsæt ved sekventering17 ved hjælp af den pCEP fremme primer: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
Bemærk: PCR på enkelt kolonier kan udføres uden forudgående rensning med primere pCEP frem og pCEP omvendt (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Dette trin kan nyttig for Forhåndsudvælgelse af positive kolonier. - Fortsæt til trin 4.
3. kloning af en miR-shRNA for inducerbar gen Knock-down
- Design miR-shRNA oligonukleotider ifølge pSLIK kloning protokol19. Bind og rense oligonukleotider og fortyndet 1:20 i ddH2O.
- Digest 3 µg af posten vektor med 5 U BfuAI ved 50 ° C til 3 h, derefter inaktivere reaktion på 65 ° C i 20 min.
Bemærk: Hvis Co udtryk for grøn fluorescerende proteiner (NGL) ønskes, brug pEN_TTGmiRc19 som en post vektor, ellers bruge pEN_TTmiRc219. - Gel rense fordøjet vektor som i trin 2,5. Udføre standard ligatur af 100 ng af vektor og 1 µL af renset og fortyndet shRNA oligonukleotider (trin 3.1) ved hjælp af 400 U T4 ligase ved stuetemperatur for 1 h. varme inaktivere ved 65 ° C i 10 min.
- Omdanne kompetente bakterier ved hjælp af en standard heat-shock-protokol16.
- Plade på agar plader der indeholder 15 µg/mL gentamicin. Der inkuberes ved 37 ° C i 16 h.
- Vælge enkelt kolonier, rense plasmid DNA og kontrollere Indsæt af Sanger sekventering17 (sekventering primer: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
- Fortsæt til trin 4.
4. recombinational kloning for at generere klar til injektion kloner
- Mix 150 ng af posten vektor (fra trin 2 eller trin 3) og 150 ng af pTC TET-vektor20.
- Tilføje TE buffer til en samlet maengde paa 8 µL (pH = 8).
- Overføre LR-clonase enzym mix II (Se Tabel af materialer) til is, inkuberes i 2 min. Vortex to gange.
- Tilføje 2 µL af LR-clonase enzym mix II til reaktionen og inkuberes ved 25 ° C i 1 time.
- Reaktionen standses ved at tilføje 1 µL af Proteinase K-løsning. Der inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
- Omdanne Stbl3 kompetente bakterier med 2 µL af recombinational kloning blandes ved hjælp af en standard heat-shock-protokol16.
- Plade på agar plader der indeholder 100 µg/mL ampicillin. Der inkuberes ved 30 ° C i 24 timer.
- Vælge enkelt kolonier, rense plasmid DNA ved hjælp af en endotoxin-fri plasmid forberedelse kit18 ifølge producentens anvisninger og bekræfte vektor integritet af Sanger sekventering17 (sekventering primer 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
- Konstruktionen er klar til injektion, fortsætte med trin 5.
5. forberede hydrodynamiske hale vene injektion til løsning
Bemærk: Forberedelse af konstruktioner til konstituerende og inducerbar genekspression er beskrevet i trin 1, 2, 3 og 4.
- Forberede steril 0,9% saltvand til injektion (gør ikke brug PBS). Bruge mængde, der svarer til omkring 10% af musen kropsvægt. Eksempel: for en mus vejer 20 g, forberede 2 mL af opløsning.
- Forberede injektion vektorer, der blev renset ved hjælp af en endotoxin-fri plasmid rensning kit18 (Se trin 1,8 eller 4.8, henholdsvis).
- Tilføje 10 µg eller 15 µg af endotoxin-fri Tornerose vektor konstruktion (fra trin 1 Brug 10 µg, fra trin 4 Brug 15 µg, henholdsvis) og 1 µg endotoxin-gratis pc-HSB521 pr. mL sterilt saltvand.
- Butik løsning for op til 4 h ved 4 ° C. Ikke fryse.
6. udføre hydrodynamiske hale vene injektion
- Bruge en Tilbageholderen til hale vene injektion (kommercielle eller forberedt fra en 50 mL konisk slange med huller for vejrtrækning og hale). Fyld bunden af røret med silkepapir.
- Til injektion, skal du bruge mus på omkring 8-10 uger gammel med vægte på 20-25 g.
- Vejer mus før injektion og forberede Injektionsvolumen efter legemsvægt (svarende til 10% af kropsvægten, se trin 5.1). Forberede en steril 3 mL-sprøjte med en 27 G-nål til injektion og fyld op med den nødvendige mængde.
- Placere musen i Tilbageholderen. Justere mængden af silkepapir (Se trin 6.1) at forlade kun minimal plads til bevægelse men plads nok til vejrtrækning.
- Sikre, at musen vejrtrækning regelmæssigt.
- Varm halen ved hjælp af en infrarød lampe for 30-60 s. nøje holde øje med tegn på overophedning.
- Ren hale med en spritserviet.
- Indsætte nålen næsten vandret i enten en af de to laterale hale årerne tæt på bunden af halen.
Bemærk: Hvis placeret med succes, en lille mængde blod kan strømme tilbage til kegle af nålen. Det anbefales ikke at aktivt Aspirér som enhver yderligere flytning af nålen kan resultere i dens deplacement og/eller skade af venen. - Injicere det samlede volumen i halen vene inden for 8-10 s.
- Straks fjerne musen fra Tilbageholderen. Komprimere injektion sår for mindst 30 s eller indtil nogen blødning aftager.
- Placere musen i et separat bur. Når musen er genoprettet efter procedure (omkring 30-60 min), overføre musen tilbage til sin oprindelige bur. Tjek på musen regelmæssigt i de næste 24 timer.
Bemærk: Mild sedation af musen er rutinemæssigt observeret i op til 2 timer efter injektion. - Før du fortsætter med yderligere eksperimenter (dvs., skridt 7), vent 10-15 dage for clearance af ikke-integrerede vektorer.
7. induktion af transfekteret CreER med Tamoxifen
Forsigtig: Tamoxifen er skadelig kan, være kræft eller skade forplantningsevnen. Henvises til sikkerhedsdatabladet.
- Planlægge intraperitoneal tamoxifen injektioner på tre på hinanden følgende dage.
- På dag 1, 10 mg tamoxifen i 40 µL ethanol opløses. Inkuber ved 55 ° C i 10 min. Vortex flere gange indtil tamoxifen er opløst.
- Tilføje 960 µL majsolie. Inkuber i 5 minutter ved 55 ° C. Vortex flere gange for at få en klar løsning.
- Forberede løsning i en 1 mL insulin sprøjte med en 27 G kanyle.
- Harmoniske musen ved at snuppe hals mus omhyggeligt med tommelfingeren og den anden finger, fastsættelse af halen mellem bunden af side og den fjerde og femte finger.
- Indsprøjtes 0,1 mL (= 1 mg tamoxifen) af løsningen intraperitoneal i den venstre nedre kvadrant af maven.
- Gentag injektionerne på dage to og tre.
8. induktion af tetracyclin-afhængige gen eller shRNA udtryk
Forsigtig: Doxycyclin kan være skadelige. Henvises til sikkerhedsdatabladet.
Bemærk: Afhængigt af den type og varighed af eksperimentet, doxycyclin kan også leveres i drikkevand (trin 8,1) eller chow (skridt 8,2)
-
For kort sigt eksperimenter (< 10 dage) administrere doxycyclin via drikkevand ved hjælp af følgende protokol.
- Opløses 5 g saccharose i 100 mL postevand. Autoklave.
- Opløs 100 mg doxycyclin-hyclat i 5 mL af rørsukkeropløsning (trin 8.1.1) i en 15 mL konisk slange.
- Ved hjælp af en 10-mL sprøjte, sterile filter løsning gennem en 0,2 µm filter. Tilføje til rørsukkeropløsning forberedt i trin 8.1.1.
- Levere doxycyclin-rørsukkeropløsning som drikkevand til musen. Kontroller dagligt og erstat, når løsningen bliver overskyet med angivelse af bakteriel overvækst (Erstat klar løsning efter tre dage på nyeste).
- For langsigtet eksperimenter (> 10 dage) eller eksperimenter følsomme til metaboliske ændringer, bruge kommercielle doxycyclin-chow (fxdoxycyklin hyclat Chow 0,625 g/kg) at undgå dehydrering og/eller saccharose-inducerede ændringer i lever af behandlede dyr.
9. forberedelse af mus lever til analyse af immunfarvning
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD kan være skadelige. Henvises til sikkerhedsdatabladet.
Bemærk: Tidspunkt når mus vil blive analyseret afhænger af eksperimentet. Det anbefales at analysere levervæv efter ikke mindre end tre dage af doxycyclin behandling for at sikre tilstrækkelig induktion af transgenet eller shRNA udtryk.
- Forberede en 1 mL sprøjte med en 27 G kanyle med 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD løsning (PFA).
- Aflive mus efter en passende metode efter en godkendt animalske protokol.
Bemærk: Retningslinjer for egnede metoder af eutanasi kan variere afhængigt af institutionen. - Bughulen bruger dissekere saks og anatomisk pincet, omhyggeligt åbne med en median laparotomi at eksponere leveren. Flytte tyndtarmen til højre for at udsætte Vena, og ringere vena cava (IVC).
- Indsætte nålen af rede sprøjten (Se trin 9.1) ind i IVC og cut Vena. Indsprøjte 1 mL af PFA langsomt i IVC til perfuse levervævet og fjerne auto-fluorescerende rød blod celler (ønskeligt hvis immunfluorescent farvning vil blive udført).
- Fjerne leveren. Skylles i vand og overføres til 5-10 mL af 4% PFA løsning.
- For paraffinsnit er fix væv for 36-48 h. væv klar til dehydrering og paraffin indlejring.
-
For frosne afsnit, fastsætte væv i 4% PFA for 1 h.
- For cryoprotection, overføre til 10% rørsukkeropløsning. Inkuber 60 min.
- Overførsel til 20% rørsukkeropløsning. Inkuber 60 min.
- Overførsel til 30% rørsukkeropløsning. Inkuber 12 – 16 h. Integrer i indlejring sammensatte for frosne sektioner og fryse ved-20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transfektion effekten af hydrodynamiske hale vene injektion: Procentdelen af murine hepatocytter, der er transfekteret hydrodynamically af en enkelt injektion er variabel og afhænger af flere parametre såsom Injektionsvolumen, injektion tid, mængde injiceret DNA, og størrelsen af den injicerede konstruere6, 22,23. Derudover er Transfektion effektivitet generelt lavere i større dyr, hvor en større kar diameter samt større sinusformet område fører til et fald i samlede pres. For at visualisere Transfektion effektivitet, blev HTVI af en CreER transposon konstruktion udført i mus husly et Rosa26mTmG reporter gen efterfulgt af tamoxifen-medieret aktivering af CreER konstruktion. Lav Injektionsvolumen eller langvarig injektion tid for tekniske grunde resulterer i reducerede Transfektion effektivitet med kun et par transfected hepatocytter kan spores i hele leveren, mens optimal injektion betingelser resultere i højere Transfektion effektivitetsgevinster som afbildet af reporter farvning efter HTVI af en CreER transposon (figur 1A). For at vurdere Transfektion effektivitet, er immunfarvning af transfected transgenet eller – som i tilfældet med CreER - af et egnet reporter gen stærkt anbefales. Alternativt, Transfektion effektivitet kan vurderes fra mRNA udtryk analyse af transfected transgenet.
Transfektion af pericentral hepatocytter: Efter hydrodynamiske indsprøjtning, kan en trykgradient langs den sinusformede plads - hvor trykket er højest tæt på den centrale vene og lavest i periportal areal - føre til foretrukne Transfektion i området pericentral. Vi analyserede lever med en lav procentdel af transgenet-udtrykker hepatocytter og vurderet deres relative placering i den lever lobule af co-immunfarvning for glutamin syntetase (GS), en markør for pericentral hepatocytter. Interessant, fleste af hepatocytter, der viste reporter gen expression efter HTVI af en CreER konstruktion grupperet omkring den centrale vene, men ikke portal område (figur 1B) der angiver højere Transfektion effektivitet omkring den centrale vene.
In vivo imaging efter HTVI af en luciferase transposon: For at vurdere, om en enkelt kopi integration observeret efter HTVI af transposon konstruktioner24 er tilstrækkelig til i vivo billeddannelse, vi injiceres en transposon konstruktion husly en luciferase udtryk kassette under kontrol af en bestemt lever promotor konstruktion. Mus blev sprøjtet med luciferin og afbildet med en i vivo imaging system to uger efter HTVI (figur 2A). Imaging viste robust og stabil luciferase bioluminescens i leveren 15 dage efter injektion og på senere tidspunkter (figur 2B og data ikke vist). Disse resultater viser, at systemet med held kan anvendes til at følge tilstedeværelsen af transfekteret celler i vivo af bioluminescens billeddannelse.
Kombineret CreER og inducerbar transgen eller shRNA udtryk: Vi tidligere har genereret en transposon konstruktion, der kombinerer den konstituerende udtryk for en inducerbar Cre recombinase (CreER) med inducerbar udtryk for en transgen eller en shRNA af valg20 (figur 3A). Indsprøjtning af denne konstruktion i Rosa26mTmG-reporter mus og CreER aktivering af tamoxifen viste robust udtryk for reporter gen svarende til de opnåede resultater med en transposon konstruktion for enkelt transgen udtryk ( Figur 3B). Efter doxycyclin behandling, kan inducerbar transgen udtryk visualiseres ved passende antistoffer i transfekteret hepatocytter (figur 3 c). For inducerbar shRNA udtryk anbefales en normal god landbrugspraksis-shRNA konstruktion som cytoplasmatisk normal god landbrugspraksis udtryk påvises ved immunfarvning kan bruges som surrogat markør for shRNA udtryk (figur 3D). Af note er transgen eller shRNA udtryk, henholdsvis kun påvises i en delmængde af hepatocytter, som kan være på grund af det relativt høje niveau af protein udtryk bruges til registrering af immunfarvning20.
Figur 1: Transfektion af hepatocytter ved HTVI. (A) variabel Transfektion effektivitet efter HTVI af en CreER-transposon ind i musene husly en Rosa26mTmG / + reporter og efterfulgt af behandling med tamoxifen. Transfekteret hepatocytter er positive for membran-bundet grønne fluorescerende proteiner (NGL, grønne). (B) co farvning for CreER aktiveret hepatocytter (grøn) i mus husly Rosa26mTmG reporter med central vene markør glutamin syntetase (GS, rød). Her PV: portal vene, CV: central vene. Skala søjler repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: In vivo billeddannelse af luciferase. (A) Transposon konstruere indeholdende en luciferase udtryk kassette (ikke tiltrukket af skalaen). Injektion og behandling ordning for visualisering af hepatisk luciferase udtryk. SB: sovende skønhed genkendelsessekvenser, HTVI: Hydrodynamisk hale vene injektion. (B) repræsentativt billede af hepatisk luciferase bioluminescens 15 dage efter HTVI af en transposon-luciferase konstruktion med pHSB5 ved hjælp af en i vivo imaging system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kombineret CreER og inducerbar gen/shRNA udtryk. (A) Transposon konstruere for udtryk for inducerbar Cre recombinase sammen med udtryk for en tetracyklin-inducerbar transgen eller shRNA (pTC Tet), ikke trukket til at skalere. (B) grønne membran farvning angiver transfekteret hepatocytter efter injektion af pTC Tet konstruktion i Rosa26mTmG / + reporter mus og CreER aktivering med tamoxifen. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. (C) inducerbar genekspression 5 dage efter doxycyclin behandling kan visualiseres ved immunfarvning for transgen (YAP, red) i transfekteret hepatocytter. (D) inducerbar miR-shRNA udtryk 5 dage efter doxycyclin behandling fremgår af cytoplasmatisk grøn fluorescerende proteiner (NGL) farvning af normal god landbrugspraksis-shRNA konstruktion. Transfekteret hepatocytter er skildret af membran-bundet normal god landbrugspraksis. Skalere barer i C) og D) repræsenterer 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfektion af hepatocytter med Hydrodynamisk hale vene injektion er blevet en etableret metode siden introduktionen mere end 15 år siden6. Den injicerede volumen overstiger minutvolumen og løber fra den ringere vena cava i sinusoids af leveren7, fører til Transfektion af ca 10-20%, i nogle tilfælde op til 40% af hepatocytter25,26. Prædiktorer for en vellykket Transfektion er den injicerede volumen pr. injiceres tid22,23. Derfor er en lav Transfektion effektivitet (figur 1A, venstre panel) normalt på grund af den manglende bevare injektion hastighed under proceduren7. Men selv med en optimal teknik, Transfektion effektivitet, der opnås ved HTVI vil forblive under den sats, der fremkommer ved virusinfektion med adenovirus eller adeno-associeret virus, der kan nå op på næsten 100%5,27 . For at opnå succesfulde hale vene injektioner, er det afgørende at sikre en stabil placering af nålen i blodkar. Dette opnås nemt i venerne med større diameter tættere til bunden af halen. Derudover er dilatation af vene af opvarmning af halen stærkt anbefales. De bedste resultater er opnået ved hjælp af en infrarød lampe, men en ikke-infrarød varmelampe eller nedsænkning af halen i varmt vand kan også bruges. I nogle tilfælde supplere op til 200 µL af saltvand ved intraperitoneal injektion omkring 30 minutter før HTVI vil forbedre hydrering status af dyrene resulterer i udvidelse af blodkarrene. For at opretholde en konstant injektion hastighed, skal halen af musen fastholdes grundigt for at undgå enhver bevægelse af halen, hvilket kan føre til fordrivelse af nålen. Til valideringsformål foreslår vi at bruge en konstruktion, der kan påvises ved immunfarvning. Alternativt, Transfektion effektivitet kan vurderes af mRNA udtryk analyse eller sekventering af integreret DNA28.
Vores data viser, at transposon integration fortrinsvis er observeret i området pericentral i leveren lobule. Den fremherskende Transfektion af hepatocytter omkring den centrale vene er sandsynligvis på grund af den unikke Hæmodynamik af HTVI, som det også er observeret i ikke-transposon baseret Transfektion29. Denne konstatering kan være af relevans for nogle programmer, som induktion af akut leverskade ved CCl4, som først og fremmest påvirker pericentral hepatocytter. I forbindelse med lav Transfektion effektivitet, kan CCl4 behandling derfor føre til betydelig reduktion af antallet af transfekteret hepatocytter. Derudover er HTVI for begrænsede anvendelse til målceller periportal herunder galdegang celler15.
Ud over systemer, der udnytter HTVI af transposon konstruktioner for at opnå stabil udtryk for en enkelt transgen, fremlagt vi for nylig et system der tillader fælles udtryk for CreER og inducerbar udtryk af et gen eller en miR-shRNA fra en enkelt vektor11 . Dette system er især nyttig til at afhøre specifikke gener i Cre/LoxP-baserede mus stammer. Som transgener eller shRNA konstruktioner er indført ved en hurtig og pålidelig recombinational kloning procedure, kan systemet nemt tilpasses til screening tilgange. Vektorsystem medierer pålidelige inducerbar udtryk i vivo der er helt afhængige af leveringen af doxycyclin11,30. Denne praktisk video-baserede vejledning indeholder trinvise instruktioner fra kloning af egnet vektorer over induktion af genekspression til analyse af levervævet.
For at sikre systemets effektivitet, kan flere aspekter bør holdes for øje: for at opretholde lang sigt udtryk, genomisk integration er medieret på TA-sites af sovende skønhed transposase8,11. Da integration effektivitet er afhængig af transposon størrelse, er det vigtigt at holde størrelsen af transgenet konstruktion i tankerne, når du udformer vektor31. Derudover er udtryk effektivitet af varens inducerbar genet i leveren afhængig af rtTA3-promotor11. Brug af en vektor konstruktion med en lever for optimal udtryk resultater specifikke ApoE.HCR.hAAT-promotor anbefales (Addgene #85578), da det viser den højeste effektivitet i en sammenligning af tre evalueringsudvalget11. Med en optimeret promotor konstruktion, kan inducerbar transgen/shRNA udtryk påvises ved immunfarvning i op til 30% af transfekteret celler20. Hvis inducerbar protein niveauer findes under en bestemt tærskel, der er nødvendig for registrering af immunfarvning, skal dette bestemmes. Vigtigere, kan ingen transgen/shRNA udtryk påvises ved immunfarvning i mus, der ikke blev behandlet med doxycyklin. Endelig, udtrykket af gener under kontrol af tetracyklin svar element (TRE) er afhængig af dosis af doxycyclin32,33. Til kortsigtede forsøg er doxycyclin administration via drikkevand veletableret34,35. Saccharose tilføjes normalt giver en bedre smag. Men dette kan føre til polydipsi og dehydrering, og brugen af doxycyclin chow er stærkt anbefales til langsigtet eksperimenter36,37.
I Resumé er hydrodynamiske hale vene injektion en bredt etableret metode i leveren forskning. Dets program spænder fra studier af hepatitis B til lever fibrose eller hepatocellulært carcinom modeller38,39,40,41. Systemet beskrevet i dette håndskrift er især nyttig i forhør af specifikke mål gener i Cre/LoxP-baserede modeller af leversygdom. Overekspression i leveren kan derudover også bruges til forskning af hæmatologiske sygdomme42,43 eller at tackle immunologiske spørgsmål44,45. Ud over analysen af specifikke gener af interesse, kan præsenteres systemet også let tilpasses til screening eller multiplexing tilgange. Denne video-baserede vejledning vil derfor være nyttigt for et stort fællesskab af forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Krebshilfe, Tyskland (tilskud antal 111289 til UE), Lucile Packard Foundation for børns sundhed (Ernest og Amelia Gallo begavet postdoc stipendium - CTSA tilskud antal UL1 RR025744 til UE). Vi takker Dr. Mark A. Kay for vektor konstruktioner og eksperimenterende rådgivning og Dr Julien Sage til mus og eksperimentel støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al.
- Ivics, Z., Izsvak, Z.
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
