Summary

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

Published: November 03, 2017
doi:

Summary

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 심각한 DNA 병 변. 형성 및 DSB의 수리 분석은 게놈 무결성, genotoxicity, 방사선 생물학, 노화, 암, 및 신약 개발 등 연구 분야의 넓은 스펙트럼에 관련. 응답에서 DSB, 히스톤 H2AX 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 개별 핵 foci 감지를 형성 하는 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에 phosphorylated은. 또한, 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1)은 또 다른 중요 한 DSB 반응 단백질 nonhomologous 끝 동종 재결합 하면서 가입 하 여 DSB의 복구를 추진. ΓH2AX와 53BP1의 특정 기능에 따라 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 결합 된 분석 DSB의 상세한 분석에 대 한 합리적인 접근 있을 수 있습니다. 이 원고는 단계별 프로토콜을 기술을 수행 하기 위한 조직적 노트와 보충을 제공 한다. 특히, γH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 셀 라인 NHDF의 정상적인 fibroblasts에 시연입니다. 또한, biomarker는으로 γH2AX foci의 값은 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포에 그려져 있습니다. 마지막으로, 유전자 불안정성의 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 조사.

Introduction

DNA는 지속적으로 내 생에 의해 손상 (예를 들어, 복제 스트레스, 반응성 산소 종, DNA의 본질적인 불안정성) 및 외 인 (, 화학 기, 방사선) 소스 (그림 1)1,2 ,,34. DNA 손상, 중 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 특히 심각한 병 변 그리고 세포 죽음 또는 발암을 일으킬 수 있습니다. 약 50 DSB는 세포와 세포 주기5당 발생할 수 있습니다. 포유류 세포, 동종 재결합 (HR) 및 nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 개발 DSB (그림 2)의 복구에 대 한 주요 경로. 인사 늦게 S/g 2 단계에서 발생 하 고 그대로 동생을 사용 하 여 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 템플릿으로 chromatid. 비교에서는, NHEJ 기본적인 쌍을 추가 또는 깨진된 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다 및 잠재적으로 돌연변이 세포 주기입니다. 또한, 대체 최종 합류 NHEJ 결핍6,7시 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘으로 약혼 수 있습니다.

DSB 각 DSB 주위 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에서 히스톤 H2AX의 인 산화를 유도. 형성 핵 foci γH2AX foci 이름이 되며 면역 형광 검사 현미경 검사 법8감지. ΓH2AX 추가 DSB 반응 단백질의 신규 모집을 촉진 하 고 개장 하는 chromatin, DNA 수리, 및 신호 변환9에 관여. 각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 정량화는 가능,이 암 세포 선 및 환자 표본10,11, 에서 입증 되었습니다. 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1) DSB 수리 중재에 또 다른 주요 단백질 이다. 그것은 DSB 반응 단백질, 검사점 신호, 그리고 DSB 끝15synapsis의 채용에 관여. 또한, 53BP1 DSB 복구 경로 선택에서 중요 한 역할을 하고있다. 그것은 시간 동안 방해16NHEJ 향해 DSB의 수리를 트리거합니다. ΓH2AX 및 DSB 수리에 53BP1의 진정한 기능을 고려 하면 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해의 동시 분석 형성 및 DSB의 복구의 정확한 분석을 위한 유용한 방법 있을 수 있습니다.

이 원고는 세포 핵에 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 수행 하기 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 특히, 기술은 셀 라인 NHDF, 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포와 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서의 정상적인 fibroblasts에 적용 됩니다. 방법의 세부 정보는 제시 결과의 맥락에서 지적 했다.

Protocol

여기에서 설명한 모든 방법을 의료 학부 임 하이델베르크 대학 윤리 위원회 II에 의해 승인 되었습니다. 모든 개인에서 동의 얻어 작성. 1. 재료의 준비 응고 제 재고 솔루션: 0.9% 염화 나트륨에에서 mL 당 200 I.U. 덤플링의 항 응 혈 약 재고 솔루션을 준비. 컬렉션 튜브의 각 채우기 (볼륨 그릴 9 mL) 혈액 또는 골 수 샘플의 철수 하기 전에 항 응 혈 약 재고 솔?…

Representative Results

셀에 γH2AX foci의 분석 G0/G1 단계 그리고 G2 단계 γH2AX foci (그림 5A) 고유한 형광 점으로 표시 하는 때에 가장 정확 하다. 반면, S 단계 세포에 γH2AX foci의 분석 복제 프로세스 (그림 5B)에 의해 발생 하는 분산된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 의해 복잡 합니다. 셀의 고정 4% 수행한 PFA (10 분) 및 0.1% pe…

Discussion

면역 형광 검사 현미경 검사 법의 γH2AX와 53BP1 형성 및 연구 분야의 넓은 스펙트럼에서 DSB의 수리 분석을 위한 유용한 방법입니다. 실험의 결과 좌우 하는 중요 한 매개 변수는 세포 주기, 고정 및 permeabilization 세포, 항 체, 그리고 하드웨어의 선택과 형광 현미경의 소프트웨어 사용 하는 에이전트의 단계.

ΓH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 정상 섬유 아 세포 세포 라인 NHDF의 기…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

프로젝트는 독일 호세 카레라스 백혈병 재단 (DJCLS 14 R/2017)에 의해 지원 되었다.

Materials

RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody Invitrogen A-21428 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

References

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Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

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