Summary

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Published: November 03, 2017
doi:

Summary

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Abstract

Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Introduction

O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)1,2 ,3,4. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular5. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR) e não-homólogos final-adesão (NHEJ) desenvolveram-se como principais vias para a reparação de ORL (Figura 2). RH ocorre no final da fase S/G2 e usa uma irmã intacta cromátides irmãs como um modelo para reparação potencialmente livre de erros. Em comparação, NHEJ é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente mutagénicas como pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades quebradas. Além disso, final alternativo-adesão pode ser contratado como um mecanismo lento mutagénicas backup reparação em caso de deficiência NHEJ6,7.

DSB induzir a fosforilação da histona H2AX em serina 139 em uma região de vários pares de megabase ao redor de cada DSB. Os focos de formação nucleares são denominados focos de γH2AX e são detectáveis por microscopia de imunofluorescência8. ΓH2AX promove o recrutamento de mais proteínas DSB-responsiva e está envolvido na cromatina remodelação, reparação de DNA e de transdução de sinal9. Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, a quantificação do DSB por microscopia de imunofluorescência é possível, que tem sido demonstrada em linhas de células de câncer e espécimes paciente10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra proteína-chave na mediação reparação de ORL. Está envolvido no recrutamento de DSB-responsivo proteínas, sinalização de ponto de verificação e a sinapse de ORL termina15. Além disso, 53BP1 desempenha um papel crítico na escolha de caminho de reparação de ORL. Ele aciona a reparação de ORL para NHEJ enquanto HR é impedido de16. Considerando as funções genuínas de γH2AX e 53BP1 no reparo DSB, a análise simultânea de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser um método útil para a análise precisa da formação e reparação de ORL.

Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células. Especificamente, a técnica é aplicada em fibroblastos normais da linha celular NHDF, em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável e em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Os detalhes do método são apontados no contexto dos resultados apresentados.

Protocol

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos. 1. preparação de materiais solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sa…

Representative Results

Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B). Fixação das células foi rea…

Discussion

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.

A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonst…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O projeto foi apoiado pela Fundação de leucemia do alemão José Carreras (14 DJCLS R/2017).

Materials

RPMI medium Sigma-Aldrich R0883 Medium for cell culture
Heparin sodium ratiopharm PZN 3029843  Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9% B. Braun PZN 1957154 Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X Sigma-Aldrich 59427C Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-046-702 Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides Thermo Scientific ER-203B-CE24 Microscope slides
Megafuge 1.0 R Heraeus 75003060  Tabletop centrifuge 
Cytospin device
Lid Heraeus 76003422 Lid for working without micro-tubes
Cyto container Heraeus 75003416 Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier Heraeus 75003414 Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert Heraeus 75003417 Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9) Thermo Scientific 85112 Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M Merck Millipore 109107 Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Fixation agent
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 Balanced salt solution
Chemiblocker Merck Millipore 2170 Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) Merck Millipore 05-636 Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) Novus Biologicals NB100-304 Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody Invitrogen A-11001 Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody Invitrogen A-21428 Secondary antibody
Vectashield mounting medium Vector Laboratories H-1200 Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1 Zeiss 490035 Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera Metasystems H-0310-010-MS Camera system for digital recording
Isis software Metasystems Not applicable Microscope software

References

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Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J. Vis. Exp. (129), e56617, doi:10.3791/56617 (2017).

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