Summary
Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.
Abstract
Roturas de DNA doble cadena (DSB) son graves lesiones de ADN. Análisis de la formación y reparación de DSB es relevante en un amplio espectro de áreas de investigación incluyendo la integridad del genoma, genotoxicidad, Radiobiología, envejecimiento, cáncer y desarrollo de medicamentos. En respuesta a OSD, la histona H2AX es fosforilada en serina 139 en una región de varios pares de megabase formando discretos focos nucleares detectables por microscopia de la inmunofluorescencia. Además, 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína sensible al OSD importante promover la reparación de DSB por nonhomologous end-joining evitando la recombinación homóloga. Según las funciones específicas de γH2AX y 53BP1, el análisis combinado de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un enfoque razonable para un análisis detallado del OSD. Este manuscrito ofrece un protocolo paso a paso con notas metódicas para la realización de la técnica. Específicamente, se demuestra la influencia del ciclo celular en patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Además, el valor de los focos de γH2AX como un biomarcador es representado en los linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano. Finalmente, se investiga inestabilidad genética en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.
Introduction
DNA se daña continuamente por endógeno (p. ej., estrés de replicación, especies reactivas de oxígeno, la inestabilidad intrínseca del ADN) y exógenos (por ejemplo, los radicales químicos, irradiación) fuentes (figura 1)1,2 ,3,4. Entre los daños en el ADN, roturas de DNA doble cadena (DSB) son particularmente graves lesiones y pueden inducir la muerte celular o carcinogénesis. Cerca de 50 OSD puede surgir por célula y ciclo celular5. En células de mamífero, recombinación homóloga (HR) y nonhomologous end-joining (NHEJ) desarrollados como principales vías para la reparación de DSB (figura 2). HR se produce en la fase de finales S/G2 y utiliza una hermana intacta cromátide como plantilla para la reparación potencialmente libre de errores. En comparación, el NHEJ es activa durante todo el ciclo de la célula y potencialmente mutagénicos como pares de bases puede ser añadidos o resecados antes de la ligadura de los extremos rotos. Además, unirse a final alternativo se podrá contratarse como un mecanismo de lenta reparación mutagénica de respaldo en caso de deficiencia NHEJ6,7.
DSB inducen la fosforilación de la histona H2AX en 139 de serina en una región de varios megabase pares alrededor de cada OSD. Los focos nucleares formando se denominan focos de γH2AX y son detectables por inmunofluorescencia microscopia8. ΓH2AX promueve el reclutamiento de proteínas más sensible al OSD y participa en la remodelación de la cromatina, la reparación del ADN y de transducción de señal9. Como cada enfoque γH2AX se considera representar un OSD único, la cuantificación del OSD por microscopia de la inmunofluorescencia es posible, que se ha demostrado en líneas celulares de cáncer y muestras de los pacientes10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína clave en la mediación reparación DSB. Está implicado en el reclutamiento de DSB-responsivo proteínas, puesto de control las señales y la sinapsis de OSD extremos15. Además, 53BP1 desempeña un papel fundamental en la elección de vía de reparación DSB. Activa la reparación de DSB hacia NHEJ mientras que HR es prevenido16. Teniendo en cuenta las funciones originales de γH2AX y 53BP1 en reparación DSB, el análisis simultáneo de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un método útil para el análisis exacto de la formación y reparación de DSB.
Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para realizar microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 en núcleos celulares. Específicamente, la técnica se aplica en fibroblastos normales de la línea celular NHDF, en linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano y en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda. Los detalles del método se señalan en el contexto de los resultados presentados.
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Protocol
todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el II Comité de ética de la Mannheim facultad médica de la Universidad de Heidelberg. Escrito el consentimiento informado fue obtenido de todos los individuos.
1. preparación de materiales
- solución anticoagulante: Prepare una solución anticoagulante de 200 U.I. heparina / mL en cloruro de sodio 0.9%. Llenar cada uno de los tubos de colección (dibujar volumen 9 mL) con 2 mL de la solución anticoagulante antes de retiro de las muestras de sangre o médula ósea.
- Solución de lisis de glóbulos rojos: preparar el 10 x solución de lisis de eritrocitos con 82,91 g de cloruro de amonio, bicarbonato de amonio 7,91 g y 2 mL de 0,5 M solución de ácido etilendiaminotetraacético a un pH de 8.0 mediante la disolución de los agentes en doble y agua destilada para un volumen total de 1 L.
- Solución de fijación: 8.3 Añadir μl de una solución de hidróxido de potasio de 1 M a paraformaldehido (PFA) de la 360 mg en un tubo de microtitulación. Llenar el tubo con tampón fosfato salino (PBS) hasta la marca de 1 mL del tubo y el tubo en un bloque calefactor a 95 ° C para obtener 1 mL de una solución PFA 36% del calor. Transferir la solución PFA de 36% 1 mL a un tubo con una capacidad de 15 mL. Añadir 8 mL de PBS a la solución 1 mL para el PFA de 36%, a 9 mL de una solución madre de PFA 4%. Alícuota de la solución madre de PFA 4% y almacenar a-18 ° C hasta que utilizan para la fijación de las células.
PRECAUCIÓN: 1) Potasio hidróxido en solución es corrosivo. Ser conscientes de la protección cutánea y ocular. 2) PFA es carcinogénico. Evite el contacto con la piel y la inhalación. Preparar la solución de fijación bajo una campana de. - Solución de permeabilización: añadir 50 μl Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obtener una solución de aproximadamente 0.1% Octoxinol 9.
- Bloqueo de solución: Prepare 5% y 2% bloqueo soluciones mezclando el agente bloqueador de proteínas con PBS y tienda en 6 – 8 º C.
2. Preparación de las muestras
- fibroblastos en cultivo celular: cultivar fibroblastos humanos de la línea celular NHDF en humidificado 5% CO 2 ambiente a 37 ° C en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 4 mM glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Preparación de portaobjetos de un microscopio con adherente fibroblastos
- Retire el medio del frasco (área de crecimiento 75 cm 2) con el exponencial crecimiento fibroblastos NHDF. Añadir 10 mL de PBS en el matraz. Lavar los fibroblastos adherentes suavemente agitando manualmente el matraz durante 1 minuto
- Quitar el PBS y añadir tripsina 1 mL en el matraz. Agite el frasco suavemente para asegurarse de que todas las células adherentes son cubiertas por la tripsina. Retire el matraz a la tripsina. Poner el matraz en la incubadora durante 5 min a 37 ° C.
- Tomar el frasco de la incubadora y añada 10 mL de RPMI 1640 medio en el matraz. Pipeta el medio arriba y abajo varias veces para dispersar a los fibroblastos.
- Pipeta 0,3 mL de los fibroblastos dispersos en cada uno de los dos campos del portaobjetos y colocar la corredera en la incubadora durante 24 h para que los fibroblastos se adhieren a la diapositiva. Para la inmunotinción de γH2AX y 53BP1 en los núcleos de los fibroblastos, pasar al paso 3.1.
- Preparación de portaobjetos de un microscopio con adherente fibroblastos
- Las muestras de pacientes
- las muestras de sangre: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante y añadir 7 mL de sangre en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3).
- Las muestras de médula ósea: utilizar los tubos de colección que se rellenaron con 2 mL de la solución anticoagulante (paso 1.1) y añadir 7 mL médula en los tubos. Almacenar las muestras durante la noche a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C). Al día siguiente, aislar la fase G0/G1 de reposo las células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad (paso 2.2.3). Utilizar microesferas de CD34 y células columnas de separación para el aislamiento de células CD34 +.
- Aislamiento de células mononucleares mediante centrifugación de gradiente de densidad
Nota: Las células mononucleares son aisladas de muestras de médula ósea y sangre por centrifugación del gradiente de densidad 17 , 18 , 19.- Diluir la muestra de sangre heparinizada en una proporción de 1:1 con PBS y la muestra de médula ósea heparinizada en una proporción de 1:3 con PBS. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces.
- Añadir un volumen de densidad gradiente medio a un tubo nuevo. Suavemente la capa diluida sangre o médula ósea en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no para mezclar las dos capas.
- Centrifugar el tubo durante 30 min a temperatura ambiente y x 400 g. extraer la capa superior de plasma con la pipeta. Luego cosechar cuidadosamente las células mononucleares en la capa por encima de la media de gradiente de densidad. Transferencia de las células mononucleares en un tubo fresco.
- Agregar por lo menos tres volúmenes de PBS a las células mononucleares en el tubo. Suspender las células suavemente por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces. Centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x
- Después de la vuelta, quite el sobrenadante y añadir 10 mL de 4 ° C, 1 x solución de lisis de glóbulos rojos. Resuspender suavemente las células por dibujarlos dentro y fuera de la pipeta dos veces y coloque el tubo en hielo durante 5 minutos. Añada 30 mL de PBS a 4 ° C y centrifugar el tubo durante 10 min a temperatura ambiente y 400 g. x
- Preparación de los cytospins
- preparar dos cytospins con células mononucleares de las muestras del paciente (es decir, un cytospin para la tinción de inmunofluorescencia γH2AX y uno cytospin para γH2AX y 53BP1 combinado de tinción de inmunofluorescencia) por centrifugación (300 x g, 10 min) de 1.0 x 10 5 células para cada preparación ( figura 3 y 4).
3. γH2AX y 53BP1 tinción de inmunofluorescencia
- fijación y permeabilización: fijar las células con 200 μL de 4% PFA durante 10 minutos. Después de la fijación, lave las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS durante 5 minutos en un agitador de laboratorio. Luego permeabilizar las células con 200 μL de 0,1% Octoxinol 9 durante 10 minutos lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de solución de bloqueo de 5% por 5 min en un agitador de laboratorio. Bloquear las células en 30 mL de dulce 5% bloquea la solución 1 h.
- Incubación con los anticuerpos
- incubar una preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y la otra preparación de las células con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de ratón (1: 500) y un policlonales anti-53BP1 anticuerpos (1: 500) durante la noche a 4 ° C.
- Después de incubación lavado las células suavemente 3 veces con 30 mL de solución de bloqueo del 2% por cada 5 min en un agitador laboratorio.
- Quitar la solución de bloqueo e incubar la primera preparación de las células con un anticuerpo secundario de cabra Alexa488 conjugado anti-ratón (1: 500) y la segunda preparación de las células con una cabra Alexa488 conjugado anticuerpo secundario anti ratón ( 1: 500) y un burro Alexa555 conjugado anti-conejo de anticuerpo secundario (1: 500) por 1 h a temperatura ambiente.
- Medio de montaje: poner la diapositiva con las células en un bol y lavar las células suavemente tres veces con 30 mL de PBS por cada 5 min en un agitador de laboratorio. Retirar el PBS y Monte las células con medio de montaje que contiene 4, 6-diamidino-2-phenylindole. Poner cuidadosamente un cubreobjetos sobre el medio de montaje para que burbujas de aire no son incrustado. Esperar al menos 3 h para endurecer el de medio de montaje antes de analizar las células por microscopía de fluorescencia.
4. Análisis de γH2AX y 53BP1 focos
- microscopía de fluorescencia: analizar los focos γH2AX y 53BP1 en los núcleos de la célula con un microscopio de epifluorescencia equipado con los filtros DAPI, Alexa 488 y Cy3 durante proyección de imagen en un objetivo de X 100 Ampliación. Grabar imágenes con una cámara y procesar las imágenes con software de imagen apropiado.
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Representative Results
Análisis de los focos de γH2AX en las células es más precisa en la fase G0/G1 y el G2 fase cuando γH2AX focos aparecen como puntos fluorescentes distintas (figura 5A). En contraste, análisis de focos de γH2AX en las células durante la fase S se complica con puntos dispersos γH2AX pan-nuclear causados por el proceso de replicación (figura 5B).
Fijación de las células fue realizada con 4% PFA (10 min) y permeabilización con 0.1% Octoxinol 9 (10 min). Metanol puede ser utilizado para la fijación y permeabilización, también; sin embargo, metanol puede romper los núcleos celulares muy seriamente y borrón de transferencia hacia fuera de los focos de γH2AX para los focos de γH2AX no pueden aparecer distintos en comparación con los focos de γH2AX obtenidos por tratamiento con 4% PFA y 0.1% Octoxinol 9.
La elección de anticuerpos eficientes es crítica para la microscopia de la inmunofluorescencia eficaz. Se realizaron experimentos con un anticuerpo monoclonal anti-γH2AX de primario de ratón y un anticuerpos policlonales anti-53BP1 primario para la tinción de inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1, respectivamente.
Como cada enfoque γH2AX se considera representar un OSD único, inmunofluorescencia, tinción de γH2AX puede utilizarse para la cuantificación de DSB en tejidos irradiados. Niveles de focos γH2AX en linfocitos irradiados (figura 6) son proporcionales a la dosis de irradiación20,21. Focos de γH2AX pueden alcanzar un máximo ya 5 minutos de irradiación20,22. La decadencia de los focos de γH2AX en los puntos más adelante en el tiempo puede controlarse y refleja la reparación de DSB20,21,22.
Inestabilidad genética puede analizarse manchando de la inmunofluorescencia combinada de γH2AX y 53BP1 en líneas celulares y tumor muestras10,11,12,13,14. Se realizó un análisis ejemplar en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda (figura 7). Co-localización de γH2AX y 53BP1 indica promoción de mecanismos de reparación NHEJ 53BP1-mediada en los sitios de OSD y HR fue prevenido. Sin embargo, el porcentaje de co localización γH2AX y 53BP1 focos en blastos de la leucemia mieloide aguda fue variable. Los focos de γH2AX sin una señal adicional 53BP1 podrían han participado HR para la reparación de DSB en última fase S/G2. El papel de la singular 53BP1 focos seguía siendo difícil de alcanzar.
Figura 1: Fuentes y consecuencias del ADN endógeno y exógeno dañan1,2,3,4. OSD, roturas de doble cadena de ADN; NHEJ, nonhomologous end-joining.
Figura 2 : Vista esquemática de la rotura de doble cadena de ADN principales (OSD de la) reparación de mecanismos en células de mamíferos. Recombinación homóloga utiliza una intacta hermana chromatid en última fase S/G2 para reparación potencialmente libre de errores de OSD. Nonhomologous end-joining (NHEJ) es activa durante todo el ciclo de la célula y potencialmente propenso como pocos pares de bases puede ser añadidos o resecados antes de la ligadura de los extremos de la OSD. Final alternativo-joining es un mecanismo de lenta reparación mutagénica de respaldo que podría involucrarse en el caso de la deficiencia de NHEJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Dispositivo para la preparación de los cytospins. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Preparación de los cytospins. Dos cytospins de cada muestra se preparan por centrifugación de 1.0 x 105 células a 300 x g durante 10 minutos. Uno cytospin se utiliza para la tinción de inmunofluorescencia de γH2AX y otro cytospin se utiliza para γH2AX combinada y tinción de inmunofluorescencia 53BP1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Ciclo celular dependiente de patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. (A) γH2AX focos (verde, Alexa 488) en los núcleos (azul DAPI) de fibroblastos NHDF aparecen como puntos distintos en la fase G0/G1 o G2. (B) γH2AX focos en los núcleos de los fibroblastos en fase S aparecen como dispersos puntos nucleares pan (barra de escala = 5 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : ΓH2AX focos de rayos x irradiaron los linfocitos de un individuo sano. Las imágenes de los focos de γH2AX (verde, Alexa 488) en los núcleos (azul DAPI) de linfocitos se registran por 5 min después de la irradiación con 100 mGy (barra de escala = 5 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Co-localización de focos γH2AX y 53BP1 en células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda. La localización de focos de γH2AX (verde, Alexa 488) y 53BP1 focos (rojo, Cy3) indica promoción de mediada 53BP1 nonhomologous end-joining mecanismos de reparación en los sitios de roturas de doble cadena de DNA (barra de escala = 5 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de la formación y reparación de DSB en un amplio espectro de áreas de investigación. Los parámetros críticos que influyen en el resultado de los experimentos son la fase del ciclo celular, los agentes utilizados para la fijación y permeabilización de las células, la elección de los anticuerpos y el hardware y el software del microscopio de fluorescencia.
La influencia del ciclo celular en patrones de focos de γH2AX fue demostrada por el exponencial crecimiento fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Los focos de γH2AX aparecieron como distintos puntos fluorescentes en G0/G1 y fases G2 en comparación con los puntos dispersos γH2AX pan-nuclear en fase de S (figura 5). Los focos de γH2AX distintos en G0/G1 fase y en G2 la fase indicada transitoria o constitutiva daños en el ADN que se han adquirido durante los pasajes repetitivos de ciclo celular; por el contrario, los puntos dispersos en la fase de S ocurrieron sólo transitoriamente y fueron probablemente asociados con el proceso de replicación. Como el γH2AX pan-nuclear speckles pueden perturbar el análisis de los focos de γH2AX genuino, la exclusión de células en fase S de análisis se recomienda, que se realiza fácilmente por el patrón de γH2AX específico de fase S. Por otra parte, las células en la fase S pueden ser excluidas por la medida de la intensidad de la señal DAPI o por el uso de marcadores específicos de fase S (por ejemplo, A ciclina). Por otra parte, la inducción de la detención del crecimiento con la sincronización de las células en fase G0/G1 puede ser útil antes de preparar el cytospins almacenando las muestras a temperatura ambiente (es decir, 18-20 ° C) durante la noche.
Los procedimientos de fijación y permeabilización son pasos críticos en immunostaining de γH2AX y 53BP1. La fijación es necesaria para preservar la morfología y la antigenicidad de las células23. Permeabilización permite el acceso a los antígenos intracelulares y nuclear24. PFA es un agente relativamente suave para fijación y estabiliza las células conservando estructuras de proteínas por reacción con los aminoácidos básicos que forma metileno reticulaciones. Después de la fijación con PFA, cytospins pueden conservarse durante días y semanas hasta que la transformación posterior. Para la detección de γH2AX y 53BP1, las células tienen que ser permeabilized. Octoxinol 9 se utilizó como un detergente no iónico que contiene grupos cabeza hidrofílicos consisten en moléculas de polioxietileno. Octoxinol 9 rompe los núcleos celulares suavemente y preserva γH2AX focos muy claramente. Alternativamente, metanol puede usarse para la fijación y permeabilización de las células, también. Metanol que precipita las proteínas y disuelve los lípidos de la membrana celular, lo que los hace permeables a los anticuerpos. Sin embargo, el tratamiento con metanol es presumiblemente más agresivo y γH2AX focos pueden no aparecer como claramente en comparación con los focos de γH2AX obtenidos por tratamiento con 4% PFA y 0.1% Octoxinol 9. No obstante, anticuerpos eficientes juegan un papel clave para la inmunotinción de γH2AX y 53BP1. Por lo tanto, se recomienda el uso de anticuerpos probados (véase Tabla de materiales y equipos). Una dilución seriada de anticuerpos puede ser útil para la determinación de las concentraciones de anticuerpos óptimo.
Focos de γH2AX se utilizan como marcador en biodosimetry de la radiación a dosis bajas > 1 mGy25. ΓH2AX focos fueron analizados en los linfocitos en 5 min después de la irradiación de rayos x con una dosis de 100 mGy en vitro (figura 6). Como H2AX se fosforila rápidamente en sitios de OSD después de la irradiación, el número de focos de γH2AX ya puede alcanzar un máximo a los 5 min después de la irradiación20,22. Sin embargo, el proceso de reparación comienza inmediatamente después de la irradiación y se eliminan focos de γH2AX a una tasa de decaimiento distintos. Por lo tanto, para el control del número de focos de γH2AX en una secuencia cronológica, es aconsejable interrumpir el proceso de reparación, poniendo la muestra en hielo en el punto especificado en el tiempo después de la irradiación.
Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de inestabilidad genética en células de cáncer. Las células de CD34 + se enriquecieron de la médula ósea de un paciente con leucemia mieloide aguda con microesferas de CD34. Se obtuvieron imágenes de focos γH2AX y 53BP1 focos con filtros de fluorescencia específica. Una iluminación brillante de la cytospin es importante inducir fluorescencia adecuada de los focos γH2AX y 53BP1. Después de grabar la imagen, adaptación de la intensidad de los focos y la señal de fondo es necesaria utilizando el software de imágenes. Para el análisis de colocalización de focos γH2AX y 53BP1, se fusionan las imágenes (figura 7). Un microscopio de epifluorescencia básico equipado con filtros DAPI, Alexa 488 y Cy3 en combinación con un sistema de cámara y software de imágenes es suficiente para el análisis de γH2AX y 53BP1 focos en DAPI mancharon núcleos celulares. Sin embargo, ciertas aplicaciones (por ejemplo, análisis de daños en el ADN a lo largo de pistas sola partícula) pueden requerir mayor resolución y reducción de la fluorescencia de fondo (como por ejemplo, microscopía de láser confocal). Además, la tecnología del microscopio es un campo de rápido desarrollo y una resolución por debajo de 200 nm es factible con microscopios de vanguardia.
En Resumen, este manuscrito destaca temas críticos de formación de OSD y la reparación y proporciona un protocolo paso a paso para un análisis detallado del OSD por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1. La investigación en OSD claramente se beneficiará de acontecimientos recientes y futuros en la tecnología del microscopio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por la Fundación alemana José Carreras de leucemia (14 DJCLS R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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