Summary
이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 심각한 DNA 병 변. 형성 및 DSB의 수리 분석은 게놈 무결성, genotoxicity, 방사선 생물학, 노화, 암, 및 신약 개발 등 연구 분야의 넓은 스펙트럼에 관련. 응답에서 DSB, 히스톤 H2AX 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 개별 핵 foci 감지를 형성 하는 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에 phosphorylated은. 또한, 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1)은 또 다른 중요 한 DSB 반응 단백질 nonhomologous 끝 동종 재결합 하면서 가입 하 여 DSB의 복구를 추진. ΓH2AX와 53BP1의 특정 기능에 따라 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 결합 된 분석 DSB의 상세한 분석에 대 한 합리적인 접근 있을 수 있습니다. 이 원고는 단계별 프로토콜을 기술을 수행 하기 위한 조직적 노트와 보충을 제공 한다. 특히, γH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 셀 라인 NHDF의 정상적인 fibroblasts에 시연입니다. 또한, biomarker는으로 γH2AX foci의 값은 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포에 그려져 있습니다. 마지막으로, 유전자 불안정성의 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 조사.
Introduction
DNA는 지속적으로 내 생에 의해 손상 (예를 들어, 복제 스트레스, 반응성 산소 종, DNA의 본질적인 불안정성) 및 외 인 (예, 화학 기, 방사선) 소스 (그림 1)1,2 ,,34. DNA 손상, 중 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 특히 심각한 병 변 그리고 세포 죽음 또는 발암을 일으킬 수 있습니다. 약 50 DSB는 세포와 세포 주기5당 발생할 수 있습니다. 포유류 세포, 동종 재결합 (HR) 및 nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 개발 DSB (그림 2)의 복구에 대 한 주요 경로. 인사 늦게 S/g 2 단계에서 발생 하 고 그대로 동생을 사용 하 여 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 템플릿으로 chromatid. 비교에서는, NHEJ 기본적인 쌍을 추가 또는 깨진된 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다 및 잠재적으로 돌연변이 세포 주기입니다. 또한, 대체 최종 합류 NHEJ 결핍6,7시 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘으로 약혼 수 있습니다.
DSB 각 DSB 주위 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에서 히스톤 H2AX의 인 산화를 유도. 형성 핵 foci γH2AX foci 이름이 되며 면역 형광 검사 현미경 검사 법8감지. ΓH2AX 추가 DSB 반응 단백질의 신규 모집을 촉진 하 고 개장 하는 chromatin, DNA 수리, 및 신호 변환9에 관여. 각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 정량화는 가능,이 암 세포 선 및 환자 표본10,11, 에서 입증 되었습니다. 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1) DSB 수리 중재에 또 다른 주요 단백질 이다. 그것은 DSB 반응 단백질, 검사점 신호, 그리고 DSB 끝15synapsis의 채용에 관여. 또한, 53BP1 DSB 복구 경로 선택에서 중요 한 역할을 하고있다. 그것은 시간 동안 방해16NHEJ 향해 DSB의 수리를 트리거합니다. ΓH2AX 및 DSB 수리에 53BP1의 진정한 기능을 고려 하면 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해의 동시 분석 형성 및 DSB의 복구의 정확한 분석을 위한 유용한 방법 있을 수 있습니다.
이 원고는 세포 핵에 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 수행 하기 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 특히, 기술은 셀 라인 NHDF, 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포와 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서의 정상적인 fibroblasts에 적용 됩니다. 방법의 세부 정보는 제시 결과의 맥락에서 지적 했다.
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Protocol
여기에서 설명한 모든 방법을 의료 학부 임 하이델베르크 대학 윤리 위원회 II에 의해 승인 되었습니다. 모든 개인에서 동의 얻어 작성.
1. 재료의 준비
- 응고 제 재고 솔루션: 0.9% 염화 나트륨에에서 mL 당 200 I.U. 덤플링의 항 응 혈 약 재고 솔루션을 준비. 컬렉션 튜브의 각 채우기 (볼륨 그릴 9 mL) 혈액 또는 골 수 샘플의 철수 하기 전에 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와.
- 적혈구 세포 솔루션: 레드 셀 염화 암모늄 82.91 g, 7.91 g 염화 중 탄산염, 그리고 pH 8.0에서 에이전트를 용 해 하 여 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 성 해결책의 2 mL에 lysis 솔루션 x 10 준비 1의 전체 볼륨에 대 한 이중 증 류 물 L.
- 고정 솔루션: 추가 8.3 µ L 360 mg paraformaldehyde (PFA) 결정 튜브에서에 1 M 수산화 칼륨 해결책의. 튜브 및 열 36 %PFA 솔루션의 1 mL를 95 ° C에가 열 블록에 튜브의 1 mL 마크를 버퍼링 하는 인산 염 분 (PBS)로 튜브를 채우십시오. 15 mL의 용량을 가진 튜브를 1 mL 36 %PFA 솔루션을 전송 합니다. 8 mL PBS 1 mL 36 %PFA 솔루션 4 %PFA 재고 솔루션의 9 mL를 추가 합니다. 셀의 고정을 위한 4 %PFA 재고 솔루션 및 저장소까지-18 ° C에서 사용 하는 약 수.
주의: 1) 수산화 칼륨 해결책은 부식성 이다. 눈과 피부 보호를 알고 있어야 합니다. 2) PFA 발암 성 이다입니다. 피부 접촉 및 흡입 하지 마십시오. 준비는 후드 아래 고정 솔루션. - Permeabilization 솔루션: 추가 50 µ L Octoxinol 9 ~ 50 mL PBS 약 0.1%의 솔루션을 Octoxinol 9.
- 차단 솔루션: 5%와 2 %6에서 PBS와 저장소 단백질 블로킹 제를 혼합 하 여 차단 하는 솔루션 준비 – 8 ° c.
2. 샘플의 준비
- 섬유 아 세포 세포 배양에서: 셀 라인 NHDF 습도 5%에서의 인간의 섬유 아 세포를 배양 10% 태아 종 아리 혈 청, 4mm 보충 RPMI 1640 매체에서 37 ° C에서 CO 2 분위기 글루타민, 그리고 1% 페니실린/스입니다.
- 준비는 현미경 슬라이드의 점착 섬유 아 세포
- 플라스 크 (75 cm 2 성장 지역) 기 하 급수적으로 성장 하는 NHDF 섬유 아 세포에서에서 매체를 제거 합니다. 플라스 크에 10 mL PBS를 추가 합니다. 수동으로 1 분에 대 한 플라스 크를 흔들어 부착 섬유 아 세포를 부드럽게 씻어
- 는 PBS를 제거 하 고 플라스 크에 트립 신 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 부착 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 있도록 플라스 크를 흔들어. 플라스 크에서는 트립 신을 제거 합니다. 37 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 넣어 ° c.
- 는 인큐베이터에서 플라스 크 고 플라스 크에 10 mL RPMI 1640 매체를 추가. 매체는 섬유 아 세포를 분산 여러 번 위아래 플라스틱.
- 각 현미경 슬라이드의 두 필드에 분산 된 섬유 아 세포의 0.3 mL를 플라스틱 하 고 슬라이드 하는 섬유 아 세포 준수 24 h에 대 한 인큐베이터에 슬라이드를 넣어. ΓH2AX 및 섬유 아 세포의 핵에서 53BP1의 immunostaining에 대 한 이동 단계 3.1.
- 준비는 현미경 슬라이드의 점착 섬유 아 세포
- 환자 샘플
- 혈액 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 혈액을 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 분리 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 단 세포 휴식 G0/G1 단계.
- 골 수 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션 (단계 1.1)의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 골 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 단 세포 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 휴식 G0/G1 단계 분리. CD34 microbeads를 사용 하 고 셀 CD34 + 세포의 고립에 대 한 분리 열.
- 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 단 세포의 고립
참고: 단 세포 밀도 그라데이션 원심 17 , , 18 19에 의해 혈액과 골 수 샘플에서 격리 됩니다. - Dilute PBS와 1: 1의 비율로 heparinized 혈액 샘플 및 PBS와 1: 3의 비율로 heparinized 골 수 샘플
- . 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 중단.
- 신선한 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 희석된 혈액 또는 골 수 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어. 두 레이어 혼합에 아닙니다 돌.
- 원심 관 실 온에서 30 분 동안 하 고 400 x g. 피펫으로와 위 플라즈마 레이어를 그립니다. 다음 신중 하 게 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어 단 셀 수확. 단 세포 신선한 튜브로 전송.
- 튜브에 단 세포를 PBS의 적어도 3 개의 볼륨을 추가합니다. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 부드럽게 세포를 일시 중단 합니다. 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
- 스핀 후는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C, 적혈구 세포 솔루션 x 1의 10 mL을 추가. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 resuspend 고 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다음 4 ° C에서 30 mL PBS를 추가 하 고 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
- 준비는 cytospins의
- (즉, γH2AX 면역 형광 염색 법에 대 한 하나의 cytospin 및 γH2AX 및 53BP1에 대 한 하나의 cytospin 환자 샘플의 단 세포와 두 cytospins 준비 면역 형광 염색 결합) 원심 분리 (300 x g, 10 분) ( 그림 3 및 4) 각 준비에 대 한 10 5 셀 x 1.0의 의해.
3. γH2AX 및 53BP1 면역 형광 염색
- 고정 및 permeabilization: 4%의 200 µ L 셀 해결 PFA 10 분. 고정, 후 30 mL PBS의 각 실험실 통에 5 분을 세 번 셀을 부드럽게 씻어. 다음 세포를 permeabilize 0.1%의 200 µ L을 10 분에 대 한 Octoxinol 9 씻어 셀 부드럽게 각 실험실 통에 5 분 30 mL 5% 차단 솔루션의와 세 번. 1 헤에 대 한 솔루션을 차단 하는 신선한 5%의 30 mL에서 세포를 차단
- 항 체를 가진 외피
- 품 어 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 한 준비와 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 다른 준비를 하 고 4에서 하룻밤 polyclonal 토끼 안티-53BP1 항 체 (1: 500) ° c.
- 인큐베이션 세척 세포 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 2% 차단 솔루션의 30 mL로 3 시간 후.
- 차단 솔루션을 제거 하 고 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 2 차 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 첫 번째 준비와 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 이차 항 체 (셀의 두 번째 준비 품 어 1: 500)와 Alexa555 활용 된 당나귀 안티 토끼 2 차 항 체 (1: 500) 실 온에서 1 h.
- 장착 매체: 셀으로 슬라이드를 그릇에 넣고 셀 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 30 mL의 PBS로 3 회 세척. PBS를 제거 하 고 장착 매체 4, 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 셀을 탑재. 조심 스럽게 넣어 장착 매체 위에 coverslip 없음 기포는 포함 된. 형광 현미경으로 세포를 분석 하기 전에 장착 매체의 강화에 대 한 적어도 3 h 기다립니다.
4. ΓH2AX 및 53BP1의 분석 Foci
- 형광 현미경 검사 법: 100 X 목표에 이미징 동안 DAPI, 알 렉 사 488, Cy3 필터를 갖춘 형광 현미경으로 세포 핵에서 γH2AX 및 53BP1 foci 분석 확대입니다. 카메라와 함께 이미지를 기록 하 고 적절 한 이미징 소프트웨어로 이미지 처리.
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Representative Results
셀에 γH2AX foci의 분석 G0/G1 단계 그리고 G2 단계 γH2AX foci (그림 5A) 고유한 형광 점으로 표시 하는 때에 가장 정확 하다. 반면, S 단계 세포에 γH2AX foci의 분석 복제 프로세스 (그림 5B)에 의해 발생 하는 분산된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 의해 복잡 합니다.
셀의 고정 4% 수행한 PFA (10 분) 및 0.1% permeabilization Octoxinol 9 (10 분). 메탄올은 고정 및 permeabilization, 사용할 수 있습니다 그러나, 메탄올 수 있습니다 세포 핵을 꽤 심각 휴식과 γH2AX 포커스 4 %PFA 0.1% 처리 하 여 얻은 γH2AX foci에 비해 뚜렷한 나타나지 않을 수 있습니다 그래서 γH2AX foci 밖으로 얼룩 Octoxinol 9.
효율적인 항 체의 선택이 효과적인 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 대 한 중요 합니다. 기본 마우스 단일 클로 널 항 γH2AX 항 체와 면역 형광 γH2AX 및 53BP1의 얼룩에 대 한 기본 토끼 polyclonal 안티-53BP1 항 체 실험 수행 했다 각각.
각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, γH2AX의 면역 형광 염색 조사 조직에서 DSB의 정량화에 대 한 사용할 수 있습니다. 비친된 세포 (그림 6)에서 γH2AX foci의 레벨은 방사선 복용량20,21에 비례. ΓH2AX foci 최대 방사선20,22의 이미 5 분을 얻을 수 있습니다. 나중 시점 시간에 γH2AX foci의 부패 감시 될 수 있다 고 DSB20,,2122의 수리를 반영 한다.
결합 된 면역 형광 γH2AX 및 53BP1 세포에 종양 견본10,11,12,,1314의 얼룩에 의해 유전자 불안정을 분석할 수 있습니다. 모범적인 분석 CD34 + 세포 (그림 7) 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서에서 수행 되었다. ΓH2AX 및 53BP1의 공동 지역화 못했습니다 HR 동안 DSB의 사이트에서 NHEJ 복구 메커니즘 53BP1 중재의 승진을 표시. 그러나, 공동 로컬라이제이션 γH2AX와 급성 골수성 백혈병의 폭발에서 53BP1 foci의 비율 변수를 했다. 추가 53BP1 신호 없이 γH2AX foci 늦은 S/g 2 단계에서 DSB의 복구에 대 한 HR 종사 수도 있습니다. 단 수 53BP1 foci의 역할은 애매 남아 있었다.
그림 1: 소스와 결과 내 인 성 및 외 인 DNA의 손상1,2,,34. DSB, DNA 이중 가닥 나누기; NHEJ, nonhomologous 최종 합류.
그림 2 : 주요 DNA 두 배 물가 틈 (DSB)의 회로도 보기 복구 메커니즘 포유류 세포에서. 동종 재결합 사용 그대로 자매 chromatid DSB의 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 S/g 2 단계 후반에. Nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 이며 세포 주기 동안 활성 잠재적 오류가 몇 가지 기본적인 쌍을 추가 또는 DSB 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다. 대체 끝 합류 NHEJ 결핍의 경우 약혼 수 있습니다 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : cytospins를 준비 하기 위한 장치입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : cytospins 준비 합니다. 각 샘플의 두 cytospins 10 분에 대 한 300 x g에서 105 셀 x 1.0의 원심 분리에 의해 준비 된다. 한 cytospin γH2AX 면역 형광 염색을 위해 사용 되 고 다른 cytospin 결합 된 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 염색 법에 대 한 활용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : ΓH2AX foci 셀 라인 NHDF의 정상 섬유 아 세포에서의 세포 주기 의존 패턴. NHDF 섬유 아 세포의 핵 (블루, DAPI)에서 (A) γH2AX foci (녹색, 알 렉 사 488) G0/G1 또는 G2 단계에 독특한 점으로 나타납니다. (B) γH2AX foci S 단계에서 섬유 아 세포의 핵에서 분산된 팬 핵 얼룩으로 표시 (눈금 막대 = 5 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 :: ΓH2AX foci x-ray에서 건강 한 개인의 림프 톨 조사. ΓH2AX foci (녹색, 알 렉 사 488) 세포의 핵 (블루, DAPI)에서 이미지는 100 mGy와 방사선 조사 후 5 분에 기록 됩니다 (눈금 막대 = 5 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 공동 국산화 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 γH2AX와 53BP1 포커스 ΓH2AX foci (녹색, 알 렉 사 488) 및 53BP1 foci (레드, Cy3) 공동 현지화 나타냅니다 53BP1이 중재 nonhomologous 최종 합류 복구 메커니즘 DNA 두 배 물가 틈의 사이트에서의 홍보 (눈금 막대 = 5 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
면역 형광 검사 현미경 검사 법의 γH2AX와 53BP1 형성 및 연구 분야의 넓은 스펙트럼에서 DSB의 수리 분석을 위한 유용한 방법입니다. 실험의 결과 좌우 하는 중요 한 매개 변수는 세포 주기, 고정 및 permeabilization 세포, 항 체, 그리고 하드웨어의 선택과 형광 현미경의 소프트웨어 사용 하는 에이전트의 단계.
ΓH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 정상 섬유 아 세포 세포 라인 NHDF의 기 하 급수적으로 성장 하 여 시연 했다. ΓH2AX foci G0/G1에 고유한 형광 점으로 등장 및 S 단계 (그림 5)에서 분산 된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 비해 g 2 단계. G0/G1에 뚜렷한 γH2AX foci 단계 그리고 G2 단계 표시 과도 그리고/또한 제정 DNA 손상 반복적인 세포 주기 통로; 중 획득 수 있습니다. 반대로, S 단계에서 분산된 얼룩만 정도 발생 하 고 아마도 복제 프로세스와 연결 했다. 얼룩을 방해 수 있습니다 팬 핵 γH2AX로 정품 γH2AX foci, 분석에서 S 단계 세포의 배제의 분석은 권장 S 단계 특정 γH2AX 패턴에 의해 쉽게 이루어집니다. 또는, S 단계에서 세포 DAPI 신호 강도의 측정 또는 S 단계 특정 마커 (예를 들어, Cyclin A)의 응용 프로그램에서 제외할 수 있습니다. 또한, G0/G1 단계에서 셀의 동기화와 성장 검거의 유도 cytospins 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 하 여 준비 하기 전에 유용할 수 있습니다.
고정 및 permeabilization의 절차는 γH2AX와 53BP1의 immunostaining의 중요 한 단계. 고정은 형태학과 셀23antigenicity을 유지 하기 위해 필요 합니다. Permeabilization는 세포내 핵 항24에 액세스할 수 있습니다. PFA 고정을 위한 상대적으로 부드러운 에이전트 이며 기본적인 아미노산 형태로 methylene crosslinks에 반응 하 여 단백질 구조를 유지 하면서 세포를 안정화. PFA와 고정 후 cytospins와 주 추가 처리까지 며칠 동안 저장할 수 있습니다. ΓH2AX와 53BP1의 검출, 셀 permeabilized 수 있다. Octoxinol 9 polyoxyethylene moieties로 구성 된 저격총된 친수성 머리 그룹을 포함 하는 비 이온 세제로 사용 되었다. Octoxinol 9 셀 핵을 부드럽게 고 아주 명백 하 게 γH2AX 포커스를 유지. 또는 메탄올 사용할 수 있습니다 고정 및 세포의 permeabilization 너무. 메탄올은 단백질을 침전 하 고 그들을 투과성 항 체를 만드는 세포 막에서 지질을 녹이 고. 그러나, 메탄올 치료 아마도 더 공격적 이며 γH2AX foci 나타나지 않을 수 있습니다으로 분명히 4 %PFA 0.1% 처리 하 여 얻은 γH2AX foci에 비교 될 때 Octoxinol 9. 도 불구 하 고, 효율적인 항 체 γH2AX 및 53BP1의 immunostaining에 대 한 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서, 입증 된 항 체의 사용은 권장 ( 테이블의 재료/장비참조). 항 체의 직렬 희석 최적의 항 체 농도의 결정에 대 한 유용할 수 있습니다.
ΓH2AX foci 낮은 복용량에 방사선 biodosimetry에서 마커로 사용 됩니다 > 1 mGy25. ΓH2AX foci 100 mGy에 생체 외에서 (그림 6)의 복용량으로 x 선 방사선 조사 후 세포 5 분에 분석 되었다. H2AX는 방사선 조사 후 DSB의 사이트에서 빠르게 phosphorylated는로 γH2AX foci 수 이미 조사20,22후 5 분에서 최대를 도달 수 있습니다. 그러나, 복구 과정에서 방사선 조사 후 즉시 시작 하 고 γH2AX foci 뚜렷한 감퇴 속도에서 제거 됩니다. 따라서, γH2AX foci 연대기 순서로 수 모니터링, 그것은 방사선 조사 후 시간에 지정된 된 지점에 얼음에 샘플을 넣어 복구 프로세스를 중단 하는 것이 좋습니다.
면역 형광 검사 현미경 검사 법 γH2AX와 53BP1의 암 세포에서 유전자 불안정성을 분석 하기 위한 유용한 방법입니다. CD34 + 세포는 환자의 골 수에서 CD34 microbeads를 사용 하 여 급성 골수성 백혈병으로 농축 했다. ΓH2AX foci의 53BP1 foci 이미지 특정 형광 필터를 사용 하 여 얻은 했다. cytospin의 밝은 조명은 γH2AX 및 53BP1 foci의 적절 한 형광을 유도 해야 합니다. 이미지를 기록한 후 적응은 포커스의 배경 신호 강도 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 필요 합니다. ΓH2AX 및 53BP1 foci의 공동 지역화 분석에 대 한 이미지를 병합 됩니다 (그림 7). 기본 epifluorescence 현미경 카메라 시스템와 함께에서 DAPI, 알 렉 사 488, Cy3 필터를 장착 하 고 이미징 소프트웨어 γH2AX의 분석에 대 한 충분 한 이며 DAPI에서 53BP1 foci 스테인드 세포 핵. 그러나, 특정 응용 프로그램 (예:단일 입자 트랙을 따라 DNA 손상의 분석) 해야 높은 해상도 배경 형광의 감소 (예를 들어, 의해 제공 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법)으로 합니다. 또한, 현미경 기술은 이다 급속 하 게 발전 분야 200 해상도 nm는 가능-의 상태--예술 현미경.
요약 하자면,이 원고 DSB 형성 및 수리의 중요 한 문제를 강조 표시 하 고 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 상세한 분석을 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. DSB에서 연구 현미경 기술에 있는 최근과 미래의 발전에서 명확 하 게 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
프로젝트는 독일 호세 카레라스 백혈병 재단 (DJCLS 14 R/2017)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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