Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks
Summary
Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.
Abstract
DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind schwere DNA-Läsionen. Analyse der Bildung und Reparatur des DSB ist in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Genom Integrität, Genotoxizität, Strahlenbiologie, Altern, Krebs und Arzneimittelentwicklung. In Erwiderung auf DSB ist die Histon H2AX Serin 139 in einer Region mit mehreren Megabase Paare bilden diskrete nuklearen Herde nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie phosphoryliert. Darüber hinaus 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist ein weiteres wichtiges DSB-responsive Protein Förderung der Reparatur des DSB bei nonhomologous Ende-homologe Rekombination zu verhindern. Entsprechend den spezifischen Funktionen der γH2AX und 53BP1 möglicherweise die kombinierte Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ein vernünftiger Ansatz für eine detaillierte Analyse des DSB. Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll ergänzt durch methodische Hinweise für die Durchführung der Technik. Insbesondere zeigt sich der Einfluss des Zellzyklus auf γH2AX Brennpunkte Muster in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. Darüber hinaus ist der Wert der γH2AX Brennpunkte als Biomarker in Röntgenstrahlung bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen dargestellt. Zu guter Letzt wird die genetischer Instabilität in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 untersucht.
Introduction
DNA wird kontinuierlich durch endogene beschädigt (z.B., Replikation Stress, reaktive Sauerstoffspezies, innere Instabilität von DNA) und exogene(z. B.chemische radikale, Bestrahlung) Quellen (Abbildung 1)1,2 ,3,4. Unter DNA-Schäden DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind besonders schwere Läsionen und Zelltod oder Karzinogenese induzieren können. Etwa 50 DSB ergeben sich pro Zelle und Zellzyklus5. In Säugetierzellen entwickelte homologe Rekombination (HR) und nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) als wichtigen Wege für die Reparatur des DSB (Abbildung 2). HR in späten S/G2-Phase tritt und nutzt eine intakte Schwester Chromatids als Vorlage für potenziell fehlerfreie Reparatur. Im Vergleich dazu ist NHEJ während des Zellzyklus aktiv und potenziell mutagene wie Basenpaare hinzugefügt oder vor der Ligatur der gebrochenen enden reseziert werden. Darüber hinaus kann Alternativen Ende-Verbindung als eine langsame mutagene Back-up Repair-Mechanismus bei NHEJ Mangel6,7betraut sein.
DSB induzieren die Phosphorylierung des Histon H2AX Serin 139 in einer Region von mehreren Megabase Paaren um jede DSB. Bildenden nuklearen Brennpunkte werden benannt γH2AX Brennpunkte und nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie-8. ΓH2AX fördert die Einstellung von weiteren DSB-responsive Proteine und Chromatin umgestalten, DNA-Reparatur und Signal Transduction9beteiligt ist. Da jeder γH2AX Schwerpunkt gilt, einen einzigen DSB zu vertreten, ist die Quantifizierung der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie möglich, die nachweislich in Krebszelllinien und Patientenproben10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist eine weitere wichtige Protein bei der Vermittlung von DSB-Reparatur. Es ist bei der Rekrutierung von DSB-responsive Proteine, Checkpoint Signalisierung und der Synapsis DSB endet15beteiligt. Darüber hinaus spielt die 53BP1 eine entscheidende Rolle bei der DSB Reparatur Weg Wahl. Es löst die Reparatur des DSB in Richtung NHEJ, während HR verhindert16ist. In Betracht der echte Funktionen γH2AX und 53BP1 in der DSB-Reparatur möglicherweise die simultane Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie eine nützliche Methode für die genaue Analyse der Bildung und Reparatur des DSB.
Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 in Zellkernen durchführen. Insbesondere ist die Technik in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF, in x-ray bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen und CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie angewendet. Die Einzelheiten des Verfahrens sind im Zusammenhang mit den vorgestellten Ergebnissen hingewiesen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der Bildung und Reparatur des DSB in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten. Wichtige Parameter, die Einfluss auf das Ergebnis der Experimente sind die Phase des Zellzyklus, die Agenten für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, die die Antikörper und die Hardware und Software von dem Fluoreszenzmikroskop verwendet.
Die Beeinflussung des Zellzyklus γH2AX Brennpunkte Muster zeigte s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde von der deutschen José Carreras Leukämie Stiftung (DJCLS 14 R/2017) unterstützt.
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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