Immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 for å analysere dannelse og reparasjon av DNA dobbel-strand bryter
Summary
Dette manuskriptet gir en protokoll for analyse av DNA dobbel-strand bryter ved immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1.
Abstract
DNA dobbel-strand bryter (DSB) er alvorlig DNA lesjoner. Analyse av dannelse og reparasjon av DSB er relevant i et bredt spekter av forskningsfelt inkludert genomet integritet, gentoksisitet, stråling biologi, aldring, kreft og narkotika utvikling. Svar på DSB, er histone H2AX fosforylert på Serine 139 i en region av flere megabase par danner diskret kjernefysiske foci detectable av immunofluorescence mikroskopi. I tillegg er 53BP1 (p53 binding protein 1) er en annen viktig DSB svarer protein fremme reparasjon av DSB melder nonhomologous slutten-mens forebygge homologe rekombinasjon. Ifølge de bestemte funksjonene γH2AX og 53BP1, kan kombinerte analyse av γH2AX og 53BP1 av immunofluorescence mikroskopi være en fornuftig tilnærming for en detaljert analyse av DSB. Dette manuskriptet gir en trinnvis protokoll med metodisk notater for å utføre teknikken. Spesielt er påvirker celle syklusen γH2AX foci mønstre demonstrert i normal fibroblaster av cellen linjen NHDF. Videre er verdien av γH2AX fokuspunktene som en biomarkør avbildet i x-ray bestrålt lymfocytter av en frisk person. Til slutt, genetisk ustabilitet er undersøkt i CD34 + celler i en pasient med akutt myelogen leukemi av immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1.
Introduction
DNA er kontinuerlig skadet av endogene (f.eks, replikering stress, reaktive oksygen arter, iboende ustabilitet av DNA) og ytre (f.eks, kjemiske radikaler, bestråling) kilder (figur 1)1,2 ,3,4. Blant DNA skade, DNA dobbel-strand bryter (DSB) er spesielt alvorlige lesjoner og kan indusere celledød eller kreft. 50 DSB kan oppstå per celle og celle syklus5. I pattedyrceller, homologe rekombinasjon (HR) og nonhomologous slutten med (NHEJ) utviklet som store trasé for reparasjon av DSB (figur 2). HR forekommer i slutten S/G2 fase og bruker en intakt søster chromatid som en mal for potensielt feilfrie reparasjon. Til sammenligning er NHEJ aktiv hele cellen syklus og potensielt mutagene som base parene kan legges til eller kappet før ligation av ødelagt. I tillegg kan alternativ slutten-begynte være engasjert som en langsom mutagene sikkerhetskopiere reparasjon mekanisme ved NHEJ mangel6,7.
DSB induserer fosforylering av histone H2AX på Serine 139 i en region av flere megabase rundt hver DSB. Forming kjernefysiske fokuspunktene kalles γH2AX foci og er detectable av immunofluorescence mikroskopi8. ΓH2AX fremmer rekruttering av ytterligere DSB svarer proteiner og er involvert i chromatin remodeling, DNA-reparasjon og signal signaltransduksjon9. Som hver γH2AX fokus anses å representere en enkelt DSB, er kvantifisering av DSB av immunofluorescence mikroskopi mulig, som har vist i kreftcelle linjer og pasienten prøver10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) er en annen viktig protein på formidling DSB reparasjon. Det er involvert i rekrutteringen av DSB svarer proteiner, checkpoint signalering og Adept DSB slutter15. I tillegg spiller 53BP1 en avgjørende rolle i DSB repair pathway valg. Det trigger reparasjon av DSB mot NHEJ HR er forhindret16. Vurderer ekte funksjonene γH2AX og 53BP1 i DSB reparasjon, kan samtidig analyse av γH2AX og 53BP1 av immunofluorescence mikroskopi være en nyttig metode for nøyaktig analyse av dannelse og reparasjon av DSB.
Dette manuskriptet gir en trinnvis protokoll for å utføre immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 i celle kjerner. Spesielt brukes teknikken i vanlig fibroblaster av cellen linjen NHDF, røntgen bestrålt lymfocytter av en frisk person og CD34 + celler i en pasient med akutt myelogen leukemi. Detaljer om metoden er påpekt i forbindelse med presenterte resultatene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 er en nyttig metode for å analysere dannelse og reparasjon av DSB i et bredt spekter av forskningsfelt. Kritiske parametere som påvirker utfallet av eksperimentene er fasen av cellen syklus, agenter brukes til fiksering og permeabilization av celler, valg av antistoffer, og maskinvaren og programvaren til fluorescens mikroskopet.
Påvirkning av cellen syklus på γH2AX foci mønstre ble demonstrert av eksponensielt voksende normal fibroblaster av…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet ble støttet av tysk José Carreras leukemi stiftelsen (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
