Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 för att analysera bildning och reparation av DNA dubbel-strand Breaks
Summary
Detta manuskript ger ett protokoll för analys av DNA dubbel-strand raster genom immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1.
Abstract
DNA dubbel-strand raster (DSB) är allvarliga DNA skador. Analys av bildandet och reparation av DSB är relevant i ett brett spektrum av forskningsområden inklusive genomet integritet, genotoxicitet, strålningsbiologi, åldrande, cancer och läkemedelsutveckling. Svar på DSB, är Histon H2AX fosforyleras på Serine 139 i en region i flera megabase par bildar diskret nukleära foci kan upptäckas med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Dessutom 53BP1 (p53 bindande protein 1) är en annan viktig DSB-lyhörd protein att främja reparation av DSB genom nonhomologous slut-att gå samtidigt förhindra homolog rekombination. Enligt den specifika funktion γH2AX och 53BP1, kan den kombinerade analysen av γH2AX och 53BP1 genom immunofluorescens mikroskopi vara en rimlig strategi för en detaljerad analys av DSB. Detta manuskript ger en steg för steg-protokollet kompletteras med metodisk noter för att utföra tekniken. Specifikt, demonstreras påverkan av cellcykeln på γH2AX foci mönster i normala fibroblaster av raden cell NHDF. Vidare, värdet av de γH2AX foci som en biomarkör är avbildad i röntgen bestrålade lymfocyter av en frisk individ. Slutligen undersöks genetisk instabilitet i CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi med hjälp av immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1.
Introduction
DNA skadas kontinuerligt av endogena (t.ex., replikering stress, reaktiva syreradikaler, inneboende instabilitet av DNA) och exogena (t.ex., kemisk radikaler, bestrålning) källor (figur 1)1,2 ,3,4. Bland DNA-skador, DNA dubbel-strand raster (DSB) är särskilt allvarliga lesioner och kan inducera celldöd eller karcinogenicitet. Ca 50 DSB uppstå per cell och cell cykel5. I däggdjursceller utvecklade homolog rekombination (HR) och nonhomologous slutet-sammanfogning (NHEJ) som större vägar för reparation av DSB (figur 2). HR uppstår i sena S/G2-fasen och använder en intakt syster kromatida som en mall för potentiellt felfri reparation. I jämförelse är NHEJ aktiv under hela cellcykeln och potentiellt mutagena som baspar kan läggas till eller resected före ligering av brutna ändarna. Dessutom kan alternativa slut-att gå vara engagerade som en långsam mutagena säkerhetskopiera reparation mekanism vid NHEJ brist6,7.
DSB inducera fosforyleringen av Histon H2AX på Serine 139 i en region i flera megabase par runt varje DSB. De bildar kärnkraft foci namnges γH2AX foci och kan påvisas med immunofluorescens mikroskopi8. ΓH2AX främjar rekrytering av ytterligare DSB-lyhörd proteiner och är involverad i kromatin remodeling, DNA-reparation och signaltransduktion9. Eftersom varje γH2AX fokus anses representera en enda DSB, är kvantifiering av DSB med hjälp av immunofluorescens mikroskopi möjligt, vilket har visats i cancer cellinjer och patientprover10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bindande protein 1) är en annan Nyckelprotein medla DSB reparation. Det är involverade i rekryteringen av DSB-lyhörd proteiner, checkpoint signalering och synapsis DSB avslutar15. Dessutom spelar 53BP1 en avgörande roll i DSB reparation väg valet. Reparation av DSB mot NHEJ utlöser medan HR är förhindrade16. Med tanke på den äkta funktionen γH2AX och 53BP1 i DSB reparation, kan samtidig analys av γH2AX och 53BP1 genom immunofluorescens mikroskopi vara en användbar metod för exakt analys av bildning och reparation av DSB.
Detta manuskript ger en steg för steg-protokoll för att utföra immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 i cellkärnan. Specifikt, tillämpas tekniken i normala fibroblaster av cellen fodrar NHDF, röntgen bestrålade lymfocyter av en frisk individ och CD34 + celler hos en patient med akut myeloisk leukemi. Information om metoden är påpekade i samband med de presenterade resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunofluorescens mikroskopi av γH2AX och 53BP1 är en användbar metod för att analysera bildandet och reparation av DSB i ett brett spektrum av forskningsområden. Kritiska parametrar som påverkar resultatet av experimenten är fasen i cellcykeln, de medel som används för fixering och permeabilisering av cellerna, valet av antikropparna, och den maskinvara och programvara av fluorescens Mikroskop.
Påverkan av cellcykeln på γH2AX foci mönster visades av exponentiellt växande normala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet stöddes av tyska José Carreras leukemi stiftelse (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
