Summary
この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA 二重鎖切断の分析のためのプロトコルを提供します。
Abstract
DNA 二重鎖切断 (DSB) は、深刻な DNA 損傷です。DSB の修復形成の分析、ゲノム、遺伝毒性試験、放射線生物学、老化、癌、および医薬品開発を含む研究分野の広範なスペクトルに関連しています。DSB に応答して、ヒストン H2AX は蛍光顕微鏡によるセリン 139 離散核病巣検出を形成するいくつかの megabase ペアの領域内でリン酸化されます。また、53BP1 (p53 結合タンパク質 1) は別重要な DSB 応答性タンパク質相同組換えを防止しながら非相同性末端結合による DSB の修復を促進します。ΓH2AX、53BP1 の特定の機能によると γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の複合解析 DSB の詳細な分析のための合理的なアプローチがあります。本稿では、技術を実行するための組織的なノートを添加したステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響は、通常細胞株培養線維芽細胞で示されます。さらに、健康な人の x 線照射によるリンパ球のマーカーとしての γH2AX の巣の値が描かれています。最後に、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による、急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞の遺伝的不安定性を調べた。
Introduction
DNA が継続的に内因性によって破損している (例えば、複製ストレス、活性酸素種、DNA の固有不安定性) と外因性 (例えば、化学ラジカル、照射) ソース (図 1)1,2 ,3,4。DNA 損傷の間で DNA 二重鎖切断 (DSB) は特に深刻な病変、細胞死やがんを引き起こす可能性があります。細胞と細胞周期5あたり約 50 DSB が生じることがあります。哺乳類細胞における相同組換え (HR) と非相同性末端結合 (NHEJ) は、DSB (図 2) の修理のための主要な経路として開発。HR 遅い S/G2 段階で発生し、そのまま妹を使用する可能性のあるエラー無料修理のためのテンプレートとして染色分け体。比較では、NHEJ は細胞周期の中でアクティブおよび潜在的変異原性塩基対を追加または壊れた端部の手術時に切除したことがあります。さらに、代替末端結合 NHEJ 欠乏6、7の場合遅い変異原性バックアップ修理メカニズムとして従事するかもしれない。
DSB は、各 DSB の周りいくつかの megabase ペアの領域でセリン 139 でヒストン H2AX のリン酸化を誘導します。形成の核の巣 γH2AX 巣の名前は、蛍光顕微鏡8で検出。ΓH2AX はさらに DSB 応答性タンパク質の採用を促進し、クロマチン DNA 修復、信号伝達9に関与しています。各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられている、蛍光顕微鏡による DSB の定量化が可能であれば、癌細胞および患者検体10、11,が示されています12,13,14. 53BP1 (p53 結合タンパク質 1) DSB 修復を媒介に別の主要蛋白質であります。DSB 応答性タンパク質、チェックポイントシグナ リング、DSB 端15のシナプスの募集に取り組んでいます。さらに、53BP1 は DSB 修復経路選択に重要な役割を果たしています。HR は防がれた16NHEJ に向かって DSB の修復がトリガーされます。ΓH2AX と DSB 修復 53BP1 の本物の機能を考慮した γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の同時分析形成と DSB の修復の正確な分析のための有用な方法があります。
この原稿は、細胞核の γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡を実行するためのステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞株培養、CD34 陽性急性骨髄性白血病の患者の細胞、健康な人の x 線照射によるリンパ球の正常線維芽細胞に応用されました。方法の詳細は、発表された結果のコンテキストで指摘されます。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、ハイデルベルク大学医療学部マンハイムの倫理委員会 II によって承認されています。インフォームド コンセントを得たすべての個人から書き込まれます
。1。 材料準備
- 抗凝固剤原液: 0.9% 塩化ナトリウムの mL あたり 200 i. u. ヘパリンの抗凝固薬の原液を準備。コレクション チューブのそれぞれを入力 (ボリュームを描く 9 mL) 血液または骨髄のサンプルの撤退前に抗凝固剤の原液 2 mL と 。
- 赤い細胞の換散ソリューション: 準備、10 x 82.91 g 塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム 7.91 g、8.0 でエージェントを溶解して pH を 0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 2 mL と赤血球の溶解液1 の容量の二重蒸留水・ l ・
- 固定の解決: マイクロタイター チューブで 360 mg パラホルムアルデヒド (PFA) に 1 M 水酸化カリウム溶液を追加 8.3 μ L。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) チューブと熱 36 %pfa 溶液の 1 mL を取得する 95 ° C で加熱ブロック管内の 1 mL マークで管を埋めます。容量は 15 mL チューブに 1 mL 36 %pfa ソリューションを転送します。8 mL の PBS を 4 %pfa ストック液 9 mL を得るために 1 mL 36 %pfa のソリューションに追加します。細胞の固定用 4 %pfa 原液と-18 ° c までストア因数
。 注意: 1) 水酸化カリウム水溶液腐食性です。目と皮膚の保護の注意してください。2) PFA は、発がん性があります。皮膚への接触や吸入を避けます。フードの下の固定の解決の準備します 。
- 透過ソリューション: およそ 0.1% のソリューションを取得する追加 50 μ L Octoxinol 50 に 9 mL PBS Octoxinol 9.
- ソリューションをブロック: 5% と 2 %6 で PBS とストアを持つ蛋白質のブロッキング剤を混合することによって解決を妨げる準備 – 8 ° C
2。サンプルの準備
- 細胞培養線維芽細胞: の加湿 5% の細胞株培養線維芽細胞を養う CO 2 雰囲気 4 mM 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 培地で 37 ° C でグルタミン、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
- 付着と顕微鏡のスライドの準備線維芽細胞
- は、フラスコ (75 cm 2 成長分野) 指数関数的に成長の培養線維芽細胞からメディアを削除します。フラスコに 10 mL の PBS を追加します。手動で 1 分のフラスコを振ることによって付着線維芽細胞を優しく洗って
- は、PBS を削除し、フラスコに 1 mL のトリプシンを追加します。すべての付着性細胞がトリプシンによって覆われているように優しくフラスコを振る。フラスコからトリプシンを削除します。37 で 5 分のためのインキュベーターにフラスコを入れ ° C
- は、インキュベーター外フラスコを取るし、フラスコに 10 mL RPMI 1640 媒体を追加します。ピペットの繊維芽細胞を分散させるために数回上下中です 。
- は、顕微鏡スライドの 2 つのフィールドのそれぞれに分散した線維芽細胞の 0.3 mL のピペットし、24 h のためのインキュベーター内にスライドを置き、繊維芽細胞がスライドに従います。ΓH2AX と線維芽細胞の核 53BP1 の是非、ステップ 3.1 に移動します 。
- 付着と顕微鏡のスライドの準備線維芽細胞
- 患者サンプル
- 血液サンプル: 抗凝固剤原液 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用し、チューブに 7 mL の血液を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します 。
- 骨髄サンプル: 抗凝固剤の原液 (ステップ 1.1) の 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用して、チューブに 7 mL の骨髄を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日は、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します。CD34 のマイクロ ビーズを使用し、CD34 陽性細胞を分離するための分離カラムのセルします 。
- 密度勾配遠心法による単核細胞の分離
メモ: 単核細胞は密度勾配遠心法 17 , 18 , 19 血液、骨髄サンプルから分離されます。- Dilute PBS で 1:1 の比率でヘパリン加血液サンプルおよび PBS で 1:3 の比率でヘパリン骨髄サンプル。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を優しく中断します 。
- は、新鮮なチューブに密度勾配媒体のボリュームを追加します。優しくレイヤーの希釈血液または骨髄密度勾配媒体の上に。2 つのレイヤーを混在させるように注意してください 。
- は、室温で 30 分間チューブを遠心分離機し、400 x g. ピペットの上部のプラズマ層を引き。密度勾配媒体上の層の単核細胞を慎重に収穫後は。新鮮なチューブに単核細胞を転送します 。
- は、チューブの単核の細胞に PBS の少なくとも 3 つのボリュームを追加します。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって細胞を優しく中断します。部屋の温度と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心
- スピン後上澄みを除去し、4 ° C、1 x 赤い細胞の溶解液 10 mL を加えます。優しくピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を再懸濁します、5 分間氷の上管を配置します。4 ° C で 30 mL の PBS を追加し、室温と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心
- 、Cytospins の準備
- 患者サンプル (すなわち、1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色、γH2AX、53BP1 の 1 つ cytospin の単核の細胞との 2 つの cytospins の準備免疫蛍光染色の組み合わせ) を (300 × g, 10 分) 遠心 ( 図 3 および 4) のそれぞれの準備のための 10 の 5 セル × 1.0 。
3。 γH2AX 53BP1 免疫蛍光染色と
- 固定・透過: 4% の 200 μ l でセルを修復する PFA 10 分。固定後、3 回ラボ シェーカーで各 5 分の 30 mL の PBS のセルを優しく洗います。その後、セルを permeabilize 0.1% の 200 μ L で 10 分間 Octoxinol 9 セルを洗浄して優しくラボ シェーカーで各 5 分 5% ブロッキング溶液 30 mL を 3 回。30 mL の新鮮な 5 %1 h. の解決を妨げるに細胞をブロック
- 抗体の孵化
- インキュベート マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) の細胞の 1 つ準備およびマウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) と細胞の他の準備とアンチ 53BP1 ポリクローナルウサギ (1: 500) 一晩で 4 ° C
- インキュベーション洗浄セル軽くラボ シェーカー各 5 分の 2% ブロッキング溶液 30 mL に 3 回後 。
- ブロックのソリューションを削除し、Alexa488 共役ヤギ抗マウス二次抗体 (1: 500) とセルの最初の準備と、Alexa488 共役ヤギ抗マウス抗体 (セルの 2 番目の準備を孵化させなさい1: 500)、常温で 1 h の Alexa555 共役ロバ抗家兎二次抗体 (1: 500).
- メディアをマウント: 細胞とスライドをボウルに入れ、セルを洗浄して優しくラボ シェーカー各 5 分の 30 ml の PBS の 3 回。PBS を削除し、セルを 4, 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントをマウントします。気泡がないように慎重にメディアをマウントの上に coverslip を置く埋め込まれています。蛍光顕微鏡による細胞を分析する前にメディアをマウントの強化のため、少なくとも 3 時間待機します 。
4。ΓH2AX、53BP1 の解析巣
- 蛍光顕微鏡: 100 X 目的で画像の中に、DAPI、アレクサ 488 Cy3 フィルターを搭載した蛍光顕微鏡で細胞核内 γH2AX、53BP1 の巣を分析倍率。カメラで画像を記録し、適切な画像処理ソフトウェアで画像を処理します 。
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Representative Results
G0/G1 期と G2 段階の場合 γH2AX 巣が (図 5 a) 異なる蛍光ドットとして表示されますセルの γH2AX 巣の分析は最も正確です。対照的に、レプリケーション プロセス (図 5 b) によって引き起こされる分散パン核 γH2AX 斑点、S 期細胞で γH2AX 巣の分析は複雑します。
細胞の固定を行った 4 %pfa (10 分) と 0.1% で透過 Octoxinol 9 (10 分)。メタノールを固定と透過にも使用できます。ただし、メタノールが非常に深刻な細胞核を分割し、4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較して明確な表示されない γH2AX 巣 γH2AX 巣を汚す Octoxinol 9。
効率的な抗体の選択は効果的な蛍光顕微鏡にとって重要です。プライマリ マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体と γH2AX と、53BP1 の免疫蛍光染色のプライマリ ウサギ ポリクローナル抗 53BP1 抗体実験を行なったそれぞれ。
各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられているに、DSB の照射組織定量化のため γH2AX の免疫蛍光染色に使用できます。照射リンパ球 (図 6) の γH2AX 巣のレベル、照射線量20,21に比例します。ΓH2AX の巣は、最大照射20,22の既に 5 分を達成するかもしれない。時間の後の時点で γH2AX の巣の崩壊は、監視することができます、DSB20,21,22の修理を反映します。
ΓH2AX と細胞と腫瘍検体10、11,12,13,1453BP1 の結合された蛍光染色による遺伝的不安定性を分析できます。急性骨髄性白血病 (図 7) 患者の CD34 陽性細胞における模範的な分析を行った。ΓH2AX、53BP1 の共局在に DSB のサイトで 53BP1 介した NHEJ 修理メカニズムの推進が示されたは、HR は禁止されました。しかし、ローカライズ共同 γH2AX と急性骨髄性白血病の芽球で 53BP1 巣の割合は変数です。追加 53BP1 信号なし γH2AX 巣が後期 S/G2 の DSB の修復のための HR を従事しています。特異 53BP1 巣の役割、未解明のままです。
図 1:ソースと内因性と外因性 DNA の結果は、1,2,3,4を損傷します。DSB、DNA 二重鎖切断;NHEJ、非相同性末端結合。
図 2:主要な DNA 二重鎖切断 (DSB) の模式図は、哺乳類細胞のメカニズムを修復します。相同組換えは、そのまま妹を使用して DSB の潜在的エラー無料修理のため後半の S/G2 段階で染色分け体。非相同性末端結合 (NHEJ)、細胞周期の中でアクティブな潜在的エラーが発生しやすいいくつかの塩基対を追加または DSB 端部の結紮術前に切除したことがあります。代替末端結合、NHEJ 欠乏場合従事かもしれない遅い変異原性バックアップ修理メカニズムです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:デバイスは、cytospins を準備するため。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:Cytospins の準備。各サンプルの 2 つの cytospins は、10 分の 300 x g で 10 の5セル × 1.0 の遠心分離によって準備されます。1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色用し、別 cytospin が結合された γH2AX、53BP1 免疫蛍光染色に利用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ΓH2AX 巣の細胞株培養正常線維芽細胞の細胞周期依存パターン。培養線維芽細胞の核 (ブルー、DAPI) (A) γH2AX 巣 (緑、アレクサ 488) は G0/G1 あるいは G2 段階で異なるドットとして表示されます。(B) γH2AX 巣 S 期で線維芽細胞の核のような分散したパン核スペックル (スケールバー = 5 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ΓH2AX 巣 x 線では、健康な人のリンパ球を照射しました。ΓH2AX の巣 (緑、アレクサ 488) リンパ球の核 (ブルー、DAPI) のイメージは 100 mGy を照射後 5 分で記録 (スケールバー = 5 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞における γH2AX、53BP1 の巣の共局在。ΓH2AX の巣 (緑、アレクサ 488)、53BP1 巣 (赤、Cy3) の共局在を示す 53BP1 による非相同性末端結合修復機構 DNA 二重鎖切断部位での推進 (スケールバー = 5 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、形成と幅広い分野で DSB の修復の分析に有用な方法です。実験の結果に影響を与える重要なパラメーターは、細胞周期、固定と透過の細胞、抗体、およびハードウェアの選択、蛍光顕微鏡のソフトウェアに使用されるエージェントの段階です。
正常線維芽細胞細胞株培養を指数関数的に成長することにより細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響を示した。G0/G1 の異なる蛍光ドットとして登場した γH2AX 巣と S 期 (図 5) で分散したパン核 γH2AX 斑点と比べて G2 段階。G0/G1 の異なる γH2AX 巣相し、G2 段階一過性および/または構成で指定された DNA の損傷セル繰り返し通路中に取得しました。逆に、S 相に分散した斑点のみ一過性が発生し、レプリケーション ・ プロセスとおそらく関連していた。パン核 γH2AX 斑点を妨げる可能性があります分析から S 期細胞の排除、本物 γH2AX 病巣の解析を推奨します、S 相の特定 γH2AX パターンによって容易に行われています。また、DAPI 信号の強度を測定することによって相の特定のマーカーの S (例えばサイクリン A) のアプリケーションは、S 期細胞を除外できます。また、G0/G1 期の細胞の同期と増殖停止の誘導は一晩室温 (すなわち18-20 ° C) でサンプルを保存することにより、cytospins を準備する前に役に立つかもしれません。
固定と透過のプロシージャは、γH2AX、53BP1 の染色で重要な手順です。固定は形態および細胞23の抗原性を維持するために必要です。透過は、細胞内および核抗原24にアクセスをできます。PFA は固定のため比較的穏やかなエージェントをフォーム メチレン架橋する塩基性アミノ酸との反応によるタンパク質の構造を維持しながら細胞を安定化します。PFA と固定後、数日から数週間後の処理までの cytospins を格納できます。ΓH2AX、53BP1 の検出、セルはグリセリンがする必要があります。Octoxinol 9 は、ポリオキシ エチレン鎖から成る中性の親水性のヘッド グループを含む非イオン性洗剤として使用されました。Octoxinol 9 は、優しく細胞核を分割し、非常にはっきりと γH2AX の巣が維持されます。また、あまりにも固定のセルの透過メタノール使用できます。メタノールは、タンパク質を沈殿させるし、抗体を透過し、細胞膜の脂質を分解します。しかし、メタノールによる治療はおそらくより積極的な γH2AX 巣がありますとしてはっきりと 4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較されたとき Octoxinol 9。にもかかわらず、効率的な抗体は、γH2AX、53BP1 の免疫の重要な役割を再生します。したがって、実績のある抗体の使用をお勧めします (テーブルの材料/機器を参照してください)。抗体のシリアル希釈は、最適な抗体濃度測定における役に立つかもしれません。
ΓH2AX 巣は低用量放射線 biodosimetry 内のマーカーとして使用される > 1 mGy25。ΓH2AX 巣を 100 mGyの in vitro (図 6) の線量は照射後 5 分でリンパ球で行った。H2AX を照射後 DSB のサイトで急速にリン酸化されると γH2AX の巣の数がすでに照射20,22後 5 分で最大に達する。ただし、照射後すぐに修復処理を開始、γH2AX 巣が明瞭な減衰率で削除されます。したがって、時系列で γH2AX 巣の数を監視するため、照射後の時間で指定された時点で氷のサンプルを置くことによって修復プロセスを中断することをお勧めします。
ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、癌細胞における遺伝子不安定性の分析に有用な方法です。CD34 陽性細胞は、CD34 のマイクロ ビーズを用いた急性骨髄性白血病患者の骨髄から濃縮しました。ΓH2AX 巣と巣 53BP1 のイメージは、特定の蛍光フィルターを使用して得られました。Cytospin の明るい照明は、γH2AX、53BP1 の巣の適切な蛍光を誘導するために重要です。画像を記録した後、巣とバック グラウンド信号の強度の適応は、イメージング ソフトウェアを使用して必要です。ΓH2AX、53BP1 の巣の共局在を解析するため、画像がマージされます (図 7)。基本的な落射蛍光顕微鏡カメラ システムとの組み合わせで、DAPI、アレクサ 488 Cy3 のフィルターを装備し、イメージング ソフトウェアは γH2AX の分析のために十分、53BP1 巣 DAPI で細胞核を染色します。ただし、特定のアプリケーション (例えば、単一の粒子トラックに沿って DNA 損傷の解析) が (共焦点レーザ走査型顕微鏡など提供) として、高い解像度と背景の蛍光性の低減を必要があります。さらに、顕微鏡を用いた技術は急速に発展中の領域、200 以下の解像度 nm は新式の顕微鏡で実現可能。
要約すると、この原稿は DSB 形成と修復の重要な問題を明らかに γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DSB の詳細な分析手順のプロトコルを提供しています。DSB の研究は顕微鏡技術の発展から明確にお越し。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
プロジェクトは、ドイツのホセ ・ カレーラス白血病財団 (DJCLS 14 R/2017) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
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