Summary
Dette manuskriptet gir en protokoll for analyse av DNA dobbel-strand bryter ved immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1.
Abstract
DNA dobbel-strand bryter (DSB) er alvorlig DNA lesjoner. Analyse av dannelse og reparasjon av DSB er relevant i et bredt spekter av forskningsfelt inkludert genomet integritet, gentoksisitet, stråling biologi, aldring, kreft og narkotika utvikling. Svar på DSB, er histone H2AX fosforylert på Serine 139 i en region av flere megabase par danner diskret kjernefysiske foci detectable av immunofluorescence mikroskopi. I tillegg er 53BP1 (p53 binding protein 1) er en annen viktig DSB svarer protein fremme reparasjon av DSB melder nonhomologous slutten-mens forebygge homologe rekombinasjon. Ifølge de bestemte funksjonene γH2AX og 53BP1, kan kombinerte analyse av γH2AX og 53BP1 av immunofluorescence mikroskopi være en fornuftig tilnærming for en detaljert analyse av DSB. Dette manuskriptet gir en trinnvis protokoll med metodisk notater for å utføre teknikken. Spesielt er påvirker celle syklusen γH2AX foci mønstre demonstrert i normal fibroblaster av cellen linjen NHDF. Videre er verdien av γH2AX fokuspunktene som en biomarkør avbildet i x-ray bestrålt lymfocytter av en frisk person. Til slutt, genetisk ustabilitet er undersøkt i CD34 + celler i en pasient med akutt myelogen leukemi av immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1.
Introduction
DNA er kontinuerlig skadet av endogene (f.eks, replikering stress, reaktive oksygen arter, iboende ustabilitet av DNA) og ytre (f.eks, kjemiske radikaler, bestråling) kilder (figur 1)1,2 ,3,4. Blant DNA skade, DNA dobbel-strand bryter (DSB) er spesielt alvorlige lesjoner og kan indusere celledød eller kreft. 50 DSB kan oppstå per celle og celle syklus5. I pattedyrceller, homologe rekombinasjon (HR) og nonhomologous slutten med (NHEJ) utviklet som store trasé for reparasjon av DSB (figur 2). HR forekommer i slutten S/G2 fase og bruker en intakt søster chromatid som en mal for potensielt feilfrie reparasjon. Til sammenligning er NHEJ aktiv hele cellen syklus og potensielt mutagene som base parene kan legges til eller kappet før ligation av ødelagt. I tillegg kan alternativ slutten-begynte være engasjert som en langsom mutagene sikkerhetskopiere reparasjon mekanisme ved NHEJ mangel6,7.
DSB induserer fosforylering av histone H2AX på Serine 139 i en region av flere megabase rundt hver DSB. Forming kjernefysiske fokuspunktene kalles γH2AX foci og er detectable av immunofluorescence mikroskopi8. ΓH2AX fremmer rekruttering av ytterligere DSB svarer proteiner og er involvert i chromatin remodeling, DNA-reparasjon og signal signaltransduksjon9. Som hver γH2AX fokus anses å representere en enkelt DSB, er kvantifisering av DSB av immunofluorescence mikroskopi mulig, som har vist i kreftcelle linjer og pasienten prøver10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 binding protein 1) er en annen viktig protein på formidling DSB reparasjon. Det er involvert i rekrutteringen av DSB svarer proteiner, checkpoint signalering og Adept DSB slutter15. I tillegg spiller 53BP1 en avgjørende rolle i DSB repair pathway valg. Det trigger reparasjon av DSB mot NHEJ HR er forhindret16. Vurderer ekte funksjonene γH2AX og 53BP1 i DSB reparasjon, kan samtidig analyse av γH2AX og 53BP1 av immunofluorescence mikroskopi være en nyttig metode for nøyaktig analyse av dannelse og reparasjon av DSB.
Dette manuskriptet gir en trinnvis protokoll for å utføre immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 i celle kjerner. Spesielt brukes teknikken i vanlig fibroblaster av cellen linjen NHDF, røntgen bestrålt lymfocytter av en frisk person og CD34 + celler i en pasient med akutt myelogen leukemi. Detaljer om metoden er påpekt i forbindelse med presenterte resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metodene som er beskrevet her er godkjent av etiske komiteen II av det medisinske fakultet Mannheim av Heidelberg University. Skriftlig samtykke ble innhentet av alle personer som.
1. forberedelse for materiale
- antikoagulerende lagerløsning: forberede en antikoagulerende lager løsning av 200 IE heparin per mL i 0,9% natriumklorid. Fyll hver samling rør (tegne volum 9 mL) med 2 mL antikoagulerende lager løsningen før uttak av blod og benmarg prøvene.
- Lysis løsning for røde celler: forberede 10 x lysis løsning for røde celler med 82.91 g salmiakk, 7.91 g ammonium bikarbonat og 2 mL 0,5 M ethylenediaminetetraacetic sur løsning til en pH på 8.0 ved å løse opp agentene i dobbel-destillert vann til et totalt volum på 1 L.
- Fiksering løsning: legge til 8.3 µL av en 1 M kaliumhydroksid løsning 360 mg paraformaldehyde (PFA) i et microtiter rør. Fyll røret med fosfat bufret saltvann (PBS) til 1 mL merke av rør og varme røret i en oppvarming blokk på 95 ° C å få 1 mL av en 36% PFA løsning. Overføre 1 mL 36% PFA løsningen til et rør med en kapasitet på 15 mL. Legge til 8 mL PBS 1 mL 36% PFA løsningen, å få 9 mL av en 4% PFA lagerløsning. Aliquot 4% PFA lager løsningen og butikk på-18 ° C før bruk til å feste cellene.
FORSIKTIG: 1) kaliumhydroksid løsning er etsende. Vær oppmerksom på øye- og beskyttelse. 2) PFA er kreftfremkallende. Unngå hudkontakt og innånding. Forberede fiksering løsningen under hette. - Permeabilization løsning: legge til 50 µL Octoxinol 9 til 50 mL PBS å få en løsning på ca 0,1% Octoxinol 9.
- Blokkerer løsning: forberede 5% og 2% blokkerer løsninger ved å blande protein blokkerer agent med PBS og lager på 6 – 8 ° C.
2. Forberedelse av prøvene
- fibroblaster i cellekultur: dyrke menneskelig fibroblaster av cellen linjen NHDF i en fuktet 5% CO 2 atmosfæren på 37 ° C i RPMI 1640 medium med 10% fosterets kalv serum, 4 mM glutamin, og 1% penicillin/streptomycin.
- Utarbeidelse av et mikroskop lysbilde med tilhenger fibroblaster
- fjerne mediet fra flasken (75 cm 2 vekstområde) eksponensielt voksende NHDF fibroblaster. Legge til 10 mL PBS kolbe. Vask tilhenger fibroblaster forsiktig ved å manuelt riste flasken i 1
- Fjern PBS og tilsett 1 mL trypsin i flasken. Riste flasken forsiktig for å sikre at alle tilhenger celler er dekket av trypsin. Fjern trypsin fra flasken. Kolbe inn inkubator for 5 min på 37 ° C.
- Ta kolbe ut av inkubatoren og legge 10 mL RPMI 1640 medium i flasken. Pipetter mediet opp og ned flere ganger for å spre fibroblaster.
- Pipetter 0,3 mL av de spredte fibroblaster på hver av de to feltene mikroskop lysbildet og sette lysbildet i inkubator 24 h slik at fibroblaster overholder lysbildet. For immunostaining av γH2AX og 53BP1 i kjerner av fibroblaster, gå videre til trinn 3.1.
- Utarbeidelse av et mikroskop lysbilde med tilhenger fibroblaster
- Pasientprøvene
- blod prøver: bruke samling rør som var fylt med 2 mL antikoagulerende lager løsningen og legge 7 mL blod inn i rørene. Lagre prøver over natten i romtemperatur (dvs., 18-20 ° C). Neste dag, isolere G0/G1 fasen hviler mononukleære celler ved tetthet gradert sentrifugering (trinn 2.2.3).
- Benmarg eksempler: bruke samling rør som var fylt med 2 mL antikoagulerende lager løsningen (trinn 1.1) og legge til 7 mL benmarg inn i rørene. Lagre prøver over natten i romtemperatur (dvs., 18-20 ° C). Neste dag, isolere G0/G1 fasen hviler mononukleære celler ved tetthet gradert sentrifugering (trinn 2.2.3). Bruk CD34 microbeads og celle separasjon kolonner for isolering av CD34 + cellene.
- Isolasjon av mononukleære celler med tetthet gradert sentrifugering
Merk: Mononukleære celler er isolert fra blod og benmarg prøver av tetthet gradert sentrifugering 17 , 18 , 19.- Dilute heparinized blodprøve i forholdet 1:1 med PBS og heparinized benmarg prøven i forholdet 1:3 med PBS. Suspendere cellene forsiktig ved å tegne dem av pipette to ganger.
- Legg til et volum tetthet gradert middels slik frisk. Forsiktig laget utvannet blod og benmarg over tetthet gradert medium. Ta vare ikke for å blande de to lagene.
- Sentrifuge røret i 30 min ved romtemperatur og 400 x g. trekke øvre plasma laget av med pipette. Så nøye innhøsting av mononukleære celler i laget over tetthet gradert medium. Overføre mononukleære celler i en fersk tube.
- Legge til minst tre volumer med PBS mononukleære celler i røret. Suspendere cellene forsiktig ved å tegne dem av pipette to ganger. Sentrifuge røret i 10 min ved romtemperatur og 400 x g.
- Etter spinn Fjern nedbryting og tilsett 10 mL 4 ° c, 1 x lysis løsning for røde celler. Resuspend cellene forsiktig ved å tegne dem av pipette to ganger, og sett røret på is 5 min. Deretter legger til 30 mL PBS 4 ° C og sentrifuge røret i 10 min ved romtemperatur og 400 x g.
- Utarbeidelse av cytospins
- forberede to cytospins med mononukleære celler av pasienten prøvene (dvs. en cytospin til γH2AX immunofluorescence farging og en cytospin for γH2AX og 53BP1 kombinert immunofluorescence flekker) med sentrifugering (300 x g, 10 min) 1,0 x 10 5 celler for hvert preparat ( Figur 3 og 4).
3. γH2AX og flekker for 53BP1 Immunofluorescence
- fiksering og permeabilization: fikse cellene med 200 µL på 4% PFA i 10 min. Fiksering, vaskes cellene forsiktig tre ganger med 30 mL av PBS i 5 min hver på en lab shaker. Deretter permeabilize cellene med 200 µL på 0,1% Octoxinol 9 for 10 min. vask cellene forsiktig tre ganger med 30 mL 5% blokkering for 5 min hver på en lab shaker. Blokkere cellene i 30 mL av fersk 5% blokkerer løsning for 1 h.
- Inkubasjon med antistoffer
- Inkuber en forberedelse av cellene med en musen monoklonale anti-γH2AX antistoff (1:500) og andre utarbeidelse av cellene med en musen monoklonale anti-γH2AX antistoff (1:500) og polyklonale kanin anti-53BP1 antistoff (1:500) natten på 4 ° C.
- Etter inkubasjon vaskes cellene forsiktig 3 ganger med 30 mL 2% blokkering for hver 5 min til en lab shaker.
- Fjerner blokkerende løsningen og Inkuber første utarbeidelse av cellene med et Alexa488-konjugerte geit anti-musen sekundære antistoff (1:500) og andre utarbeidelse av cellene med en Alexa488-konjugerte geit anti-musen sekundære antistoff ( 1:500) og et Alexa555-konjugerte esel anti-kanin sekundære antistoff (1:500) 1t ved romtemperatur.
- Montering medium: sett lysbildet med cellene i en bolle og vaske cellene forsiktig tre ganger med 30 mL av PBS for hver 5 min til en lab shaker. Fjerne PBS og montere cellene med montering medium som inneholder 4,6-diamidino-2-phenylindole. Forsiktig sette en dekkglassvæske over montering mediet slik at ingen luftbobler innebygd. Vent minst 3 h for herding av montering mediet før analysere cellene av fluorescens mikroskopi.
4. Analyse av γH2AX og 53BP1 Foci
- fluorescens mikroskopi: analysere på γH2AX og 53BP1 bildet i cellen kjerner med fluorescens mikroskop utstyrt med filtre for DAPI, Alexa 488 og Cy3 under bildebehandling på en 100 X målsetting forstørrelse. Ta bilder med et kamera og behandle bildene med riktige bildebehandlingsprogramvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse av γH2AX foci i celler er mest nøyaktige i fasen G0/G1 og G2 fasen når γH2AX foci vises som distinkte fluorescerende prikker (figur 5A). I kontrast, er analyse av γH2AX foci i celler i S fasen komplisert ved spredt pan-kjernefysiske γH2AX flekker forårsaket av replikeringsprosessen (figur 5B).
Fiksering av celler ble utført med 4% PFA (10 min) og permeabilization med 0,1% Octoxinol 9 (10 min). Metanol kan brukes for fiksering og permeabilization, også; imidlertid metanol kan bryte opp cellen kjerner ganske alvorlig og smøre ut på γH2AX bildet så på γH2AX-bildet ikke vises tydelig i forhold til γH2AX fokuspunktene ved behandling med 4% PFA og 0,1% Octoxinol 9.
Valg av effektiv antistoffer er avgjørende for effektiv immunofluorescence mikroskopi. Eksperimenter ble utført med en hovedknappen på musen monoklonale anti-γH2AX antistoffer og en primær kanin polyklonale anti-53BP1 antistoffer til immunofluorescence farging av γH2AX og 53BP1, henholdsvis.
Som hver γH2AX fokus anses å representere en enkelt DSB, kan immunofluorescence farging av γH2AX brukes for kvantifisering av DSB bestrålt vev. ΓH2AX fokus i bestrålt lymfocytter (figur 6) er proporsjonal med bestråling dose20,21. ΓH2AX foci kan oppnå maksimalt allerede 5 min bestråling20,22. Forfallet av γH2AX fokus på senere tidspunkter kan overvåkes og gjenspeiler reparasjon av DSB20,21,22.
Genetisk ustabilitet kan analyseres av kombinerte immunofluorescence farging av γH2AX og 53BP1 i linjer og svulst prøver10,11,12,13,14. En eksemplarisk analyse ble gjennomført i CD34 + cellene i en pasient med akutt myelogen leukemi (figur 7). Co lokalisering av γH2AX og 53BP1 angitt fremme 53BP1-mediert NHEJ reparasjonsmekanismene på steder av DSB mens HR ble forhindret. Prosentandelen av co lokalisere γH2AX og 53BP1 fokus i støt av akutt myelogen leukemi var imidlertid variabel. ΓH2AX fokuspunktene uten en ekstra 53BP1 signalet kan har engasjert HR for reparasjon av DSB i slutten S/G2 fase. Rollen til entall 53BP1 fokus vært unnvikende.
Figur 1: Kildene og konsekvensene av endogene og eksogene DNA skade1,2,3,4. DSB, DNA dobbel-strand bryter; NHEJ, nonhomologous slutten-med.
Figur 2 : Skjematisk visning av store DNA dobbel-strand pause (DSB) reparasjon mekanismer i pattedyrceller. Homologe rekombinasjon bruker en intakt søster chromatid i slutten S/G2 fase for potensielt feilfrie reparasjon av DSB. Nonhomologous end-delta (NHEJ) er aktiv hele cellen syklus og potensielt feilutsatte som noen base parene kan legges til eller kappet før ligation av DSB. Alternative end-delta er en langsom mutagene sikkerhetskopiere reparasjon mekanisme som kan være engasjert i NHEJ mangel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Enhet for å forberede cytospins. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Utarbeidelse av cytospins. To cytospins av hvert utvalg er utarbeidet av sentrifugering 1,0 x 105 cellene på 300 x g i 10 min. En cytospin brukes til farging av γH2AX-immunofluorescence og en annen cytospin benyttes for kombinert γH2AX og 53BP1 immunofluorescence flekker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Cellen syklus avhengige mønstre i γH2AX fokus i vanlig fibroblaster cellen linje NHDF. (A) γH2AX foci (grønn, Alexa 488) i kjerner (blå, DAPI) av NHDF fibroblaster vises som distinkte prikker i G0/G1 eller G2 fase. (B) γH2AX foci i kjerner av fibroblaster i S fase vises som spredt pan-kjernefysiske flekker (skala bar = 5 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : ΓH2AX fokus i x-ray bestrålt lymfocytter av en frisk person. Bilder av γH2AX foci (grønn, Alexa 488) i kjerner (blå, DAPI) av lymfocytter registreres på 5 min etter bestråling med 100 mGy (skala bar = 5 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Co lokalisering av γH2AX og 53BP1 fokus i CD34 + celler i en pasient med akutt myelogen leukemi. Co lokalisering av γH2AX bildet (grønn, Alexa 488) og 53BP1 fokus (rød, Cy3) angir fremme 53BP1-mediert nonhomologous slutten-begynte reparasjonsmekanismene på steder av DNA dobbel-strand bryter (skala bar = 5 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 er en nyttig metode for å analysere dannelse og reparasjon av DSB i et bredt spekter av forskningsfelt. Kritiske parametere som påvirker utfallet av eksperimentene er fasen av cellen syklus, agenter brukes til fiksering og permeabilization av celler, valg av antistoffer, og maskinvaren og programvaren til fluorescens mikroskopet.
Påvirkning av cellen syklus på γH2AX foci mønstre ble demonstrert av eksponensielt voksende normal fibroblaster av cellen linjen NHDF. På γH2AX bildet dukket opp som tydelig fluorescerende prikker i G0/G1 og G2 faser i forhold til spredt pan-kjernefysiske γH2AX flekker i S fase (figur 5). På forskjellige γH2AX bildet i G0/G1 fase og i G2 fase angitt forbigående og/eller konstituerende DNA skade som kan ha anskaffet under repeterende celle syklus passasjer; derimot de spredte flekker i S fase skjedde bare transiently og var antagelig knyttet replikeringsprosessen. Som den pan-kjernefysiske γH2AX flekker kan forstyrre er analyse av ekte γH2AX foci, utelukkelse av S fase celler fra analyse anbefalt, som er lett gjort av den S fase bestemte γH2AX mønsteret. Celler i S fase kan eventuelt ekskluderes ved måling av intensiteten av DAPI eller ved bruk av S fase spesifikke indikatorer (f.eksCyclin A). Videre kan induksjon av vekst arrestasjon med synkronisering av celler i G0/G1 fase være nyttig før du tilbereder cytospins ved å lagre prøvene ved romtemperatur (dvs., 18-20 ° C) over natten.
Prosedyrene for fiksering og permeabilization er viktige skritt i immunostaining γH2AX og 53BP1. Fixation er nødvendig for å bevare morfologi og antigenicity celler23. Permeabilization gir tilgang til intracellulær og kjernefysiske antigener24. PFA er en relativt mild agent for fiksering og stabiliserer cellene samtidig bevare proteinstrukturer som reagerer med grunnleggende aminosyrer til skjemaet methylene krysskoblinger. Etter fiksering med PFA, kan cytospins lagres for dager og uker før videre behandling. Oppdagelsen av γH2AX og 53BP1 må cellene være permeabilized. Octoxinol 9 ble brukt som et ikke-ioniske vaskemiddel som inneholder uncharged hydrofile hodet grupper bestående av polyoxyethylene moieties. Octoxinol 9 bryter opp cellen kjerner forsiktig og bevarer γH2AX foci ganske tydelig. Alternativt, metanol kan brukes for fiksering og permeabilization i cellene, også. Metanol precipitates proteiner og lipider fra cellemembranen, noe som gjør dem permeable til antistoffer, oppløser. Men behandling med metanol er antagelig mer aggressive og γH2AX foci kan ikke vises som tydelig sammenlignet med γH2AX fokuspunktene ved behandling med 4% PFA og 0,1% Octoxinol 9. Uansett spiller effektiv antistoffer en viktig rolle for immunostaining av γH2AX og 53BP1. Derfor bruk av bevist antistoffer er anbefalt (se Tabell av materialer/utstyr). En seriell fortynning av antistoffer kan være nyttig for bestemmelse av de optimale antistoff konsentrasjonene.
ΓH2AX foci brukes som en markør i stråling biodosimetry ved lave doser > 1 mGy25. ΓH2AX fokus var analysert i lymfocyttene på 5 min etter x-ray bestråling med en dose av 100 mGy i vitro (figur 6). Som H2AX er fosforylert raskt på steder av DSB etter bestråling, kan antall γH2AX foci allerede nå maksimalt 5 min etter bestråling20,22. Men reparasjonsprosessen starter umiddelbart etter bestråling og γH2AX foci fjernes med en distinkt forfallet rate. Derfor, for å overvåke antallet γH2AX foci i kronologisk rekkefølge, er det tilrådelig å avbryte reparasjonsprosessen ved at prøven på isen på den angitte tidspunkt etter bestråling.
Immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 er en nyttig metode for å analysere genetisk ustabilitet i kreftceller. CD34 + celler ble beriket fra benmargen av en pasient med akutt myelogen leukemi med CD34 microbeads. Bilder av γH2AX bildet og 53BP1 foci ble innhentet med bestemte fluorescens filtre. En lys belysning av cytospin er viktig å indusere tilstrekkelig fluorescens av på γH2AX og 53BP1 bildet. Etter innspillingen bildet, er tilpasning av intensiteten av på bildet og bakgrunn signalet nødvendig ved hjelp av tenkelig programvare. For å analysere den co lokaliseringen av γH2AX og 53BP1 foci, bildene er slått sammen (figur 7). Grunnleggende epifluorescence mikroskop utstyrt med filtre for DAPI, Alexa 488 og Cy3 i kombinasjon med et kamera og bildebehandlingsprogrammer er tilstrekkelig for analyse av γH2AX og 53BP1 fokus i DAPI farget celle kjerner. Enkelte programmer (f.eks, analyse av DNA skade langs én partikkel spor) kan imidlertid kreve høyere oppløsning og reduksjon av bakgrunnen fluorescens (som f.eks AC confocal mikroskopi for laserskanning). Videre mikroskop teknologi er et raskt voksende felt og en oppløsning under 200 nm er mulig med state-of-the-art mikroskop.
I sammendraget, dette manuskriptet høydepunkter kritiske problemer av DSB formasjon og reparasjon og gir en trinnvis protokoll for en detaljert analyse av DSB av immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1. Forskning på DSB tydelig fordelen av nylige og fremtidige utviklingen i mikroskopet teknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet av tysk José Carreras leukemi stiftelsen (DJCLS 14 R/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-31572 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
