الحمضية وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم. لتقييم آثار حمضية pH خارج الخلية في سرطان الخلايا في المختبر، قمنا بإنشاء نظم الثقافة حمضية بسيطة.
شروط وورم المكروية، مثل نقص أو المجاعة المغذيات، تلعب أدواراً حاسمة في تطور السرطان والأورام الخبيثة. ومع ذلك، دور الأس الهيدروجيني خارج الخلية الحمضية في عدوانية الورم وآليتها الأساسية لا على نطاق واسع درست مقارنة بظروف المجاعة التاكسج أو المغذيات. وبالإضافة إلى ذلك، لم تبلغ تماما أسلوب ثقافة محددة تحديداً جيدا لتقليد خارج الخلية الحمضية وورم المكروية.
نقدم هنا طريقة بسيطة في المختبر ثقافة للحفاظ على درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية باستخدام تخفيض بيكربونات وزيادة لاكتات أو تركيزات HCl على المديين المتوسط والثقافة. الهيدروجيني المتوسط تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل وتدريجيا بنسبة 72 ح أثر الثقافة PANC-1 و AsPC-1 خلايا سرطان البنكرياس. ثلاثة شروط متميزة الوسائط الحمضية في هذه الدراسة العالية upregulated الجينات المراعية للحموضة مثل MSMO1، INSIG1، و IDI1 مقارنة بنقص أو المجاعة المغذيات. يمكن استخدام أوبريجوليشن لهذه الجينات كعلامة على درجة الحموضة الحمضية. هذه التقنيات البسيطة مفيدة توضيح الآليات الكامنة للورم الخبيث تحت الحمضية وورم المكروية. ولذلك، يمكن اكتشاف الاستجابات الخلوية الأس الهيدروجيني الحمضية ليس فقط في الخلايا السرطانية ولكن أيضا في الخلايا الأولية مثل الخلايا الأنبوبي الكلوي، بالنسبة حمضية الاضطرابات الأخرى بما في ذلك، ketoacidosis السكري، من نظامنا الثقافة الأس الهيدروجيني الحمضية خارج الخلية الحماض اللبن والحماض الأنبوبي الكلوي الحماض التنفسي.
وورم المكروية تلعب أدواراً حاسمة في تطور الورم وسرطان الخلية الأيض1،،من23. الخلايا السرطانية غالباً ما يتعرضون لظروف مثل نقص والحرمان المغذيات، ودرجة الحموضة خارج الخلية الحمضية (pHe). ومع ذلك، دور الفنيل ألانين في تطور الورم لم يتضح على نطاق واسع كما هو الحال في المجاعة نقص أو المغذيات. يمكن أن تصبح pHe في أنسجة الورم الحمضية، تصل إلى حوالي الأس الهيدروجيني 6.84،5. ينبع الهيدروجيني الحمضية من إفراز جليكوليتيك الهوائية واللاهوائية للبروتونات (H+) ولاكتات بالسرطان تكاثر الخلايا5،6.
وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن هستون الحمضية الناجمة عن الفنيل ألانين ديسيتيليشن، وأكسدة الأحماض الدهنية، والرقابة من lysosomes الحمضية للتكيف للبيئة الحمضية الشديدة7،،من89،10. ومع ذلك، يؤثر الآليات عن طريق التي تحمض خارج الخلية سلوك السرطان وهوية مفتاح المنظمين في الأس الهيدروجيني الحمضية وورم المكروية لم تحدد تماما. وعلاوة على ذلك، وصفت عدة تقارير مختلف وسائل الإعلام الأس الهيدروجيني الحمضية باستخدام تركيزات غير واضحة بيكربونات والمخزن المؤقت تريس، والأنابيب، وحبيس أو لاكتات و HCl، ولكن هناك تقارير قليلة تثبت استقرار المعدل المتوسط ولا شاملة مقارنة بين عدة وسائط الثقافة الحمضية متميزة7،،8،9،10
لتوضيح أن المنظمين الرئيسيين والتغيرات الأيضية في الخلايا السرطانية في سياق تحمض خارج الخلية، إنشاء نموذج ثقافة بسيطة في المختبر للحفاظ على الفنيل ألانين حمضية، وبحث دور الفنيل ألانين في خلايا السرطان11. باستخدام هذا الأسلوب، حافظنا على وسيط الثقافة حمضية مع pHe 6.8 في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2، استخدام بيكربونات خفض تركيزات في الأجلين المتوسط والثقافة. الأس الهيدروجيني 7.4 استخدمت كالمعتاد والتحكم في المتوسط. تستمر لمدة 24 ساعة على الأقل درجة الحموضة المتوسطة وانخفضت تدريجيا من ح 72 خلال ثقافة خلايا سرطان البنكرياس PANC-1 و AsPC-1. نظراً لتسارع تحلل تعزيز إفراز البروتونات ليس فقط ولكن أيضا لاكتات7،،من89، أنشأنا أيضا ثقافة أسلوب محاكاة الحماض لاكتات المستحثة بإضافة لاكتات بدلاً من خفض تركيز بيكربونات. بالإضافة إلى ذلك، pHe الحمضية الناجمة عن HCl على المديين المتوسط ويسمح لنا باستبعاد إمكانية أن الاستجابات الخلوية للأس الهيدروجيني الحمضية الثقافة المتوسطة ليست نتيجة لانخفاض تركيز بيكربونات. وعلاوة على ذلك، باستخدام وسائل الإعلام المختلفة مع الرقم الهيدروجيني من 6.4 إلى 7.4 مع تركيز بيكربونات مختلفة، يمكننا تقييم مدى الآثار الفنيل ألانين في الاستجابات الخلوية.
هنا، يمكننا وصف نظام ثقافة الأس الهيدروجيني حمضية بسيطة وعملية التقييم. أن الجمع بين الطرق الثلاث تحمض المتوسط، أي، بيكربونات انخفاض التركيز وإضافة لاكتات، وإضافة HCl، أتاح لنا للتحقيق الدقيق في إليه الاستجابة للأس الهيدروجيني ومقارنة الاستجابة الخلوية للورم الأخرى ميكرونفيرونمين?…
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء شعبة العلوم الجينوم ومختبر لنظم علم الأحياء والطب، ركاست، جامعة طوكيو. لا سيما ونحن نشكر الدكتور H. أبوراتاني، كوداما ت. د.، (لسبم، ركاست، وجامعة طوكيو)، الدكتور ك. توميزوكا ويوشيدا ت. د. د. أ
كونيساتو (هاكو كيووا كيرين Co., Ltd.) لإجراء مناقشات مفيدة والدعم. هذا العمل جزئيا وأيده معونات للشباب عالم (A) (26710005، ل)، معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (ح 01567، ل 26116711 و 16)، ومعونات للتحدي
البحوث الاستكشافية (16 14605 ك، ل) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا من اليابان ومؤسسة العلوم وتاكيدا (ل)، ومؤسسة كوباياشي لأبحاث السرطان (ل) والمشروع لبحوث السرطان و تطور العلاجية (ف–إنشاء) والبحث العملي لمكافحة السرطان مبتكرة من وكالة اليابان للبحوث الطبية والتنمية، AMED (ل).
Reagents | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell lines | |||
PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
TIG | JCRB Cell Bank | ||
MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |