Microenvironment הגידול חומצי ממלאת תפקידים חיוניים בהתקדמות הגידול. כדי להעריך את ההשפעות של ה-pH חומצי חוץ-תאית על סרטן תאי במבחנה, הקמנו מערכות פשוטות תרבות חומצי.
תנאי microenvironment הגידול, כמו היפוקסיה או מזין רעב, משחק תפקידים חיוניים התקדמות סרטן, גידול ממאיר. עם זאת, התפקיד של pH חומצי חוץ-תאי הגידול תוקפנות, המנגנון הבסיסי שלה לא בהרחבה נחקרה בהשוואה לתנאי רעב ובשפתיים או מזין. בנוסף, שיטה תרבות מוגדרים היטב כדי לחקות את microenvironment חומצי חוץ-תאי הגידול לא מלאה דווחה.
כאן אנו מציגים שיטה תרבות פשוטה במבחנה כדי לשמור על pH חומצי חוץ-תאית באמצעות צמצום ביקרבונט ו לקטט מוגבר או HCl ריכוזים במדיום תרבות. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h בעקבות התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. שלושה תנאים ברורים מדיה חומצי במחקר זה מאוד גנים pH מגיב upregulated כגון MSMO1, INSIG1ו- IDI1 לעומת היפוקסיה או מזין רעב. קולטנים upregulation של גנים אלה יכול לשמש כסמן של pH חומצי. טכניקות פשוטות אלו מועילים התירי מנגנונים הבסיסית של גידול ממאיר תחת microenvironment הגידול חומצי. לכן, מערכת התרבות שלנו pH חומצי חוץ-תאית מאפשרת גילוי של pH חומצי הסלולר תגובות לא רק בתאים סרטניים אלא גם תאים ראשוני, כגון תאים אבובית הכליה, ביחס חומצי הפרעות אחרות כולל, חמצת קטוטית סוכרתית, חמצת לקטית, חמצת אבובית הכליה ו חמצת נשימתית.
Microenvironment הגידול משחק תפקידים חיוניים ב התקדמות הגידול, סרטן התא חילוף החומרים1,2,3. תאים סרטניים נחשפים לעיתים קרובות תנאים כמו היפוקסיה, מניעת מזון ו pH חומצי חוץ-תאית (pHe). עם זאת, תפקידו של pHe בהתקדמות הגידול יש לא הובהרו בהרחבה כמו הרעבה היפוקסיה או חומר מזין. PHe ברקמת הגידול יכול להיות חומצי, להגיע בערך pH 6.84,5. ה-pH חומצי נובע הפרשה glycolytic ואנאירוביים של פרוטונים (H.+), חומצת החלב על ידי סרטן מתרבים תאים5,6.
מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי היסטון חומצי pHe-induced deacetylation חמצון חומצות שומן, אקסוציטוזה של lysosomes חומצי עבור התאקלמות9,108,7,חמור החומצית. עם זאת, המנגנונים דרך איזה acidification חוץ-תאית משפיעה על התנהגות סרטן והזהות של מפתח הרגולטורים ב microenvironment הגידול pH חומצי לא מלא נקבעו. יתר על כן, מספר דיווחים מתוארת מדיה pH חומצי שונים באמצעות ריכוזים לא ברור של ביקרבונט, מאגר טריס, צינורות, HEPES או לקטאט HCl, אבל ישנם כמה דיווחים להפגין את היציבות של מנוכי עונתיות בינונית ולא מקיף השוואה של מספר ברורים media תרבות חומצי7,8,9,10
התירי את הרגולטורים מפתח ושינויים מטבוליים בתאי סרטן בהקשר של acidification חוץ-תאית, אנחנו הקימה פשוטה in vitro לקשרי תרבות מודל לשמירה על pHe חומצי ובחן את התפקיד של pHe סרטן תאים11. באמצעות שיטה זו, אנו נשמר אמצעי התרבות חומצי עם pHe של 6.8 ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2, באמצעות ריכוז ביקרבונט מופחתת בהמדיום תרבות. pH 7.4 שימש כרגיל ושליטה בינוני. ה-pH בינוני. הנמשכת במשך 24 שעות לפחות, הופחתו בהדרגה 72 h במהלך התרבות תאי סרטן הלבלב PANC-1 ו- AsPC-1. כי גליקוליזה משופרת מאיצה הפרשת לא רק פרוטונים, אלא גם לקטט7,8,9, הקמנו גם שיטה תרבות מחקה חמצת לקטאט-induced על-ידי הוספת חומצת החלב במקום לצמצם ריכוז ביקרבונט. בנוסף, HCl-induced pHe חומצי במדיום מאפשר לנו לשלול את האפשרות כי הסלולר התגובות pH חומצי תרבות בינוני אינם עקב ריכוז מופחתת של ביקרבונט. יתר על כן, באמצעות מדיה שונים עם pH של 6.4-7.4 ריכוז ביקרבונט שונים, שנוכל להעריך את מידת pHe השפעות על תגובות הסלולר.
כאן, אנחנו תיאר מערכת תרבות פשוטה pH חומצי, תהליך ההערכה שלו. השילוב בין שלוש שיטות של acidification בינוני, כלומר, ריכוז ביקרבונט מופחתת, לקטט תוספת תוספת HCl, אפשרו לנו לחקור באופן יסודי את מנגנון ה-pH-תגובה וכדי להשוות את התגובה התאית גידול אחרים תנאים microenvironmental כגון הרעבה היפוקסיה או חומר מזי…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים חברי החטיבה למדע הגנום של מעבדה ביולוגיה מערכתית, רפואה, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו. אנו מודים במיוחד ד ר ה Aburatani ד ר טי קודאמה, (LSBM, RCAST, האוניברסיטה של טוקיו), ד ר ק. Tomizuka, ד ר טי יושידה, ד ר א
Kunisato (Kyowa Hakko קירין ושות’, בע מ) דיונים מועילים ותמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע עבור צעירים מדען (א) (26710005, טי. או), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (26116711 ו-16 H 01567, טי. או), מענק הסיוע עבור אתגר
מחקר גישוש (16K 14605, טי. או) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן, קרן המדע טקדה (טי. או), קרן קוביאשי לחקר הסרטן (טי. או) הפרויקט לחקר הסרטן, האבולוציה טיפולית (P-צור), המחקר המעשי לבקרת סרטן חדשניות של הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED (טי. או).
Reagents | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell lines | |||
PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
TIG | JCRB Cell Bank | ||
MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |