Sure svulst microenvironment spiller avgjørende roller i svulst progresjon. For å vurdere effekten av surt ekstracellulære pH på kreft celler i vitro, etablerte vi enkel surt kultur systemer.
For svulst microenvironment, som hypoksi eller næringsstoffer sult, spiller viktige roller i kreft progresjon og kreft. Men er rollen surt ekstracellulære pH i tumor aggressivitet og dens underliggende mekanismen ikke mye studert sammenlignet med hypoxic eller næringsstoffer sult forhold. I tillegg har en veldefinert kultur metode å etterligne den sure ekstracellulære svulst microenvironment ikke fullt rapportert.
Her presenterer vi en enkel i vitro kultur metode for å opprettholde surt ekstracellulære pH bruker redusert bikarbonat og økt laktat eller HCl konsentrasjoner i kultur medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h etter kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Tre distinkte surt media betingelser i denne studien svært upregulated pH-responsive gener som MSMO1, INSIG1og IDI1 forhold til hypoksi eller næringsstoffer sult. Oppregulering av disse genene kan brukes som en markør for surt pH. Disse enkle teknikker er gunstig å belyse underliggende mekanismene svulst malignitet under Sure svulst microenvironment. Derfor gjør våre ekstracellulære surt pH kultur-systemet oppdagelsen av mobilnettet surt pH svar ikke bare i kreftceller, men også i primære celler, for eksempel nyre rørformede celler, i forhold til de andre syrlig lidelser inkludert, diabetisk ketoacidose, melkesyreacidose, nedsatt tubulær acidose og respiratoriske acidose.
Svulst-microenvironment spiller viktige roller i svulst progresjon og kreft celle metabolisme1,2,3. Kreftceller er ofte utsatt for forhold som hypoksi, Nærings deprivasjon og surt ekstracellulære pH (pHe). Men rollen pHe i svulst progresjon er ikke avklart så mye som hypoksi eller næringsstoff sult. PHe i tumor vev kan bli syreholdig, nå ca pH 6.84,5. Surt pH oppstår fra aerob og anaerob glycolytic utskillelse av protoner (H+) og laktat av voksende kreft celler5,6.
Studier viste at syrlig pHe-indusert histone deacetylation og fettsyrer oksidasjon exocytosis surt lysosomer for tilpasning til alvorlig syreholdig miljø7,8,9,10. Imidlertid påvirker mekanismer gjennom hvilke ekstracellulære forsuring kreft atferd og identiteten til nøkkelen regulatorer i surt pH svulst microenvironment ikke er fullstendig klarert. Videre flere rapporter beskrives ulike surt pH medier bruker uklart konsentrasjoner av bikarbonat, Tris, rør og HEPES buffer eller laktat og HCl, men det er noen rapporter å vise stabiliteten til de mellomstore eller omfattende sammenligning av flere forskjellige surt kultur medier7,8,9,10
For å belyse sentrale regulatorer og metabolske forandringer i kreftceller i sammenheng med ekstracellulære forsuring, vi etablert en enkel i vitro kultur modell for å opprettholde en syrlig pHe og undersøkt rollen pHe i kreft celler11. På denne måten, vi holdt et surt kultur medium med en pHe av 6,8 på 37 ° C under 5% CO2, med redusert bikarbonat konsentrasjoner i kultur medium. pH 7.4 ble brukt som normalt og kontrollere medium. Middels pH var vedvarende minst 24 timer og gradvis redusert med 72 h under kultur av PANC-1 og AsPC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler. Fordi forbedret Glykolysen akselererer utskillelse av ikke bare protoner, men også laktat7,8,9, vi også etablert en kultur metode mimicking laktat-indusert acidose ved å legge til laktat i stedet for å redusere den bikarbonat konsentrasjon. I tillegg tillater HCl-indusert surt pHe i medium oss å utelukke muligheten for at mobilnettet Svar å surt pH kultur medium ikke er grunn til en redusert konsentrasjon av bikarbonat. Videre kan bruker ulike medier med en pH på 6.4 til 7.4 med forskjellige bikarbonat konsentrasjon, vi vurdere omfanget av pHe effekter på mobilnettet svar.
Her beskrev vi en enkel surt pH kultur-systemet og vurdering prosessen. Kombinasjonen av tre metoder for middels forsuring, dvs, redusert bikarbonat konsentrasjon, laktat tillegg og HCl tillegg mulig for oss å undersøke pH-svar-mekanisme grundig og sammenligne cellulær respons på andre svulst microenvironmental forhold som hypoksi eller næringsstoff sult.
Nøkkelen til denne metoden er å finne de riktige konsentrasjonene av bikarbonat, laktat og HCl i kultur medium. Måle middel…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmene av delingen av genomet vitenskap og laboratorium for systemer biologi og medisin, RCAST, The University of Tokyo. Vi spesielt takke Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida og Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin co, Ltd) for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Grant-in-Aid for unge vitenskapsmannen (A) (26710005, to), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (26116711 og 16 H 01567, to), og Grant-in-Aid for utfordrende
Utforskende forskning (16K 14605, to) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, Takeda Science Foundation (to), Kobayashi grunnlaget for kreftforskning (to) og prosjektet for kreftforskning og Terapeutiske evolusjon (P-opprette) og praktisk forskning for nyskapende Cancer Control fra Japan byrå for medisinsk forskning og utvikling, AMED (to).
Reagents | |||
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 | Nissui | 05919 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438 | |
NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
L-glutamine solution | Thermo Fisher | 25030-081 | |
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) | Nacalai | 09367-34 | |
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red | Nacalai | 32778-05 | |
0.5%-Trypan Blue Stain Solution | Nacalai | 29853-34 | |
Lactic acid solution | Sigma-Aldrich | 252476 | |
Hydrochloric acid solution | Sigma-Aldrich | H9892 | |
RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
SuperScript IV First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18091 | |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4368702 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell lines | |||
PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
AsPC-1 | ATCC | CRL-1682 | |
KMS-6 | JCRB Cell Bank | JCRB0432 | |
TIG | JCRB Cell Bank | ||
MRC9 | ATCC | CCL-212 | |
HUVEC | ATCC | CRL-1730 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher | CRL-1682 |