Summary
このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。
Abstract
外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。
Introduction
哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,3の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。
齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック4,5に未熟です。聴覚発症6、7の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の5。
生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。
ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。
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Protocol
動物を対象とする実験のすべてのプロトコルは、南方医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。
1 実験用のソリューションを準備します。
- 麻酔の準備 (材料の表を参照してください): 1.5% ペントバルビ タール ナトリウム溶解 ddH2o.
- 郭清のソリューションを準備 (材料の表を参照してください): Leiboviz の L-15 パウダー 1 M NaOH で ddH2O. 調整 pH 7.3 の 1 L に 1 袋を溶かします。Osmometer および使用する前に 10 mM HEPES を使用して 300 330 mOsm に浸透圧を調整します。
- 2 mg/mL コラゲナーゼ IV を解散 (材料表参照) ステップ 1.2 で郭清溶液で。
- (材料の表を参照してください) 染色ソリューションを準備: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 4% パラホルムアルデヒドを解散。
注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。 - PBS で 0.3% 透水剤を希釈します。ブロック バッファーとして PBS で 10% ヤギ血清を希釈します。ブロック バッファーのプレスチン抗体 1: 200 を希釈します。ブロック バッファーで抗体の Alexa488 共役 1:600 を希釈します。PBS でファロイジン Tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸 1: 200 を希釈します。
- 細胞外の溶液を準備 (材料の表を参照してください): (ステップ 1.2) 上記のように Leiboviz の L-15 媒体を準備します。
- 細胞内の溶液を調製 (材料の表を参照してください)。
2. ABR 記録
注: ABR 記録は、以前私たちの以前の研究9で詳細に記載されています。
- ペントバルビ タール ナトリウム 1.5% (22 mg/kg の子犬および大人、腹腔内の 30 mg/kg、(i. p.)) の単一の注入と SD) ラット (1 14 日古い子犬、生後 2 ヶ月の大人、男女ともに) を麻酔します。
- 動物の体を動けなくポリエチレン発泡金型に麻酔下の動物を配置します。音減衰部屋の防振テーブルに動物を配置します。37.5 ° C 加熱パッドで動物の体の温度を保ちます。
- (巻/巻) 70% エタノールでヘッドの領域を拭いてください。良いはさみを使用して、参照電極または地上に配置する外部の耳介に腹の 1-2 mm の切開を加えます。頭蓋骨の頂点 (図 1 a) 皮下針電極 (電極記録) があります。
- 関数発生器を使用して様々 な周波数のキャリブレーション トーン バースト (1 ms 立上り/立下り、3 ms 高原) を生成する (2、4、8、16、24、および 32 kHz) と強度 (85 から 5 dB ステップで 10 dB SPL に減少した)。周波数と振幅を手動で変更またはコンピューターを使用しています。動物の頭に向かって離れて 10 cm に位置する静電スピーカーから音刺激を提供します。
- (100-1,000 Hz) をフィルター、増幅し、平均 (256 回) サウンド誘発可能性多機能プロセッサを使用して、Abr を取得します。ABR のトレースには、オンラインとオフラインで分析できるストアドが監視されます。1 つの動物から記録 ABR を完了する約 40 分かかります。
注: (波私波 VII) 通常、3 ~ 7 ピーク遅延時間が 15 ms にすることができます未満は (図 1 b) を識別します。ABR 閾値は、I と II が波を検出できる最小の音圧レベルとして定義されます。 - 動物 (0.3 mL 1.5% ナトリウム, ペントバルビ タールの腹腔内投与) と麻酔から覚める前に安楽死させます。
3. コルチ器官 (OC) 郭清
- ラットを麻酔します。ラット未満 6 日古いの (< P6)、100 mm の培養皿で動物を維持し、10 分間氷で包みます。ラット用 > P6、1.5% ナトリウム ペントバルビ タール (22 mg/kg, i. p.) の単回投与で動物を麻酔します。麻酔後ラット仔の首をはねます。
- 頭を 70% (巻/巻) エタノールを噴霧して消毒します。
- ハサミの矢状面の正中線に沿って頭蓋骨を開く脳、内耳を公開するを削除します。
- 3 ml 冷たい L-15 (図 2 a) の 35 mm のペトリ皿に内耳を転送します。
- 解剖顕微鏡の下で微細鉗子を使用して (図 2 b) 蝸牛の硬骨を削除します。
- OC の包みを開けるし、蝸牛軸から耳用 (SV) を関連付けられています。
- 押し鉗子、SV の基底部 OC SV から完全に分離ベース-apex (図 2) からゆっくりとアンワインドしています。
- 高級はさみ (図 2 D) を使って OC を 3 個に均等に切る。
4. 蛍光抗体染色
- 200 μ L ピペット チップを使用して、スライド ガラス上に OC (ステップ 3.8) のセグメントに転送、4 ° C で、少なくとも 4 時間のための 4% のパラホルムアルデヒドの 100 μ L で固定
注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。 - 新鮮な pbs 100 μ L でパラホルムアルデヒドを置き換えたり、組織を洗います。10 分間 3 回ティッシュを洗います。
- 室温で 30 分間 PBS で 0.3% 透過性エージェントと組織を孵化させなさい。
- PBS で透磁率エージェントを破棄し、PBS に組織を 3 回洗います。
- 室温で 1 時間 PBS で 10% ヤギ血清をブロックします。
- 一晩 2 時間室温でまたは 4 ° C で解決を妨げる抗プレスチン C 末端抗体 (レバレッジ) で孵化させなさい。
- 3 回を PBS で 5 分間洗浄します。
- 暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング液で Alexa488 共役二次抗体 (1:600) を孵化させなさい。
- 3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。
- ローダミン ファロイジン (レバレッジ) と暗闇の中で室温で 10 分間インキュベートします。
- 3 回を PBS で暗闇の中で 5 分間洗浄します。
- スライド ガラス (DAPI を含む) メディアをマウントをマウントします。405 を使用して共焦点顕微鏡画像 nm、488 nm、および 594 nm のレーザー。レーザー電力設定 0.1 0.5 mW とスキャンは 0.5 フレーム/秒で高速化します。
5. パッチク ランプ記録の分離
- ピペットの引き手を使用し、パッチを作るに偽造者のマイクロ ピペット先端径 2-3 μ m. 埋戻し細胞内ソリューションとピペット。通常、パッチ ピペットの最初の抵抗は、バス ソリューションの 2.5 から 3.5 の MΩ だった。
- 200 μ L ピペット チップを使用して、35 mm のペトリ皿に (ステップ 3.8) から OC の一部を転送します。100 μ L の酵素消化中で組織を消化 (コラゲナーゼ IV、参照テーブルの材料) 室温で 5 分間。
- L-15 の 100 μ L の酵素消化中を転置します。組織を有毛細胞を分離するマイクロ メスを使用する小さな断片にカットします。
- 穏やかなピペッティング後自家製小型プラスチック製チャンバーにセルを転送 (直径 〜 1.5 cm) 無料の酵素入浴液でいっぱい (〜 1.5 mL材料表を参照してください)。
- 倒立顕微鏡のステージでチャンバーを配置します。健康表示の孤独な内耳を見つけます。
- 700 b アンプのヘッド ステージにパッチ ピペットをロードします。マイクロマニピュレーターによってパッチ ピペットを慎重に移動し、外有毛細胞 (図 3 a) の下部に位置します。
- 細胞は、細胞体の側壁をシールで、OHC をクランプします。細胞膜が破裂するまで光の吸引を適用します。-70 で潜在的な開催を設定 mV。10 〜 17 MΩ 抵抗と膜抵抗セルは 100 〜 500 MΩ、成功した全体セル構成と見なされます。
- コンピューター制御を使用して過分極・脱分極電圧を適用 (250 ms 期間と +94 −140 に至る 13 mV 刻みで mV) 全細胞の流れを引き出すためにセルに。
- 全細胞の流れを増幅、700 b アンプで (角周波数 5 kHz) をフィルターします。1440A コンバーターとオフライン解析のための店でデータを変換します。
- パッチ クランプ ソフトウェアによって制御される 2 つの正弦波電圧刺激プロトコルを使用して内耳の膜の静電容量を測定します。-140 から刺激する電圧範囲を 110 に設定 mV。オフライン分析用のデータを格納します。
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Representative Results
ABR は、麻酔したラットの子犬生後 7 日目より古い (P7) (図 1 a) 純粋なトーン バーストを使用してから誘発されることができます。図 1 bのように、仔と小振幅だけ 3 〜 4 明瞭な波を示したから ABR 波形が得られます。通常は、7 つのピークまで大人動物 (図 1 b) ABR 波形の観察されました。
次免疫染色と電気生理学的測定では、ラット内耳は側頭骨から新鮮な解剖されました。SV と蝸牛軸 (図 2 a-2 C) から OC を分離する組織郭清の連続した手順を示します。OC は、マイクロ剪刀 (図 2 D) と均等に 3枚にカットされました。有毛細胞の形態を表示するには、セグメントは、ファロイジン、プレスチン抗体、DAPI (図 2 e) と染色された.(赤) で髪の束は、内耳の細胞体は (緑) で prestin によって示されたに対し有毛細胞の頂端表面を示しています。核は、Ihc と内耳の下の領域に位置する青に DAPI によってラベルが付けられました。図 2 eのように、P5 で蝸牛の強大のプレスチンは検出されなかった.プレスチンは基底の蝸牛にある内耳の P7 の最初みられました。
穏やかな消化後、内耳は OC (図 3 a) から分離されました。ラット蝸牛から分離された急性内耳から全体セル電圧クランプの録音を行った。現在の全細胞の代表的な例記録 107 に −140 から変更する膜電位応答の分離 P9 OHC から mV は図 3 bに示すように。KCa現在あり、内耳のユニークな応答の存在を示す、- V 曲線の N 形領域に注意してください。膜電位によって駆動される細胞内 Cl-は、非線形膜キャパシタンス (NLC) が全細胞のパッチ ・ クランプの下変化として表示される prestin と組み合わせます。成熟した OHC の典型的な NLC は鐘形の膜電位依存性によって特徴付けられます。NLC は 2 状態のボルツマン関数が装着可能し、内耳の electromotility 機能を反映することができます。容量継ぎ手のボルツマン関数は次のとおりです。
方程式とパラメーターは、私たち以前の紙9で記述されていた。2 つの代表 NLCs は図 3のとおりです。
図 1。聴性脳幹反応記録します。(A) 記録電極が 2 つの耳と頭皮に挿入されました。地面と参照電極はそれぞれ左と右の耳介の下に置かれました。オープン フィールド スピーカーは、ラットの鼻の先端から 10 cm に置かれました。(B) 16 kHz、80 dB SPL トーン バーストに応答の 2 つの代表的な ABR の波形。P8 子犬から上のトレースが記録されます。成体ラットから下のトレースが記録されます。数字は、波形の異なるピークを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。コルチ器官解剖します。(A) P9 ラットの子犬から内耳を解剖しました。蝸牛と前庭の領域が表示されます。蝸牛の構造 (B) は、骨壁を除去した後に公開されました。(C) コルティ (OC) と線条の器官に関する研究 (SV) は、蝸牛軸から分離されました。(D) コルチ器官は、3 個に均等にカットされました。A ~ D のスケール バーを表す 1,000 μ m. (E) 共焦点画像を有毛細胞が蝸牛に沿って別のセグメント (基底, 中, と根尖部) に位置します。ローダミン ファロイジン (赤) は、有毛細胞の頂端表面にある髪束を表します。DAPI (青) は、有毛細胞の中央下部にある核を表します。(緑ラベル) prestin のみ外有毛細胞側壁に発現していた。P7 で中間と基底セグメント、強大で prestin の表現を説明するために緑のチャネルだけが表示されます。スケール バーを表す 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。分離の外有毛細胞の細胞のパッチ ・ クランプ記録します。(A) 分離の外有毛細胞は全体セル モードで封印されました。スケール バーは、10 μ m. (B) A 代表 V 曲線 P9 外有毛細胞から記録を表します。(C) 非線形膜容量 (NLC) 年齢別で 2 つの外有毛細胞から得られます。容量-電圧応答 (白丸) は、(太い線として表示) ボルツマン関数に装着されました。NLC は対応する線形容量 (臨床) に正規化されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
11 日目より若いラット、聴覚野6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症"10として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (図 1)。しかし、ラットから得られた ABR 波形は、大人動物のそれらからのいくつかの異なる機能を示した。ABR 応答は、比較的高いしきい値振幅が小さい。この結果は、開発聴覚システムが音声信号に低感度を持っていることを意味します。仔から記録された ABR 波形の有意差を認めた.通常は、7 つのピークまで大人 ABR 波形9で観察されました。待ち時間が異なるとこれらのピークは、11聴覚経路に沿って別の脳幹核によって生成されます。-IV 波のみでした (図 1 b) 仔から ABR で検知が示唆されました。I および II は、蝸牛と聴神経11から応答を表す波。したがって、結果はより高いレベルの聴覚核が開発中に音響刺激に対する応答に失敗したことを示します。これらのデータは、中央聴覚システムより早くその蝸牛リーチ機能成熟度をお勧めします。ここで述べる方法開発と有毛細胞の蝸牛の機能を調節する分子メカニズムの調査のため重要です。
OC の高品質の解剖は、電気生理学的測定、ウエスタンブロット、免疫染色などの実験に不可欠です。これらの実験は SD ラットと 1 ~ 14 日古い仔を使用して行われています。ラットは、蝸牛の骨は柔らかく、簡単に OC を損なうことがなく鉗子によって削除することができます、細かい解剖に最適ラット、特定の注意がハード硬骨を除去しながら OC を破裂を避けるために必要です。微細鉗子を使用して、OC と関連付けられている SV 蝸牛軸から解除することができます。分離の OC と SV 異なるテクスチャ (図 2) を持っています。仔の OC は 800-1200 μ m の長さの 3 つのセグメントにカットすることができます。冷たい L-15 低下と組織の劣化を最小限に抑えるために可能な限り迅速にすべての手順を実行必要がありますのでご了承ください。
OC の分離されたセグメントは、RNA 解析、ウエスタンブロット、免疫染色のための良い準備です。ここで免疫染色によって OC の感覚毛の細胞の形態を紹介します。核は、それらを持っているに対し、内耳が頂端表面に髪束を持って12基肥にあります。タンパク質モータ prestin は内耳の外側の膜に表現されます。共焦点イメージング データ、プレスチンは最初の P6 P7 で表現、(図 2 e) 次の週上の継続的な増加を示したことを示した。西部のしみが付くことおよび q PCR は、更なる実験で開発 (データは示されていない) 中 prestin のレベルの変更は観察される式を数値化を行った。有毛細胞は OC で少数派であるために、信頼性の高い信号を達成するために単一の実験で 6 に 10 の蝸牛お勧めします。
内耳のパッチ クランプ録音のため、内耳を分離する軽度の酵素消化を行った。有毛細胞が壊れやすいとこの手順では特別な注意が必要です。200 μ L ピペット チップを使用すると、組織や分離細胞を転送します。OC の分離されたセグメントは、コラゲナーゼ溶液の一滴に移管された (~ 100 μ L) 室温で約 5 分のシャーレで。内耳の細胞膜に損傷を与える長い消化時間は避けてください。顕微鏡で健康的な探している, は、パッチク ランプに選ばれました。膨張、収縮の兆候を示す細胞に損傷を与える、または核の転流は次の実験から除外されました。孤独な表示される健康的な強大、Ihc が形態の違いを識別する.強大は Ihc がフラスコ状の堅い首12に対し円筒形と大きい軸径を示しています。内耳の細胞パッチク ランプはこれらのニューロンと他の上皮細胞から、やや困難です。成功した全体セル構成、パッチ ピペットは通常 prestin 粒子 (図 3 a) の高密度を含む上部外側膜から遠ざけ、核近くに位置します。膜が破裂した後、2 つの正弦波電圧刺激プロトコルは、内耳の膜容量を得るためにセルに適用されました。同じ手法で電圧ステップを使用して不可能だ全体セル電流を引き出すために。
このメソッドは、内耳体外9,13の electromotility 機能を調査するための良いツールです。このメソッドは、イオン チャネルの機能だけでなく、内耳と Ihc14における受容体の薬理学的特性を調査するも使えます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、973 プログラム (2014CB943002) と、国家自然科学基金、中国の (11534013、31500841) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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