Summary

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ ステップで説明されています。

Abstract

外の有毛細胞は哺乳類の蝸牛の感覚毛の細胞の 2 つのタイプの 1 つです。彼らは、低レベルの音声信号の弱い振動を増幅する潜在的な受容体とそのセルの長さを変更します。形態と内耳外有毛細胞の電気生理学的特性は、産後の早い年齢で開発します。外有毛細胞の成熟聴覚システムの開発に貢献するかもしれない。しかし、内耳の開発のプロセスはよく研究されていません。これは電気生理学的アプローチによるそれぞれの機能を測定する難しさの一因です。上記の問題を解決する簡単な方法を開発することを目的としてここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛における内耳の機能を勉強する段階的なプロトコルをについて説明します。この方法では、純音刺激の蝸牛神経の反応を評価し、表現レベルと強大でタンパク質モータプレスチンの機能を調べる。このメソッドは、内部の有毛細胞 (Ihc) を調査にも使用できます。

Introduction

哺乳類の聴覚の感覚の蝸牛の有毛細胞の 2 つの異なる機能が欠かせない: mechanoelectric 伝達 (MET) と electromotility1,2。MET チャネル髪束、Ihc (Ihc), 変換音振動膜電位変化と神経らせん神経節細胞の電気信号であります。内耳膜電位とそのセルの長さを変更し、低音の振動を増幅します。Electromotility と呼ばれるこの活動は,3の外側の壁にあるタンパク質モータプレスチンによって派生します。

齧歯動物を含む多くの種で、公聴会の関数は初期産後エポック4,5に未熟です。聴覚発症67の前に聴覚野における音声信号への応答で活動電位が検出されません。形態の開発と蝸牛の機能はラット4,5,8スナネズミ、マウスで広く研究されています。メカノトランスダクションと有毛細胞の electromotility の初期の開発もエポック社の生活の5

生後隔世でラットの聴覚感度を評価するためにラット記録脳幹反応 (ABR) の手法を提案します。全細胞パッチク ランプは、生理、内耳を調査する理想的な技術です。ただし、ニューロンと他の上皮細胞で実行パッチ クランプと比べると、全体携帯シールの低率は分離強大の electromotility の調査を制限しました。

ここで我々 は生後ラット急性解離の蝸牛の形態と生理、内耳を調査する手順をについて説明します。このメソッドは、内部の有毛細胞の開発と機能を制御する分子機構を研究する変更できます。

Protocol

動物を対象とする実験のすべてのプロトコルは、南方医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。 1 実験用のソリューションを準備します。 麻酔の準備 (材料の表を参照してください): 1.5% ペントバルビ タール ナトリウム溶解 ddH2o. 郭清のソリューションを準備 (材料の表を参照してください): Leiboviz の L-15 パウ?…

Representative Results

ABR は、麻酔したラットの子犬生後 7 日目より古い (P7) (図 1 a) 純粋なトーン バーストを使用してから誘発されることができます。図 1 bのように、仔と小振幅だけ 3 〜 4 明瞭な波を示したから ABR 波形が得られます。通常は、7 つのピークまで大人動物 (図 1 b) ABR 波形の観察されました。 <p class="jove_…

Discussion

11 日目より若いラット、聴覚野6,7で音刺激電位が観察できません。したがって、生後 11 日目は、「聴覚発症”10として記述されます。聴覚の発症がよくまだ研究されていない前に聴覚機能の開発。大人の ABR 記録のため同様のメソッドを使用して、Abr が仔 P11 より若いから純粋なトーン バーストによって誘発されることを示す (<stro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、973 プログラム (2014CB943002) と、国家自然科学基金、中国の (11534013、31500841) からの助成金によって支えられました。

Materials

Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
Name Company Catalog Number Comments
Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

References

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Cite This Article
Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

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