Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.
Abstract
Die äußeren Haarzellen ist eines der zwei Arten von sensorischen Haarzellen in der Säugetier-Cochlea. Sie verändern ihre Zelle Länge mit dem Rezeptor potential um die schwache Vibration der Low-Level-akustisches Signal zu verstärken. Die Morphologie und elektrophysiologische Eigentum der äußeren Haarzellen (OHCs) im frühen postnatalen Alter zu entwickeln. Die Reifung der äußeren Haarzellen kann zur Entwicklung des auditorischen Systems. OHCs Entwicklungsprozess ist jedoch nicht gut untersucht. Dies ist zum Teil wegen der Schwierigkeit, ihre Funktion an eine elektrophysiologische Ansatz zu messen. Mit dem Ziel der Entwicklung einer einfachen Methode zur Lösung des obigen Problems, beschreiben wir hier eine Schritt für Schritt Protokoll, um die Funktion des OHCs in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir bewerten die Cochlea-Reaktion auf reinen Ton Reize und untersuchen die Ausdruck Ebene und die Funktion der motorischen Protein Prestin in OHCs. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die inneren Haarzellen (IHC) zu untersuchen.
Introduction
Zwei unterschiedliche Funktionen von Cochlea-sensorischen Haarzellen sind für Säugetiere hören: Mechanoelectric Transduktion (MET) und Electromotility1,2. Durch MET-Kanäle in das Haarbündel, IHC (IHC) und OHCs konvertieren Klangschwingung Membran potenzielle Veränderungen sowie die elektrischen Signale der innervierten Spirale Ganglion Neuronen gelegen. OHCs ihre Zelle Länge mit dem Membranpotential ändern und die Schwingung des Low-Level-Sound zu verstärken. Diese Tätigkeit als Electromotility bezeichnet wird durch den motor Protein Prestin befindet sich in der Seitenwand des OHCs3abgeleitet.
In vielen Arten, einschließlich der Nagetiere ist die Anhörung Funktion unreif in frühen postnatalen Epoche4,5. Kein Aktionspotential in Reaktion auf akustische Signale konnte im auditorischen Kortex vor der mündlichen Verhandlung Anfang6,7nachgewiesen werden. Entwicklung der Morphologie und Funktion der Cochlea ist weit verbreitet in Maus, Rennmaus und Ratte4,5,8untersucht worden. Der mechanotransduktion und Electromotility der Haarzellen entstehen auch in den frühen Leben Epoche5.
Um die Hörfähigkeit Empfindlichkeit von Ratten in verschiedenen Altersstufen postnatale zu bewerten, haben wir eine Methode für auditory Brainstem Response (ABR) Aufnahme in Ratte Welpen entwickelt. Ganze Zelle Patch-Clamp ist eine ideale Technologie um die OHCs Elektrophysiologisch untersuchen. Allerdings begrenzt die niedrige Rate der gesamten Zelle Versiegelung im Vergleich mit der Patch-Clamp in Neuronen und anderen epithelialen Zellen durchgeführt, die Untersuchung der Electromotility der isolierten OHCs.
Hier beschreiben wir ein Verfahren um die OHCs morphologisch und Elektrophysiologisch in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Diese Methode kann geändert werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die inneren Haarzellen Entwicklung und Funktion regulieren.
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Protocol
Alle experimentelle Protokolle mit tierischen Probanden stimmten mit der Tier-Ethik-Kommission der Southern Medical University.
1. bereiten Sie Lösungen für Experimente
- Vorbereiten die Narkose (siehe Tabelle der Materialien): 1,5 % Pentobarbital-Natrium aufgelöst in DdH2O.
- Bereiten Sie die Dissektion-Lösung (siehe Tabelle der Materialien): ein Beutel Leibovizs L-15 Pulver in 1 L des DdH2O. Adjust pH-Wert 7.3 mit 1 M NaOH zu lösen. Passen Sie Osmolarität, 300-330 mOsm mithilfe einer XR und 10 mM HEPES vor Gebrauch an.
- 2 mg/mL Kollagenase IV auflösen (siehe Tabelle der Materialien) in Dissektion Lösung in Schritt 1.2 vorbereitet.
- Bereiten Sie die Immunostaining Lösungen (siehe Tabelle der Materialien): lösen Sie die 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen. - Verdünnen Sie 0,3 % Durchlässigkeit Agent in PBS. Verdünnen Sie die 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer als die blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Prestin Antikörper 1: 200 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Alexa488-konjugierten Antikörper 1:600 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie Phalloidin-Tetramethylrhodamine B erfolgt 1: 200 mit PBS-Puffer.
- Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien): Vorbereiten der Leiboviz L-15 Medium wie beschrieben (Schritt 1.2).
- Bereiten Sie die intrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
(2) ABR Aufnahme
Hinweis: ABR Aufnahme wurde zuvor ausführlich in unseren vorherigen Studie9beschrieben.
- Sprague-Dawley (SD) Ratten (1-14 Tage alten Welpen und 2 - Monate alte Erwachsene beiderlei Geschlechts) mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg für Welpen und 30 mg/kg für Erwachsene, intraperitoneal (i.p.)) zu betäuben.
- Legen Sie das narkotisierten Tier in eine Form von Polyethylen-Schaum, Körper des Tieres zu immobilisieren. Legen Sie das Tier auf eine Anti-Vibrations-Tisch in einem Raum Klang-Dämpfung. Halten Sie das Tier Körpertemperatur bei 37,5 ° C mit einem Heizkissen.
- Wischen Sie den Kopfbereich mit Ethanol 70 % (Vol/Vol). Mithilfe einer feinen Schere machen Sie einen 1-2 mm Einschnitt ventrolateralen zu der externen Pinna, die Referenzelektrode oder Boden zu platzieren. Ein Subdermale Nadelelektrode (Aufnahme Elektrode) befindet sich über den Schädel Scheitelpunkt (Abbildung 1A).
- Der Funktionsgenerator mit kalibrierten Ton platzt (1 ms steigen/fallen, 3 ms Plateau) verschiedener Frequenzen erzeugen (2, 4, 8, 16, 24 und 32 kHz) und Intensitäten (verringerte sich von 85 auf 10 dB SPL in Schritt 5 dB). Variieren Sie die Frequenz und Amplitude manuell oder mit Hilfe eines Computers. Liefern Sie Ton Reize durch eine elektrostatische Lautsprecher 10 cm entfernt in Richtung zum Kopf des Tieres gelegen.
- (100-1.000 Hz) zu filtern, zu verstärken und durchschnittlich (256 mal) den Wirtschaftsteilnehmern Klangpotential mit einem Multi-Funktions-Prozessor, das ABR bekommen. Die ABR-Spuren wird überwacht, Online- und offline-Analyse gespeichert. Es dauert ca. 40 min, um die Aufnahme von einem Tier ABR abzuschließen.
Hinweis: In der Regel drei bis sieben Gipfel (ich Welle auf Welle VII) mit Latenzen identifiziert weniger als 15 ms werden kann (Abbildung 1 b). Die ABR-Schwelle ist definiert als die minimale Lautstärke auf dem Wave I und II nachgewiesen werden konnte. - Bevor die Tiere wach aus der Narkose (mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 mL 1,5 % Natrium Pentobarbital) einschläfern.
(3) das Organ von Corti (OC)-Dissektion
- Ratte Welpen zu betäuben. Für Ratten weniger als 6 Tage alt (< P6), halten Sie das Tier in der Kulturschale 100 mm und bedecken Sie die Schüssel mit Eis für 10 Minuten. Für Ratten > P6, Betäuben Sie das Tier mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Enthaupten Sie die Ratte Welpen nach der Narkose.
- Sterilisieren Sie den Kopf durch Besprühen mit 70 % Ethanol (Vol/Vol).
- Öffnen Sie den Schädel entlang der sagittalen Mittellinie mit einer Schere; Entfernen Sie das Gehirn, die das Innenohr aussetzen.
- Transfer im Innenohr in einer 35-mm-Petrischale gefüllt mit 3 mL eiskaltes L-15 (Abbildung 2A).
- Verwenden Sie unter dem Mikroskop Dissektion feine Zange um die knöchernen Kapsel der Cochlea (Abb. 2 b) zu entfernen.
- Packen Sie das OK und die damit verbundenen Stria Vascularis (SV) aus den Modiolus.
- Durch halten der basale Teil des SV mit der Pinzette, trennen die OC vom SV völlig entspannen langsam von Basis-zu-Spitze (Abbildung 2).
- Schneiden Sie die OC gleichmäßig mit feinen Schere (Abb. 2D) in drei Stücke.
4. Immunfluoreszenz-Färbung
- Mithilfe einer 200 µL PIPETTENSPITZE die Segmente von OC (Schritt 3,8) auf einen Objektträger übertragen und fixieren mit 100 µL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Stunden bei 4 ° C.
Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen. - Waschen Sie das Gewebe durch Verschieben der Paraformaldehyd mit 100 µL frische PBS. Waschen Sie das Gewebe drei Mal für 10 Minuten.
- Inkubieren Sie das Gewebe mit 0,3 % Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
- Den Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer zu verwerfen und das Gewebe dreimal mit PBS waschen.
- Block mit 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie mit Anti-Prestin-C-Terminus Antikörper (1: 200) in blocking-Lösung für 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht.
- Waschen Sie für 5 min dreimal mit PBS.
- Mit Alexa488-konjugierten Sekundärantikörper (1:600) in blockierende Lösung für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.
- 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Rhodamin-Phalloidin (1: 200) inkubieren.
- Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.
- Auf einem Objektträger mit Eindeckmedium (mit DAPI) montieren. Bild mit konfokalen Mikroskopie mit 405 nm, 488 nm und 594 nm Laser. Legen Sie die Laserleistung bei 0,1-0,5 mW und der Scan bei 0,5 Frame/s Geschwindigkeit.
5. Patch Clamp Aufnahme von isolierten OHCs
- Verwenden Sie die Pipette Puller und Mikro-Fälscher zu Patch Pipetten mit einem Tipp-Durchmesser ca. 2-3 µm. Rücken-Füllung der Pipetten mit intrazellulären Lösung. In der Regel wurde der anfängliche Widerstand der Patch Pipette 2,5-3,5 MΩ in Bad-Lösung.
- Übertragen Sie durch die Verwendung einer PIPETTENSPITZE 200 µL ein Stück von der OC (aus Schritt 3,8) in ein 35 mm Petrischale. Das Gewebe mit 100 µL der enzymatischen Verdauung Medium zu verdauen (Kollagenase IV, siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.
- Die enzymatische Verdauung Medium mit 100 µL der L-15 zu verdrängen. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Mikro Skalpell um zu isolieren, die Haarzellen in kleine Stücke.
- Nach der sanften pipettieren, übertragen die Zellen in einer hausgemachten kleinen Kunststoff-Kammer (Durchmesser ~ 1,5 cm) gefüllt mit enzymfreien Bad-Lösung (~ 1,5 mL, siehe Tabelle der Materialien).
- Platzieren Sie die Kammer auf der Bühne von einem inversen Mikroskop. Die gesund erscheinenden einsame OHCs zu finden.
- Laden Sie die Patch-Pipette in den Kopf Bühne eines 700 b-Verstärkers. Bewegen Sie die Patch-Pipette vorsichtig mit einem Mikromanipulator und positionieren Sie es rund um die Unterseite der äußeren Haarzellen (Abb. 3A).
- Ganze Zelle Patch Clamp OHC durch Versiegelung der seitlichen Wand der Zellkörper. Wenden Sie leichte Saugwirkung, bis die Zellmembran gebrochen ist. Festgesetzt im Betrieb möglichen-70 mV. Zellen mit Zugang reichte von 10 bis 17 MΩ und Membran Beständigkeit reichte von 100 bis 500 MΩ und gelten als eine erfolgreiche ganz-Zell Konfiguration.
- Mit Computersteuerung, gelten hyperpolarizing und depolarisierende Spannung (250 ms Dauer und von −140 bis + 94 mV in 13 mV Schritten) in die Zelle ganz-Zell-Ströme zu entlocken.
- Verstärken Sie die gesamte Zelle Ströme zu, Filtern Sie (Ecke Frequenz von 5 kHz) von einem 700 b-Verstärker. Konvertieren Sie die Daten durch eine 1440A-Konverter und ein Geschäft für offline-Analyse.
- Messen Sie die Membran-Kapazität der OHCs mit einem zwei sinusförmige Spannung Stimulus-Protokoll durch eine Patch-Clamp-Software gesteuert. Legen Sie den Spannungsbereich stimulieren von-140 bis 110 mV. Speichern Sie die Daten für die offline-Analyse.
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Representative Results
ABR kann von narkotisierten Ratte Welpen älter als postnatale 7.Tag (P7) mit reinen Ton platzt (Abbildung 1A) hervorgerufen werden. Wie in Abbildung 1 bgezeigt, erhielt die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen zeigte nur drei bis vier unterschiedliche Wellen mit kleiner Amplitude. In der Regel bis zu sieben Gipfel in ABR Wellenformen adulter Tiere (Abbildung 1 b) beobachtet.
Für die folgenden Immunostaining und elektrophysiologische Messung war Ratte Innenohr frisch aus dem Felsenbein seziert. Wir zeigen die aufeinander folgenden Schritte der Gewebe Dissektion, das OK vom SV und den Modiolus (Abbildung 2A–2 C) zu isolieren. Das OK wurde in drei Stücke mit Mikro-Schere (Abb. 2D) gleichmäßig geschnitten. Um die Morphologie der Haarzellen zeigen, wurden die Segmente mit Phalloidin, Prestin Antikörper und DAPI (Abb. 2E) gebeizt. Die Haar-Bundles (in rot) zeigen die apikale Oberfläche der Haarzellen, während die Zellkörper der OHCs von Prestin (in grün) geprägt wurde. Der Kern wurde von DAPI (in blau) befindet sich im Bodenbereich der IHC und OHCs bezeichnet. Wie aus Figur 2Ehervorgeht, wurde keine Prestin OHCs der Cochlea an P5 festgestellt. Prestin wurde erstmals im P7 in OHCs befindet sich in der basalen Cochlea beobachtet.
Nach schonende Verdauung waren die OHCs von OC (Abbildung 3A) isoliert. Ganze Zelle Spannung-Clamp Aufnahmen wurden von OHCs akut von der Ratte Cochlea isoliert durchgeführt. Ein repräsentatives Beispiel für die gesamte Zelle Strom erfasst aus einer isolierten P9 OHC in Reaktion auf Membranpotential verändert von −140, + 107 mV ist in Abbildung 3 bgezeigt. Bitte beachten Sie die N-Form-Region der spannungs-Kurve, auf das Vorhandensein von KCa aktuelle ist eine einzigartige Reaktion des OHCs. Angetrieben durch die Membrane Spannung, die intrazelluläre Cl– kombiniert mit der Prestin erscheinen als eine nicht-lineare Membran-Kapazität (NLC) unter ganze Zelle Patch Clamp-Modus ändert. Die typische NLC Reife OHC zeichnet sich durch glockenförmigen Abhängigkeit vom Membranpotential. Der NLC montiert werden mit einer zwei-Staaten-Boltzmann-Funktion und die Electromotility Funktion des OHCs reflektieren kann. Die Boltzmann-Funktion für Kapazität Fitting wird beschrieben als:
Die Gleichung und die Parameter wurden in unserer bisherigen Papier-9beschrieben. Zwei Vertreter NLCs sind in Abbildung 3dargestellt.
Abbildung 1: Auditory Brainstem Response Aufnahme. (A) die Aufnahme-Elektrode in die Kopfhaut zwischen beiden Ohren eingefügt wurde. Boden und Referenz Elektroden wurden unter der linken und rechten Ohrmuschel. Ein offenes Feld Lautsprecher war 10 cm entfernt von der Nasenspitze der Ratte platziert. (B) zwei Vertreter ABR Wellenformen in Reaktion auf 16 kHz, 80 dB SPL Ton platzt. Oberen Spur aufgezeichnet von P8 Pup. Unteren Spur aufgezeichnet von einem Erwachsenen Ratte. Die Zahlen geben die verschiedenen Gipfeln der Wellenformen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Das Organ von Corti sezieren. (A) das Innenohr seziert von P9 Ratte Pup. Die Cochlea und vestibuläre Region werden angezeigt. (B) die Struktur der Cochlea war nach der Entfernung der knöchernen Wand ausgesetzt. (C) das Organ von Corti (OC) und Stria Vascularis (SV) wurden von den Modiolus isoliert. (D) war das Organ von Corti gleichmäßig in drei Stücke schneiden. Maßstabsbalken in A-D sind 1.000 µm. (E) konfokale Bilder zeigen die Haarzellen in verschiedenen Segmenten (basale, Mitte und apikalen) entlang der Cochlea gelegen. Rhodamin-Phalloidin (rot) repräsentiert die Haare Bündel befindet sich auf der apikalen Oberfläche der Haarzellen. DAPI (blau) repräsentiert die Kernen befindet sich im mittleren-unteren Teil der Haarzellen. Die Prestin (grün gekennzeichnet) äußerte sich nur an der seitlichen Wand der äußeren Haarzellen. Für mittlere und basalen Segmente auf P7 erscheint nur auf der grünen Kanal das illustrieren von Prestin in OHCs. Maßstabsbalken entspricht 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von isolierten äußeren Haarzellen. (A) einer isolierten äußeren Haarzellen wurde im gesamten Zelle Modus besiegelt. Maßstabsleiste stellt 10 µm. (B) A repräsentative-Spannungs-Kennlinie aufgenommen aus einem äußeren Haarzellen P9. (C) die nichtlinearen Membran Kapazität (NLC) aus zwei äußeren Haarzellen in den verschiedenen Altersstufen gewonnen. Die Kapazität-Spannung-Antworten (offene Kreise) wurden an die Boltzmann-Funktion (als die dicken Linien dargestellt) ausgestattet. Der NLC wurden auf die entsprechenden linearen Kapazität (Clin) normiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Bei Ratten jünger als 11. Tag konnte kein Aktionspotential in Reaktion auf klangstimulation im auditorischen Kortex6,7beobachtet werden. Daher bezeichnet man als "Anhörung Ausbruch"10postnatale Tag 11. Die Entwicklung des Gehörs vor Beginn der mündlichen Verhandlung noch nicht gut untersucht wurde. Ähnliche Methode für Erwachsene ABR Aufnahme, wir zeigen, dass ABRs durch reinen Ton Burst Ratte Welpen jünger als P11 ausgelöst werden konnte (Abbildung 1). Jedoch zeigte die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen erhalten einige verschiedenen Funktionen, von denen der Erwachsenen Tiere. Die ABR Antworten sind kleine Amplitude mit relativ hohen Schwellenwerten. Dieses Ergebnis bedeutet, dass die entwickelnde auditorische System geringe Sensibilität für akustische Signale. Signifikanter Unterschied verzeichneten die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen aufgenommen. In der Regel bis zu sieben Gipfel in Erwachsenen ABR Wellenformen9beobachtet. Diese Spitzen mit verschiedenen Latenzzeiten entstehen durch unterschiedliche Hirnstamm Kerne entlang der auditiven Weg11. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass nur die Wellen-IV in ABR von Ratte Welpen (Abbildung 1 b) nachweisbar waren. Die Wellen I und II die Antworten der Cochlea und der Hörnerv11darstellen. Daher zeigen die Ergebnisse, dass die höhere Ebene auditive Kerne nicht reagieren auf akustische Reize während der Entwicklung. Diese Daten schlagen die Cochlea Reichweite funktionalen Reife früher als die zentrale auditorische System tut. Die Methode, die wir hier beschreiben ist wichtig für die Erforschung der molekularen Mechanismen, die Cochlea Entwicklung und Haarzellen Funktion regulieren.
Qualitativ hochwertige Dissektion des OK ist entscheidend für weitere Experimente einschließlich Immunostaining, Western Blot und elektrophysiologische Messungen. Diese Experimente wurden durchgeführt mit Erwachsenen SD-Ratten und Ratte Welpen zwischen 1 und 14 Tage alt. Ratte-Welpen sind ideal für feine Dissektion, da die Cochlea-Knochen weich ist und leicht werden durch Zange entfernt kann ohne Beschädigung der OC. Für Erwachsenen Ratten ist besonderer Vorsicht erforderlich, um zu vermeiden, Bersten die OC beim Entfernen der harten knöchernen Kapsel. Mithilfe von feinen Pinzette kann OC und damit verbundenen SV aus den Modiolus abgehoben werden. Die getrennten OC und SV haben verschiedenen Textur (Abbildung 2). Für Ratte Welpen könnte die OC in drei Segmente mit einer Länge von 800-1200 µm geschnitten werden. Bitte beachten Sie, dass alle Schritte ausgeführt werden sollte, in eiskalten L-15 so schnell wie möglich um Abbau und Gewebe Verschlechterung zu minimieren.
Isolierte Segmente des OK sind gute Vorbereitungen für Immunostaining, Western Blot und RNA Analyse. Hier zeigen wir die Morphologie von sensorischen Haarzellen in OC von Immunostaining. OHCs Bündel Haare auf ihrer apikale Oberfläche haben, während der Kern sie hat liegt basal12. Der motor Protein Prestin wird auf der seitlichen Membran OHCs ausgedrückt. Die konfokalen Bilddaten darauf hingewiesen, dass die Prestin war zuerst am P6-P7 ausgedrückt und einen anhaltenden Anstieg im Laufe der folgenden Woche (Abbildung 2E zeigte). In weiteren Experimenten wurden westliche Beflecken und Q-PCR durchgeführt, um die beobachteten Ausdruck Pegeländerungen von Prestin während der Entwicklung (Daten nicht gezeigt) zu quantifizieren. Da die Haarzellen die Minderheit in der OC sind, 6 bis 10 Cochleae in einem einzigen Experiment sollten robuste Signale zu erreichen.
Für Patch-Clamp-Aufnahmen von OHCs wurde milde enzymatische Verdauung durchgeführt, um die OHCs zu trennen. Die Haarzellen sind zerbrechlich, und besondere Vorsicht ist geboten bei diesem Schritt. Verwenden Sie eine 200 µL PIPETTENSPITZE, um das Gewebe und die abgetrennten Zellen übertragen. Die isolierten Gruppe von OC wurde zu einem Rückgang der Kollagenase-Lösung versetzt (~ 100 µL) in einer Petrischale für ca. 5 min bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie lange Verdauung Mal, die wodurch die Zellmembran der OHCs beschädigt werden. Unter dem Mikroskop waren gesund aussehende OHCs für Patch Clamp Aufnahme ausgewählt. Anzeichen von Schrumpfung, Quellung, Zellen schädigen oder Translokation des Kerns von nächstes Experiment ausgeschlossen waren. Gesund erscheinenden einsame OHCs und IHC sind leicht zu erkennen durch ihre morphologischen Unterschied. OHCs zeigen eine zylindrische Form und eine größere Achse-Durchmesser-Verhältnis während IHC Kolben mit einem engen Hals12ausgebildet sind. Ganze Zelle Patch Clamp in OHCs ist etwas schwierig, von denen in Neuronen und anderen Epithelzellen. Für erfolgreiche ganz-Zell Konfiguration befand sich die Patch-Pipette in der Regel in der Nähe des Kerns, die oberen seitlichen Membran mit einer hohen Dichte von Prestin Partikel (Abbildung 3A) ferngehalten. Nachdem die Membran gerissen wurde, war ein zwei sinusförmige Spannung Stimulus-Protokoll auf die Zelle angewendet, um die Membran-Kapazität der OHCs zu erhalten. Mit der gleichen Technik ist mit Spannung Schritten es möglich, ganze Zelle Strom zu entlocken.
Diese Methode ist ein gutes Werkzeug, um die Electromotility-Funktion von OHCs in-vitro-9,13zu untersuchen. Diese Methode könnte auch verwendet werden, um die Funktion von Ionenkanälen sowie die pharmakologischen Eigenschaften von Rezeptoren im OHCs und IHC14zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 973 Programm (2014CB943002) und die National Natural Science Foundation of China (11534013, 31500841) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
