Summary

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

Abstract

Dış saç hücre duyu saç hücreleri memeli koklea içinde iki tür biridir. Onlar kendi cep uzunluğu reseptör alt düzey ses sinyalinin zayıf titreşim yükseltmek için potansiyel ile değiştirin. Morfoloji ve dış saç hücrelerinin (OHCs) elektrofizyolojik özelliği erken postnatal yaşlarda geliştirmek. Dış saç hücre olgunlaşma işitme sisteminin gelişimine katkıda bulunabilir. Ancak, OHCs geliştirme sürecinin de incelenmiştir değil. Bunun nedeni kısmen zorluk işlevlerine elektrofizyolojik bir yaklaşım tarafından ölçmek için olmasıdır. Yukarıdaki sorunu gidermek için basit bir yöntem geliştirmek amacı ile burada biz OHCs işlevinde akut Disosiye koklea postnatal fareler üzerinden çalışmak için adım adım bir protokol tanımlamak. Bu yöntemle, saf ton uyaranlara koklear yanıtı değerlendirmek ve ifade düzey ve OHCs motor protein prestin işlevini inceleyin. Bu yöntem aynı zamanda iç saç hücreleri (IHCs) araştırmak için kullanılabilir.

Introduction

Koklear duyu saç hücreleri iki farklı işlevi memeli işitme için önemlidir: mechanoelectric iletim (MET) ve electromotility1,2. Saç demeti, IHCs (IHCs) ve OHCs dönüştürmek ses titreşim membran olası değişiklikleri içine yanı sıra içinde elektrik sinyallerini innervated sarmal ganglion nöronların bulunan MET kanalları tarafından. OHCs onların hücre membran potansiyeli ile değiştirmek ve düşük seviyeli Ses titreşimi yükseltmek. Electromotility olarak adlandırdığı bu faaliyet OHCs3lateral duvarında bulunan motor protein prestin tarafından türetilmiştir.

Kemirgenler de dahil olmak üzere birçok tür, işitme fonksiyonu erken postnatal dönem4,5‘ te olgunlaşmamış. Hiç aksiyon potansiyeli seda cevaben önce işitme başlangıçlı6,7işitsel korteks tespit edilemedi. Morfoloji gelişimi ve koklea fonksiyonu, yaygın olarak fare, fare ve sıçan4,5,8çalışılmıştır. Mechanotransduction ve electromotility saç hücrelerinin de erken gelişmiştir hayat dönemi5.

Fareler işitme duyarlılığını farklı postnatal yaş değerlendirmek için fare pups içinde kayıt İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi (ABR) için bir yöntem geliştirdi. Bütün hücre yama kelepçe OHCs electrophysiologically araştırmak için ideal bir teknolojidir. Ancak, sinir hücreleri ve diğer epitelyal hücreler yıllarındaki yama kelepçe ile karşılaştırıldığında, tüm hücreli sızdırmazlık oranı düşük izole OHCs electromotility incelenmesi sınırlı.

Burada OHCs morfolojik ve electrophysiologically Doğum sonrası fareler gelen akut Disosiye koklea içinde araştırmak için bir yordam açıklanmaktadır. Bu yöntem iç saç hücre gelişimi ve işlev düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için değiştirilebilir.

Protocol

Hayvan konular içeren tüm deneysel protokoller Güney Tıp Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. deney için çözümleri hazırlayın Anestezi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): % 1.5 Fentobarbital sodyum çözünmüş GKD2′ O. Diseksiyon çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): bir GKD2O. ayarlama pH 7,3 için 1 L 1 M NaOH ile Leiboviz’ın L-15 toz torba geçiyoruz. OSMOLAR?…

Representative Results

ABR saf ton patlamaları (Şekil 1A) kullanarak imzalat fare pups postnatal gün 7 büyük (P7) elde edildi. Şekil 1B, sadece üç-dört ayrı dalgalar küçük genlik ile gösterdi fare pups elde edilen ABR dalga biçimleri gösterildiği gibi. Genellikle, en fazla yedi tepeler Yetişkin hayvanlar (Şekil 1B) ABR dalga biçimleri gözlendi. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

Rat 11 gün genç, yanıt olarak ses stimülasyon yok Aksiyon potansiyeli işitsel korteks6,7‘ gözlenen. Bu nedenle, postnatal gün 11 “işitme başlangıçlı”10tanımlanır. İşitme başlangıçlı henüz de incelenmiştir değil önce işitme fonksiyonu geliştirilmesi. Benzer yöntem yetişkin ABR kaydı için kullanarak, biz saf ton veri bloğu fare pups P11 genç dan tarafından ABR’ler elde edildi göstermek (

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser hibe 973 programı (2014CB943002) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (11534013, 31500841) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
Name Company Catalog Number Comments
Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

References

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

View Video