Summary

Ответ слуховой ствола мозга и внешние клетки волос поклеточного патч зажим запись в послеродовой крыс

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

Этот протокол описывает методы для записи слуховой мозга ответ от послеродового крыса щенков. Для изучения функционального развития внешних волосковых клеток, экспериментальная процедура поклеточного фиксации записи в изолированные внешние клетки волос описан шаг за шагом.

Abstract

Внешние клетки волос является одним из двух типов Сензорные клетки волос в млекопитающих улитки. Они изменяют их длина ячейки с рецепторами потенциал, чтобы усилить слабые вибрации низкого уровня звукового сигнала. Морфология и электрофизиологические свойства внешних волосковых клеток (OHCs) развиваться в начале послеродового возраста. Созревание внешние клетки волос может способствовать развитию слуховой системы. Однако процесс развития OHCs не хорошо изучены. Это отчасти трудно измерить их функции электрофизиологических подход. С целью разработки простой способ решить эту проблему, здесь мы опишем пошаговое протокол для изучения функции OHCs в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. С помощью этого метода мы можем оценить улитковый ответ на стимулы чистый тон и изучить уровень выражения и функции Престин мотор белка в OHCs. Этот метод может также использоваться для изучения внутренние волосковые клетки (дивидедов).

Introduction

Две различные функции улитковый Сензорные клетки волос крайне важны для млекопитающих слуха: mechanoelectric трансдукции (мет) и electromotility1,2. По каналам MET расположен в пучок волосы, дивидедов (дивидедов) и OHCs конвертировать звуковые вибрации мембраны потенциальных изменений, а также электрические сигналы нейронов ганглия иннервируемые спираль. OHCs изменить длину их клетки с мембранного потенциала и усилить вибрации низкого уровня звука. Это действие называется electromotility является производным от Престин двигательные белки, расположенные в боковой стенке OHCs3.

У многих видов, включая грызунов функция слуха незрелых в раннем постнатальном эпохи4,5. Не потенциал действия в ответ на звуковые сигналы могут быть обнаружены в аудиальном кортексе до6,начала слушания7. Разработка морфологии и функция улитки широко изучена в мышь и песчанки, крыса4,5,8. Mechanotransduction и electromotility клетки волос также разработал в начале жизни эпохи5.

Для того чтобы оценить чувствительность слуха крыс на послеродовой разных возрастов, мы разработали метод для слухового мозга ответ (ABR) запись в крыса щенков. Поклеточного фиксации это идеальная технология для расследования OHCs electrophysiologically. Однако по сравнению с фиксации в нейроны и другие клетки эпителия, низкий уровень уплотнения поклеточного ограниченное расследование electromotility изолированных OHCs.

Здесь мы описываем процедуры для расследования OHCs морфологически и electrophysiologically в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. Этот метод может быть изменен для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют развитие внутренней волосы клеток и функции.

Protocol

Все экспериментальные протоколы с участием животных темы были утверждены Комитетом Этика животных Южной медицинского университета. 1. подготовить решения для экспериментов Подготовьте анестетиков (см. Таблицу материалы): 1.5% Пентобарбитал натрия растворя…

Representative Results

ABR можно собрать из наркотизированных крыс щенков старше послеродовой день 7 (P7) с использованием очередей чистый тон (Рисунок 1A). Как показано на рисунке 1B, ABR сигналов, полученных от крыс щенков, показали только три или четыре различных в…

Discussion

В крыс моложе 11 день без потенциал действия в ответ на звуковой стимуляции можно наблюдать в аудиальном кортексе6,7. Таким образом послеродовой день 11 описывается как «слуха onset»10. Развитие слуха функции до начала слушания не было хорошо изуч?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантов из 973 программы (2014CB943002) и Национальный фонд Китая естественных наук (11534013, 31500841).

Materials

Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
Name Company Catalog Number Comments
Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

References

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

View Video