Summary

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Abstract

A célula externa do cabelo é um dos dois tipos de células sensoriais ciliadas da cóclea mamíferos. Eles alteram seu comprimento de células com o receptor do potencial para amplificar a vibração fraca do sinal de som de baixo nível. A morfologia e a propriedade eletrofisiológica de células ciliadas exteriores (OHCs) desenvolvem na idade pós-natal. A maturação da célula exterior de cabelo pode contribuir para o desenvolvimento do sistema auditivo. No entanto, o processo de desenvolvimento de OHCs não é bem estudado. Isto é parcialmente devido à dificuldade de medir sua função por uma abordagem eletrofisiológica. Com o objetivo de desenvolver um método simples para resolver o problema acima, aqui descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a função do OHCs na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Com este método, podemos avaliar a resposta coclear aos estímulos de Tom puro e examinar o nível de expressão e a função da proteína motor prestin em OHCs. Esse método também pode ser usado para investigar as células ciliadas interiores (IHCs).

Introduction

Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs3.

Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida5.

A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.

Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.

Protocol

Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul. 1. prepare soluções para experimentos Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH2O. Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ2O. ajuste de pH par…

Representative Results

ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B). <p class="jove_content" fo:ke…

Discussion

Em ratos mais jovens do que de dia 11, sem potencial de ação em resposta à estimulação sonora pode ser observada no córtex auditivo6,7. Portanto, dia pós-natal 11 é descrito como “início de audiência”10. O desenvolvimento da função auditiva antes de início da audiência não foi bem estudado ainda. Usando o método semelhante para a gravação de ABR adulta, demonstramos que ABRs poderiam ser provocados pela explosão de Tom p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa 973 (2014CB943002) e o Nacional Natural Science Foundation da China (11534013, 31500841).

Materials

Anesthetic
Pentobarbital sodium Sigma P3761 1.5% in water
Name Company Catalog Number Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
Collagenase IV Sigma C5138 2 mg/mL in L-15
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Immunostaining solutions
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 PH 7.3
Paraformaldehyde Sigma 158127 4% in PBS
Triton X-100 Amresco ZS-0694 0.3% in PBS
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% in PBS
prestin antibody Santa Cruz SC-22694 dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody Thermo Fisher Scientific A-11055 dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma P1951 dil 1:200
DAPI Solarbio C0060 dil 1:20
Name Company Catalog Number Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium Life Technologies 41300-039 1 pack in 1 L water
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
CsCl Sigma 7647-17-8 140 mM
MgCl2 Sigma 7791-18-6 2 mM
EGTA Sigma 67-42-5 10 mM
HEPES Sigma 7365-45-9 10 mM
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Osmometer Gonotec OSMOMAT 3000 basic
Forcep WPI 14095 Tweezers dumont
Micropipette puller Sutter Instrument MODLE-P97
Micro Forge Narishigen MF-830
Mini Operating System Sutter Instrument MP-285
MultiClamp Axon 700B
Low-Noise Data Acquisition System Axon 1440A
ES1 speaker Tucker-Davis Technologies
TDT system 3 Tucker-Davis Technologies
Name Company Catalog Number Comments
Software
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software Tucker-Davis Technologies
jClamp Scientific Solutions
Name Company Catalog Number Comments
Animal
SD rat Experimental Animal Center of Southern Medical University

References

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
  7. De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

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Cite This Article
Chang, A., Li, C., Huang, J., Pan, W., Tian, Y., Tang, J. Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats. J. Vis. Exp. (135), e56678, doi:10.3791/56678 (2018).

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