Denne protokollen beskriver metoder for å registrere auditiv hjernestammen svaret fra postnatal rotte unger. For å undersøke funksjonelle utviklingen av ytre hårcellene, er eksperimentelle prosedyren for hele celle oppdateringen klemme i isolert ytre hårcellene beskrevet trinn for trinn.
Ytre hår cellen er en av de to typene sensoriske hårcellene i sneglehuset pattedyr. De endre sin celle lengde med reseptoren potensial til å forsterke den svake vibrasjonen av lavnivå lydsignalet. Morfologi og elektrofysiologiske eiendom ytre hårcellene (OHCs) utvikle i tidlige postnatal tider. Modningen av ytre hår cellen kan bidra til utviklingen av hørselen. Men er prosessen med OHCs utvikling ikke godt studert. Dette er delvis på grunn av vanskeligheter for å måle deres funksjon av elektrofysiologiske tilnærming. Å utvikle en enkel metode for problemet over, beskriver her vi en trinnvis protokoll for å studere funksjonen i OHCs i akutt dissosiert sneglehuset fra postnatal rotter. Med denne metoden kan vi evaluere cochlea responsen på ren tone stimuli og undersøke uttrykk nivå og funksjon av motoren proteiner prestin i OHCs. Denne metoden kan også brukes til å undersøke indre hårcellene (IHCs).
To forskjellige funksjoner av cochlea sensoriske hårcellene er avgjørende for pattedyr høring: mechanoelectric signaltransduksjon (MET) og electromotility1,2. MET kanaler i håret bunt, IHCs (IHCs) og OHCs konvertere lyd vibrasjoner på membran mulige endringer, samt de elektriske signalene innervated spiral ganglion neurons. OHCs endre cellen lengden med membran potensial og forsterke vibrasjoner i lavnivå lyd. Denne aktiviteten kalt electromotility er avledet av motor protein prestin ligger i den laterale veggen OHCs3.
I mange arter inkludert gnagere er høring funksjonen umodne i tidlig postnatal epoken4,5. Ingen handling potensial svar lydsignaler ble oppdaget i auditiv cortex før høringen utbruddet6,7. Utvikling av morfologi og funksjon av sneglehuset har vært mye studert i mus, gerbil og rotten4,5,8. Den mechanotransduction og electromotility av hårcellene er også utviklet tidlig liv epoke5.
For å vurdere hørselen følsomheten på rotter på ulike postnatal aldre, har vi utviklet en metode for auditory hjernestammen svar (ABR) i rotte unger. Hele celle oppdateringen klemme er en ideell teknologi å undersøke OHCs electrophysiologically. Men begrenset sammenlignet med oppdateringen klemmen i neurons og andre epitelceller, lav sats av hele celle etterforskningen av electromotility av isolerte OHCs.
Her beskriver vi en prosedyre for å undersøke OHCs morphologically og electrophysiologically i akutt dissosiert sneglehuset fra postnatal rotter. Denne metoden kan endres for å studere molekylære mekanismer som regulerer indre håret celle utvikling og funksjon.
I rotter yngre enn dag 11, kan ingen handling potensial svar på lyd stimulering være observert i auditiv cortex6,7. Derfor er postnatal dag 11 beskrevet som “høring utbruddet”10. Utviklingen av hørselen funksjonen før høringen utbruddet ikke var godt studert ennå. Bruke lignende metoden for voksen ABR opptak, viser vi at ABRs kan bli brakt frem av ren tone serieopptak fra rotte unger yngre enn P11 (figur 1</stro…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra 973 programmet (2014CB943002) og National Natural Science Foundation av Kina (11534013, 31500841).
Anesthetic | |||
Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection solution | |||
Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunostaining solutions | |||
PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Extracellular solution | |||
Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Intracellular solution | |||
CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
MultiClamp | Axon | 700B | |
Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
jClamp | Scientific Solutions | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animal | |||
SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |