Summary
Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonlar ve hücre içi taşıma çalışma için iyi bir modeldir. Burada, vivo içinde kayıt ve analiz C. elegansaksonlar ve intraflagellar taşıma için bir protokol açıklayın.
Abstract
Aksonal taşıma ve intraflagellar taşıma (LFT) akson ve kirpikler morfogenez ve işlevi için gerekli olan. Kinesin süper proteinler ve dinein anterograd ve retrograd taşıma, sırasıyla düzenleyen moleküler motorlar vardır. Bu motorlar Mikrotubul ağları raylar kullanır. Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT vivo içindeçalışmaya bir güçlü model organizmadır. Burada, aksonal transport ve LFT yaşam gözlemlemek için bir protokol tarif C. elegans. Taşınan kargo kargo protein flüoresan proteinler yeşil flüoresan protein (GFP) gibi kullanarak etiketleyerek görüntülenmeyecektir. C. elegans şeffaf ve kargo GFP öğesini proteinler hücre özel Organizatör altında belirli hücrelerdeki ifade edilebilir. Yaşayan solucanlar lastikteki % 10 özel jel üzerinde öldürmek veya solucanlar anesthetizing tekrarlanmasıyla çözülebilir. Bu koşullar altında kargo hareket doğrudan akson ve yaşam kirpikler gözlenen C. elegans diseksiyon olmadan. Bu yöntem hedef proteinler değiştirerek herhangi bir hücre ve/veya onlar ifade edilir hücreleri herhangi bir kargo molekül gözlenmesi için uygulanabilir. Moleküler motorlar gibi en temel proteinler ve aksonal transport ve LFT katılmaktadırlar adaptör protein C. elegansiçinde korunmuş. Diğer model organizmalar için karşılaştırıldığında, mutantlar elde edilen ve daha kolay C. elegansiçinde saklanır. Bu yöntem çeşitli C. elegans mutantlarla birleştirerek aksonal transport ve LFT moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturmak.
Introduction
Canlı hücre görüntüleme hücre içi taşıma analiz etmek için önemli bir araçtır. Nöronal hücre Biyolojide canlı hücre görüntüleme ile aksonal taşıma nöronal fonksiyon ve morfogenetik1anlamak için gerekli analizlerdir. Aksonal transport kusurları birkaç nörodejeneratif hastalıklar2altında yatan. Sırasıyla kinesin süper proteinler ve dinein aksonal transport anterogradely ve retrogradely,1,2taşır.
Kirpikler Mikrotubul ağ ve kaçakçılığı makine gelişmiş3olan başka bir hücresel yuvası vardır. Protein sentezi makine kirpikler, silier proteinler kirpikler ipuçları sitoplazma gönderilmesi gerekir yani yerelleştirilmemiştir. Kirpikler özel kinesin ve dinein, aradım kinesin-2 ve sitoplazmik dinein-2, sırasıyla, kirpikler4, intraflagellar taşıma (LFT)5denilen bir fenomen bileşenleri taşıma. LFT bozukluğu hastalıkları ciliopathies6adı verilen bir spektrum neden olur. Böylece, LFT mekanizması tarafından canlı hücre görüntüleme analizi silier oluşumu ve patogenezinde temel mekanizmaları anlamak için gereklidir.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) aksonal transport ve LFT7,8,9eğitim için iyi bir modeldir. LFT gözlemlemek için Chlamydomonas yaygın olarak bir model organizma5,6kullanılmıştır. Chlamydomonas tek hücreli bir organizma olduğu için LFT ilişki ile yaşlanma, nöronal fonksiyon ve davranış analiz etmek zor olacaktır. Buna ek olarak, CRISPR/Cas9 gibi temel genetik teknikleri Chlamydomonasiçin uygulanmadı. Çünkü aksonal transport ve LFT morfogenez ve homeostasis hayvanlar 10için gerekli olan fare ve Drosophila, gibi daha yüksek model organizmalar bozulma aksonal transport ve LFT kez ölümcül fenotipleri neden olur, 11. Fare olması durumunda, hücre kültürü ve transfection genellikle aksonal transport ve birçok beceri ve geniş zaman12,13gerektirir LFT gözlemlemek için gereklidir. Buna ek olarak, önemli fizyolojik bağlam çok kültürlü hücreleri ve hücre satırlarını kaybetmiş. Sinir sisteminin solucanların yaşam için gerekli olduğundan, C. elegans mutantlar hangi aksonal taşıma veya LFT kesintiye öldürücü7,9,14değil çoğu zaman. Doğrudan aksonal transport ve LFT vivo içinde diseksiyon olmadan C. elegans saydamdır ve bu nedenle GFP etiketli işaretleri gözlemlemek kolaydır çünkü görülebilmektedir.
C. elegans, anestezi16veya lastikteki17bir mikrosıvısal aygıt15, özel kablolar kullanarak gibi hareketsiz için çeşitli protokoller vardır. Anestezi eklenmesi nöronlar15kaçakçılığı olayları inhibe. Mikrosıvısal-aygıt yöntemin açık bir dezavantajı bir mikrosıvısal aygıt hazırlanıyor her zaman kolay değildir. Bunun yerine, özel yastıkları ve lastikteki immobilizasyon zaman atlamalı görüntüleme C. elegansiçinde gerçekleştirmek için rahat ve kolay bir yöntem var. Burada, C. elegans hareketsiz ve aksonal transport ve LFT in vivo olarak görselleştirmek için bu temel iletişim kurallarını açıklamak C. elegans. Diğer yöntemlerine göre burada açıklanan yöntemi özel ekipman gerektirmez ve çok daha ucuz ve daha kolay gerçekleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. numune hazırlama
- Generate transgenik C. elegans zorlanma transgenik metodolojisi 18 kullanarak ilgi. Alternatif olarak, uygun suşların Caenorhabditis genetik Merkezi (CGC) dan elde edilir. Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşımacılığının görselleştirmek için transgenik çizgi wyIs251 kullanın [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. LFT gözlemlemek için transgenik çizgi mnIs17 [osm-6::gfp] 19 edinin. Bu protokol için bu suşlar kullanılır.
Not: Ya extrachromosomal dizi, genomik entegrasyonu veya bile GFP çakma çalışır. Arka plan sinyalleri azaltmak için pan-nöronal rehberleri yerine hücre özel Organizatör kullanın.
Not: Bakım Worms diğer protokolleri 20 dakika içinde açıklanmıştır. Suşları tutulan Escherischia coli OP50 besleyici nematodunun büyüme üzerinde çimenler üzerinde orta (NGM) levhalar (%1,7 (w/v) özel, 50 mM NaCl, %0.25 (w/v) pepton, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL kolesterol, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 60 mm çap plastik yemekleri) 20 ° C. - Grow solucanlar 20 ° C'de NGM Tabaklarda solucanlar herhangi bir yaşam döngüsü aşaması için.
Not: Bir aksonal transport ve LFT herhangi bir aşamada gözlemleyebilirsiniz. Genç Yetişkin geç L4 çünkü iyi bir pozitif kontrol birden çok yayın-si olmak kullanılmış bu aşamaları ve görüntülenmeyecektir kaçakçılığı olayları 14 , 21 , 22 , 23.
2. % 10 hazırlanması özel
Not: pek çok satıcı agar agar tozlar ve özel gibi benzer ürünler sağlar. Elektroforez sınıf özel kullanın (jel gücü > 1200 g/cm 2). Ucuz agar tozlar işe yaramaz çünkü elde edilen jel solucanlar hareketsiz yeterince güçlü değil.
- Mix 0.4 g özel 4 mL distile su (DW) bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm). Buharlaşma önlemek için cam tüp üzerinde bir kapak koyun.
- 90 dk için 95 ° C ısı bloğu cam tüp yerleştirilir. Buna ek olarak, DW ile dolu başka bir cam tüp (1.5 cm x 10,5 cm) hazırlamak ve 95 tutmak ° C. koymak Pasteur damlalıklı 95 ° C'de DW ( şekil 1 A). Bir sürü küçük kabarcıklar özel tüp içinde görülecektir ve çözüm bulanık olmalıdır. Çözüm açık hale gelinceye kadar bırakın. Sonra karıştırmak özel çözüm homojen hale gelinceye kadar yukarı ve aşağı tarafından pipetting.
Not: Mikrodalga fırın DW ve özel yapılmış zaman % 10 özel çözüm hazırlamak için kullanılamaz. Küçük kabarcıklar mikrodalga tarafından neden olduğu özel erime önlemek. Ancak, katılaşmış % 10 özel jel kolayca kullanarak yeniden bir mikrodalga erimiş olabilir. Cam tüpler % 10 özel jel içeren önceden hazırlanan ve 4 ° C'de en az 6 ay süreyle depolanır. Böylece, gerektiğinde bir mikrodalga kullanarak stok eritmek ve bu iletişim kuralı 3 adımda başlayabilirsiniz.
Not: Özel yavaş yavaş uzun bir süre veya sonra tekrarlanan katılaşma ve erime 95 ° C'de inkübe Eğer kuvvetlendirmek için yetenek kaybeder. Bu durumda, yeni % 10 özel hazırlayın.
3. Hazırlık özel ped
- Adım 2.2, hazırlanan ısıtılan Pasteur damlalıklı kullanarak 76 x 22 mm slayt üzerinde 2 damla % 10 özel yerleştirin.
- Hızlı bir şekilde Resim 1 B ve itme aşağı ikinci slaytta özel çözüm düzleştirmek için gösterildiği gibi kapak özel damla önce ikinci 76 x 22 mm 2 kaydıraklı katılaşır. Kalınlığı 0,5-1 olmalıdır mm. Özel çözüm yıkanır kadar
- hızlı bir şekilde Pasteur pipet pipetting 95 ° C DW tarafından yukarı ve aşağı yıkayın. Aksi takdirde, damlalıklı tarafından özel jel haline tıkanmış. Pipet ayakta 95 ° C'de DW bırakın.
- 1 dk bekle. Özel defteri oluşturur ve bulutlu olur. Sonra el ile ( şekil 1 C) ayrı slaytları slayt.
4. Kurtlardan montaj
Not: solucan hareketi bile az miktarda önlemek iyi gözlem. Levamisole solucan hareket özel yastık 24 , 25 önlemek için geleneksel olarak kullanılmıştır. Ancak, Levamisole C. elegans nöronal reseptörleri inhibe ve bu nedenle nöronlar 15 kaçakçılığı olayları etkileyebilir. Polistren lastikteki kullanarak açıklanan burada iyi bir alternatif 17.
- ~ 30 transgenik solucanlar yeni NGM için uygun veri işaretleyicilerini ifade plaka Platin tel kullanarak bakteri almak olmadan bir sürgülü ayna transillumination ile donatılmış bir stereo mikroskop altında transfer.
Not: Platin tel ve Pasteur pipet (5 inç) bir platin tel çekme yapılmış ve platin tel ucu dümdüz. Platin tel alır hazırlanması ve bunlar solucanlarla kullanımı Wormbook (http://www.wormbook.org) açıklanmıştır. - Plaka terk solucanlar NGM özel jel bakteri olmadan hareket olarak 1 dk. için bakteri otomatik olarak solucanlar yüzeyler arasında kaldırılır.
- Yerine 0,5-1,0 a µL % 2,6 100 nm çapında polistren lastikteki agar pad ( şekil 1 D) üzerine su içinde damla. 10-20 solucanlar bakteri-özgür NGM plaka için lastikteki aktarın. Damla ve platin tel kullanarak solucanlar almak, örtüşen önlemek için forma solucan organları ( şekil 1 E).
- 22 x 40 mm 2 coverslip ( şekil 1 F) uygulanır. Hava kabarcıkları kaldırmak, ancak ezici solucanları önlemek için yavaşça itin. Örnek görüntüleme için hazırdır.
Not: anestezi yönetilen çünkü solucanlar sadece agar pad, polistren lastikteki ve coverslip 17 tarafından üretilen sürtünme Kuvvetleri tarafından sabitlenir. Besleyici bakteri ve/veya çok fazla çözüm varlığı sürtünme kuvveti zayıf yapacak.
Not: Coverslips (örneğin, 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) iş farklı boyutlarda. Ancak, daha büyük coverslips daldırma su veya örnekleri gözlem sırasında sızıntı objektif lens yağdan önleyebilirsiniz.
5. Gözlem
Not: her mikroskop sistem ve kamera için uygun görüntüleme parametreleri (lazer gücü, kazanç, binning, vb) farklılık gösterir. Burada, bir iplik disk confocal tarayıcı ve dijital bir CCD kamera ile donatılmış widefield mikroskop kullanılmaktadır.
- 20 ° C sıcaklık kontrolü sahne alanı ayarla veya oda sıcaklığında 20 ayarlamak ° C.
- Örnek slayt mikroskop sahneye koydu. 100 x kullanın (sayısal diyafram = 1.3 veya daha iyi) objektif lens. Şekil 2 A (için wyIs251 ve aksonal transport) veya Resim 2 B (mnIs17 ve LFT için) pozitif denetimleri olarak belirtilen alanlar için
- Bak . Diğer alanlarda iyi 22 analiz edilebilir.
- Kümesi parametreleri (CCD kazanç = 200, Binning = 1 veya 2, 488 güçte lazer nm = 1.0-1.3 mW). 4 kare/s zaman sukut yazmak ilâ 1 dk. dosyaları Kaydet mutli-TIFF biçimi olarak gerçekleştirmek.
Not: GFP sinyalleri yok ve GFP::RAB-3 veya OSM-6::GFP 30 için izlemeye devam etmek zordur eğer s, lazer güç çok güçlü. Bu durumda, lazer gücü düşür. Diğer taraftan, veziküler hiçbir hareket kaydedildiyse, lazer gücü çok zayıftır. Bu durumda, lazer gücü arttır. - Farklı bir solucan gözlemlemek ve 5.3 ve 5,4 yineleyin. Gözlemler 20 dakikaya kadar sürebilir, ama her solucan p etkilerini önlemek için yalnızca bir kez kaydedilmesi gerekenHo'ya hasar.
Not: En az 20 dk olmadan önemli kusurları 7 , 27 , 28 için solucanlar gözlenmiştir. Daha uzun gözlem cenneti mümkün olabilir ' t oldu henüz test. Açık bir işareti nöronal ölüm neurite şişme gibi nöronal Morfoloji değişimdir. Zayıf GFP sinyaller akson ve dendrites wyIs251 ve mnIs17 görüldüğü gibi neurite Morfoloji aksonlar veya dendrites sadece bakarak kolayca denetlenebilir. Nöronal Morfoloji Şekil 2 ' de gösterildiği. - Film dosyaları oluşturmak.
Fiji yazılımı kullanarak
- açık çok TIFF dosyasını. Dosya gidin > aç sonra 5.4. adımda kaydettiğiniz çok TIFF dosyası seçin.
Not: Fiji-ebilmek var olmak downloaded jttps://fiji.sc. Resmi J ve eklentileri kymographs oluşturmak için kullanılabilir. Böylece, ilgili talimatları için seçilen eklenti. - 'ı tıklatın " dikdörtgen seçim " düğmesini ( şekil 3 bir, ok) seçeneğini belirleyip bir dikdörtgen çizerek ilgi alanı bir bilgisayar fare ile (sarı dikdörtgen şekil 3 A). Görüntü gidin > yığınları > araçlar > yapmak Substacks ve filmde içerdiği dilim numaralarını seçin. Bir substack oluşturulur.
- Substack pencereyi tıklatarak etkinleştirin ve resim gidin > ayarla > Parlaklık/Kontrast. Parlaklık ve kontrastı ayarlamak için bir pencere gösterir. Pencerede, üst slayt bar (en az) sağa doğru böylece arka plan sinyal kaybolur ve ikinci top bar (maksimum) sola kadar bu hareketli veziküller ve parçacıklar oldukça iyi arka plan üzerinde görülebilir.
- Gitmek için görüntü > yığınları > zaman Stamper. Film 4 kare/s 5,4 adımda kaydedilen zaman aralığını 0.25 olduğu s. Böylece, yazın " 0,25 " aralığındaki.
- Oluşturmak bir film dosyası olarak kaydet seçerek > AVI Dosya menüsünden (film 1 ve 2).
Not: uygun eklentileri kullanarak, dosyayı, diğer biçimleri aşağıdaki gibi kaydedebilirsiniz " mpeg4 " veya " mov " dosyaları.
- açık çok TIFF dosyasını. Dosya gidin > aç sonra 5.4. adımda kaydettiğiniz çok TIFF dosyası seçin.
- Kymographs oluşturmak.
- FIji yazılım kullanarak yeniden özgün film dosyaları açın ve tekrar adım 5.6.2 ve parlaklık ve kontrastı ayarlamak için 5.6.3.
- Tıklama " satır parçalara " ( şekil 3 B, ok). Bir fare kullanarak kirpikler veya axon (Sarı Hat, şekil 3 B) boyunca parçalı bir çizgi çizin.
- Gitmek için analiz > çok Kymograph > çok Kymograph ( şekil 3 C). Satır genişliği penceresi ( şekil 3 D) görüntülenir. Türü " 3 " Linewidth pencere ve Tamam'ı tıklatın ( şekil 3 D).
- Kymograph pencere oluşturulur. Resmi TIFF ya da JPEG formatında kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aksonal DA9 nöron nakliyesi
Anterograd ve retrograd aksonal transport GFP::RAB-3 wyIs251 satırını kullanarak aynı anda DA9 motor nöron kaydedilebilir. Anterograd ve retrograd DA9 nöron proksimal dorsal axon taşımacılığında ortalama hızı yaklaşık 1,8 ve 2.6 mikron/s, sırasıyla22var. 0.03 ve akson s başına mikron başına 0,018 hakkında hareketli veziküller sayısıdır. Böylece, bir 30 s gözlem DA9 akson 100 x lens ile 10 mikron için bir yaklaşık 9 ve 5 veziküller axon (şekil 4 ve film 1) hareketli bulabilirsiniz. Veziküler hiçbir hareketi gözlenen, lazer gücü çok zayıftır mümkündür. Uzun menzilli çalışır ek olarak kısa menzilli hareketi vezikül havuzları olabilir (film 1) kaydedildi. Diğerleri orada7' den,23ayırmak iken bazı veziküller bu vezikül havuzları kes. Bu parametreler izlenir ve mutant fenotipleri çözümlemek için kullanılabilir.
LFT kuyruk nöronlar içinde
Kirpikler C. elegans (Şekil 2B) dendrites ucuna lokalizedir. MnIs17 zorlanma GFP öğesini OSM-6, LFT alt birimleri29birini ifade eder. OSM-6 her iki kafasından ifade edilir ve nöronlar19kuyruk. Birçok kafa kirpikler mnIs17tarafından etiketlenir iken, sadece iki kirpikler kuyruk nöron açıkça görülmektedir. Böylece, bu kirpikler gözlemleyerek (Ayrıca bkz: tartışma) baş kirpikler kolaydır. OSM-6::GFP akson, hücre beden ve dendrite bulduğu gibi nöronal sitoplazmada dağınık. Ancak, kirpikler, OSM-6::GFP kirpikler için konsantre ve parçacıklar hareket dahil. PHA ve PHB kirpikler uzunluğu yaklaşık 6,5 mikron vardır. Anterograd LFT bifazik 8,9' dur. Anterograd LFT 0.7 ve kirpikler, orta ve distal segmentlerinin 1.3 mikron/s hakkında sırasıyla (şekil 5 ve Film 2) hızıdır.
Resim 1 : Numune hazırlama gösteri. (A)sıcak DW, Pasteur damlalıklı ve % 10 özel ısı blokta. (B ve C) Özel yastıkları hazırlanması: bir özel yastık slaytlar arasında (B) oluşturulur. Üst slayt bir özel yastık formları (C) sonra kaldırılır. (D) şematik nasıl polistren boncuk çözüm gösterilen çizim üzerinde özel yastık konur. (E) şematik solucanlar bir platin tel kullanarak polistren boncuk çözümde nasıl konur gösterilen çizim seç. (F) A coverslip (22 x 44 mm2) özel yastık konur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Görüntüleme alanı. (A)şeması çizim DA9 ve VA12 nöronlar ve wyIs251temsilcisi bir görüntü. DA9 nöronlarda ventral axon, komissür ve proksimal axon olgun sinapslarda yok. Ama sinaptik vezikül öncüleri hücre gövdesinden sinapslarda aksonal bu bölgeler ile taşınmaktadır. Dikkat edilmelidir bölge kutuları ile gösterilir. (B) şeması çizim PHA ve PHB nöronlar ve onların kirpikler. Dikkat edilmelidir bölge kutuları ile gösterilir. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Nesil Filmler ve Fiji yazılımı kullanarak kymographs. (A)"Dikdörtgen seçimi" düğmesini (ok) tıklatın ve bir substacks oluşturmak için bir dikdörtgen (sarı kutu) çizerek odaklanmak istiyorum alanını seçin. (B) kesimli çizgi düğmesini (ok) tıklatın ve bir fare (Sarı Hat) kullanarak kirpikler boyunca parçalı bir çizgi çizin. (C) "Analiz", "Çok Kymograph" ve "Çok Kymograph" bir eklenti başlatmak için kymographs oluşturmak için seçin. (S) giriş linewidth, tıkırtı "OK" ve kymographs (şekil 5 ve Şekil 7) oluşturur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşıma temsilcisi kymograph. gfp::rab-3 hareket DA9 nöron proksimal asynaptic bölge görülmektedir ve kymograph Fiji Multi Kymograph ile oluşturuldu. Yatay ve dikey çubuklar uzunluk ve zaman, sırasıyla gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : LFT temsilcisi kymograph. OSM-6::GFP PHA ve PHB kirpikler görülmektedir ve bu kymograph, ikisinden biri içinde kaçakçılık olayı oluşturulur. Kymograph Fiji Multi Kymograph ile oluşturuldu. Yatay ve dikey çubuklar uzunluk ve zaman, sırasıyla gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: sinaptik vezikül öncüleri aksonal taşıma temsilcisi film. gfp::rab-3 hareket DA9 nöron proksimal asynaptic bölge görülmektedir. gfp::rab-3 sinaptik vezikül öncüleri dahil ve nakli. Anterograd ve retrograd aksonal transport kaydedilir. Bazı veziküller durmak ama yeniden başlatın. Film 4 kare/s ve çalış 15 kare/s ani kalp durması kaydedildiLe bar 5 mikron =. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Movie 2: lFT temsilcisi film. OSM-6::GFP PHA ve PHB kirpikler görülmektedir. OSM-6::GFP karmaşık LFT dahil ve kirpikler hareket eder. Film 4 kare/s ve çalış kaydedildi 15 kare/s. ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sınırlama ile ilgili mevcut yöntemler
Burada açıklanan yöntemi aksonal transport ve LFT gibi hızlı olayları gözlemlemek için optimize edilmiştir. Böylece, immobilizasyon daha daha uzun kuluçka öncelik. Ise önemli pertürbasyon olmadan en az 20 dk için kaçakçılık olayları gözlemlemek mümkün olabilirdi, bu yöntem her zaman axon uzama ve hücre göç gibi uzun gözlem gerektiren yavaş olayları gözlemlemek uygun olmayabilir. Daha uzun gözlem için bir özel yüzdesini azaltarak koşulları optimize etmek gerekiyor (Yani, kurutma ve bu potansiyel olarak basınç düşürme önlemek için su artan neden hasar). Alternatif olarak, yan etkileri dikkatle değerlendirilmesi süre15 veya özel yastıkları ve anestezi kullanılarak Worms immobilizasyon açıklanan mikrosıvısal cihaz daha uygun16 olabilir.
Protokol içindeki kritik adımlar
Yeterli gözlem için işaretleri kritik öneme sahiptir. İşaretleyicileri veziküller veya parçacıkları dahil olmak ve yeterli parlaklığını olmak zorunda. Extrachromosomal diziler veya tümleşik hatları kullanılabilir. Sinaptik vezikül öncüleri DA9 nöronlar içinde aksonal transport görselleştirme için faydalı7,23 wyIs251 yük olduğunu. jsIs821 bazı çalışmalar26,27mechanosensory nöronlarda aksonal Ulaştırma gözlemlemek için kullanılmıştır. Ne zaman diğer neurons analiz edilir, sinaptik vezikül proteinler hücre belirli Organizatör kullanarak baktılar nöronlarda ifade edilmelidir. Bu Organizatör kadar güçlü olmalıdır. RAB-3 ve SNB-1 sinaptik vezikül öncüleri22,23,26etiketlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. LFT gözlemlemek için karmaşık LFT bileşenleri biçiminde etiketlenmiş olmalıdır. Pozitif kontrol, bir iyi bir seçim29 mnIs17 yük olduğunu. Kirpikler 2 hücrelerden (PHA ve PHB) kuyruk (değişkeni) paketlenmiştir iken 8 hücrelerden (ASE, ASG, ASI, ASL, ASH, ASK, ADF ve ADL) yayılan kirpikler başından (amphid) birlikte paketlenmiştir. OSM-6::GFP siliyer sinir hücreleri mnIs17olarak ifade edilir çünkü ayrıntılı olarak baş kirpikler LFT analiz etmek zor olabilir. Ancak, kuyruk bölgesinde tek PHA ve PHB nöronlar etiketlenir ve her hücrede LFT kolayca çözülebilir. Floresan proteinler tarafından etiketli diğer LFT proteinler LFT21,28gözlemlemek için kullanılabilir. Eğer bir baş nöronlar analiz etmek dilek, hücre özel Organizatör yararlı olacaktır. Baş kirpikler değişen türleri Morfoloji varken, taşıma olaylar kaydedilen29olabilir. Bu işaretçileri olan mutantlar crossing tarafından herhangi bir gen aksonal transport ve LFT işlevleri analiz vivo içindeolabilir. Analiz edilebilir parametreleri önceki iş22,23,26,27tarif edilmistir. GFP ve birincil en iyi seçimdir. mCherry ve tdTomato da kullanılan22olabilir, ancak, mCherry GFP çok kısık. tdTomato olan bir tandem dimer ve bazen füzyon protein30dinamikleri etkiler monomeric floresan proteinler daha büyük. Bu nedenle, sonuçları analiz edilmelidir ve dikkatli tdTomato kullanıldığında yorumlanır. mScarlet, son zamanlarda geliştirilmiştir, bir parlak monomeric kırmızı floresan protein bir başka seçim31' dir.
Disk confocal mikroskobu iplik yaygın aksonal transport ve LFT7,21gözlemlemek için kullanılırken, ekipman pahalı ve bazı araştırma ortamlarda erişmek zor olabilir. Ancak, bu olayları Ayrıca kaydedilen ve standart floresan mikroskoplar, eğer C. elegans bir küçük ve şeffaf hayvan ve gözlemlemek kolay olduğundan yüksek NA lensler ile donatılmış kullanarak C. elegans içinde analiz.
Yönelik uygulama
Burada açıklanan benzer immobilizasyon yöntemine göre LFT vivo32tek molekül çözünürlükte gözlendi. Ayrıca, çeşitli süper çözünürlük mikroskobu geliştirilmiştir. Bir doğrudan yöntem tanımlamak burada süper çözünürlük mikroskobik analizlerin yapıldığı için uygulayabilirsiniz. Benim durumumda, Airyscan33 hızlı modu LFT analiz etmek için çok iyi çalışıyor. Teorik olarak, bir iplik disk süper çözünürlük mikroskop (SDSRM) iyi34iyi bir seçim olurdu. Sonuç olarak, mutant kütüphaneler ve bu yeni teknikler, açıklanan yöntemi birleştirerek burada olması gerektiğini aksonal transport ve LFT vivomoleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturulması için yararlı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.
Acknowledgments
Yazar Dr. Asako Sugimoto (Tohoku Üniversitesi) derinden yararlı onun tartışma için teşekkürler. wyIs251 Doktor Kang Shen (Stanford Üniversitesi) cömert bir hediye etmişti. mnIs17 araştırma altyapı programları (P40 OD010440) NIH ofisi tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlandı. Bu eser JSP'ler KAKENHI grant #17 H 05010 ve #16 H 06536 ve Daiichi Sankyo Vakfı, beyin bilim Vakfı ve Naito Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
References
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Holzbaur, E. L., Scherer, S. S. Microtubules, axonal transport, and neuropathy. N Engl J Med. 365 (24), 2330-2332 (2011).
- Kamiya, R. Functional diversity of axonemal dyneins as studied in Chlamydomonas mutants. Int Rev Cytol. 219, 115-155 (2002).
- Scholey, J. M. Intraflagellar transport motors in cilia: moving along the cell's antenna. J Cell Biol. 180 (1), 23-29 (2008).
- Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Intraflagellar transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (11), 813-825 (2002).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Ciliogenesis: building the cell's antenna. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (4), 222-234 (2011).
- Niwa, S., et al. Autoinhibition of a Neuronal Kinesin UNC-104/KIF1A Regulates the Size and Density of Synapses. Cell Rep. 16 (8), 2129-2141 (2016).
- Snow, J. J., et al. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).
- Ou, G., Blacque, O. E., Snow, J. J., Leroux, M. R., Scholey, J. M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. Nature. 436 (7050), 583-587 (2005).
- Zhou, R., Niwa, S., Homma, N., Takei, Y., Hirokawa, N. KIF26A is an unconventional kinesin and regulates GDNF-Ret signaling in enteric neuronal development. Cell. 139 (4), 802-813 (2009).
- Zhao, C., et al. Charcot-Marie-Tooth disease type 2A caused by mutation in a microtubule motor KIF1Bbeta. Cell. 105 (5), 587-597 (2001).
- Niwa, S., Tanaka, Y., Hirokawa, N. KIF1Bbeta- and KIF1A-mediated axonal transport of presynaptic regulator Rab3 occurs in a GTP-dependent manner through DENN/MADD. Nat Cell Biol. 10 (11), 1269-1279 (2008).
- Zhou, R., Niwa, S., Guillaud, L., Tong, Y., Hirokawa, N. A molecular motor, KIF13A, controls anxiety by transporting the serotonin type 1A receptor. Cell Rep. 3 (2), 509-519 (2013).
- Klassen, M. P., et al. An Arf-like small G protein, ARL-8, promotes the axonal transport of presynaptic cargoes by suppressing vesicle aggregation. Neuron. 66 (5), 710-723 (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. J Vis Exp. (67), (2012).
- Chai, Y., et al. Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development. Nat Protoc. 7 (12), 2090-2102 (2012).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), 53419 (2013).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
- Collet, J., Spike, C. A., Lundquist, E. A., Shaw, J. E., Herman, R. K. Analysis of osm-6, a gene that affects sensory cilium structure and sensory neuron function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 148 (1), 187-200 (1998).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Niwa, S. The nephronophthisis-related gene ift-139 is required for ciliogenesis in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 6, 31544 (2016).
- Maeder, C. I., San-Miguel, A., Wu, E. Y., Lu, H., Shen, K. In vivo neuron-wide analysis of synaptic vesicle precursor trafficking. Traffic. 15 (3), 273-291 (2014).
- Wu, Y. E., Huo, L., Maeder, C. I., Feng, W., Shen, K. The balance between capture and dissociation of presynaptic proteins controls the spatial distribution of synapses. Neuron. 78 (6), 994-1011 (2013).
- Dwyer, N. D., Adler, C. E., Crump, J. G., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Polarized dendritic transport and the AP-1 mu1 clathrin adaptor UNC-101 localize odorant receptors to olfactory cilia. Neuron. 31 (2), 277-287 (2001).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).
- Kumar, J., et al. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).
- Zheng, Q., et al. The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport. PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).
- Blacque, O. E., et al. The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport. Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).
- Evans, J. E., et al. Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia. Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).
- Robison, P., et al. Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes. Science. 352 (6284), 0659 (2016).
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
