Summary
Comprendre l’influence des pesticides organochlorés environnementaux (PCO) sur la fonction mitochondriale dans les hépatocytes est important dans l’exploration du mécanisme des PCO causant des troubles métaboliques. Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique.
Abstract
Cet article présente des méthodes détaillées sur la détection de la fonction mitochondriale hépatique pour une meilleure compréhension de la cause des troubles métaboliques causés par les pesticides organochlorés environnementaux (PCO) chez les hépatocytes. Les cellules d’hépG2 ont été exposées à l’β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) pendant 24 h à une dose équivalente d’exposition interne dans la population générale. L’ultrastructure dans les hépatocytes a été examinée par microscopie électronique de transmission (TEM) pour montrer les dommages des mitochondries. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial membranaire (MMP) dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. L’intensité de fluorescence de mitochondries après tachée par la sonde fluorescente verte mitochondriale a été observée avec une microscopie de fluorescence. La réaction de luciferin-luciferase a été employée pour déterminer des niveaux d’ATP. Le MMP a été détecté par le colorant cationique JC-1 et analysé sous cytométrie de flux. L’OCR a été mesuré avec un analyseur de flux extracellulaire. En résumé, ces protocoles ont été utilisés dans la détection de la fonction mitochondriale dans les hépatocytes avec pour étudier les dommages mitochondries.
Introduction
Les effets des pesticides organochlorés (PCO) sur la santé, par exemple l’interférence reproductrice, la toxicité immunologique, les changements métaboliques ont été précédemment étudiés1,2,3. Les méthodes pour détecter le métabolisme cellulaire et découvrir le dysfonctionnement mitochondrial ont permis aux scientifiques de comprendre le rôle de la fonction mitochondriale(c.-à-d., niveaux de STAT3 mitochondrial, lactate, pyruvate, rapport lactate-pyruvate, coenzyme Q10, fuite de protons mitochondrials, bioénergétique, biogenèse, et dynamique) dans des domaines tels que le vieillissement, l’obésité, le diabète, la fonction cardiovasculaire, le cancer, et la toxicité de sécurité4,5,6,7. Dans cet article, nous décrivons les méthodes sur l’évaluation du dysfonctionnement mitochondrial provoqué par les OCP.
Nous avons exposé les cellules hepG2 à β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP représentatif, pendant 24 h à une dose équivalente à l’exposition interne de l’homme. Tout d’abord, TEM a été appliqué pour observer l’ultrastructure des hépatocytes, tels que les noyaux, les mitochondries et le réticulum endoplasmique8. Par rapport aux microscopes ordinaires, TEM permet d’explorer l’ultra-structure 2D et 3D des cellules et des composants cellulaires (lignées cellulaires ou tissu), la morphologie, la composition chimique, ainsi que la fonction des matériaux naturels ou artificiels qui jouent un rôle central dans la science et la technologie modernes. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5'-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial de membrane (MMP)dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. Mito-tracker vert est une sonde fluorescente verte mitochondries qui peut être utilisée pour la coloration fluorescente spécifique aux cellules vivantes. Les mitochondries dans les hépatocytes ont été tachées par la solution verte de mito-tracker et l’intensité de fluorescence mitochondriale, le nombre et le modèle ont été observés avec une microscopie confocale9. La sonde fluorescente verte mitochondriale peut être employée pour tacher des cellules vivantes. Par rapport à la rhodamine 123 ou à JC-1, la sonde fluorescente vert mitochondrial ne dépend pas du potentiel de membrane mitochondriale pour la coloration mitochondriale. Les niveaux d’ATP ont été déterminés par un kit de luciferase-luciferin et normalisés par la concentration de protéine. Le kit d’essai ATP peut être utilisé pour détecter les niveaux d’ATP dans les solutions, cellules ou tissus courants. Ce kit est basé sur luciferase de luciferase de lucfly catalysé par la fluorescéine pour produire la fluorescence, quand l’ATP est nécessaire pour fournir l’énergie. Lorsque la luciferase et la fluorescéine de lucfly sont excessives, dans une certaine plage de concentration, la génération de fluorescence est proportionnelle à la concentration d’ATP. En outre, ce kit a été spécialement conçu pour optimiser la chemiluminescence de l’ATP. L’ATP, en tant que molécules énergétiques les plus importantes, joue un rôle important dans les différents processus physiologiques ou pathologiques des cellules. Les changements dans les niveaux d’ATP peuvent refléter des défauts dans la fonction cellulaire, particulièrement la production d’énergie mitochondriale. Habituellement sous apoptose, nécrose ou dans un état toxique, les niveaux d’ATP cellulaire réduit 10. Le kit d’analyse MMP avec JC-1 est un kit qui utilise JC-1 comme sonde fluorescente pour détecter les cellules, les tissus ou les MMP purifiés rapidement et avec sensibilité. Il peut être utilisé pour la détection précoce de l’apoptose. Le colorant cationique JC-1 est une sonde fluorescente utilisée pour détecter le MMP qui peut être analysée sous cytométrie de débit indiquée par des changements de rapport de fluorescence vert et rouge. Lorsque le MMP est élevé, le JC-1 est agrégé dans la matrice des mitochondries pour former un polymère (agrégats J), qui produit de la fluorescence rouge. Lorsque le MMP est faible, JC-1 ne peut pas s’accumuler, et forme monomère qui produit la fluorescence verte11. Ainsi, le rapport de fluorescence rouge et vert peut refléter le niveau de MMP. L’OCR des cellules est un indicateur crucial de la fonction cellulaire normale12. Il est considéré comme un paramètre pour la recherche de la fonction mitochondriale. Cell mito stress test kit fournit une méthode stable pour analyser les paramètres clés de la fonction mitochondriale. Le kit fournit le contrôle de la qualité et les réactifs prédictifs ainsi qu’une méthode standard pour effectuer le test de stress mitochondrial cellulaire. Il peut être utilisé pour détecter tous les types de cellules, y compris les cellules primaires, les lignées cellulaires, les cellules en suspension, et aussi pour les îlots, les nématodes, les levures et les mitochondries isolées.
La mesure de l’OCR peut fournir un aperçu précieux de l’état physiologique ou des altérations des cellules. Il a été déterminé avec un analyseur de flux extracellulaire pour détecter la ligne de base de respiration, la fuite de proton, la respiration maximale, le chiffre d’affaires d’ATP et la capacité de réserve. En bref, après des mesures de base de l’OCR, l’OCR a été détecté après avoir ajouté séquentiellement à l’oligomycine (ATP Coupler), FCCP (phosphorylation oxydative mitochondriale uncoupler) et antimycine A/roténone (un inhibiteur de la consommation d’oxygène) par puits.
Dans un effort pour faciliter le développement d’un protocole plus spécifique pour détecter la fonction mitochondriale chez les hépatocytes in vitro, nous présentons ici des expériences par TEM, microscopie confocale, luminomètre, cytométrie de flux et analyseur de flux extracellulaire avec application future dans l’étude des dommages mitochondries effets indésirables connexes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences et les protocoles d’expérience ont été réalisés conformément aux lignes directrices et règlements pertinents et approuvés par le Comité d’éthique local de l’Université médicale de Nanjing.
1. Ultrastructure mitochondriale par TEM
- Collecte des cellules HepG2
- Seed HepG2 cellules dans des plats de 100 mm. Conserver à 37 °C et 5 % de CO2.
- Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans le tube de 1,5 mLEP.
- Centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min à température ambiante (RT). Jetez le supernatant.
- Recueillir 4-6 x 105 cellules HepG2.
- Ajouter 1 mL de 5% de glutaraldéhyde (Solvant: double eau distillée) avec des pipettes et incuber à 4°C pendant 2 h.
- Ajouter et laver en 4 changements de 1 mL de tampon phosphate (contenant Na2HPO4, KH2PO4, NaCl et KCl, pH 7.4), 15 min chacun. Aspirer le tampon de phosphate avec des pipettes.
- Ajouter 200 μm d’osmium à 1 % (Solvant : double eau distillée) et incuber à 4 °C pendant 2 h à l’échantillon noir.
Attention : L’osmium est une substance hautement toxique et volatile. Il doit être actionné dans l’armoire à médicaments avec soin. - Ajouter et laver en 2 changements de 1 mL de tampon de phosphate, 5 min chacun. Aspirer le tampon de phosphate.
- Tache dans la solution d’acétate d’uranyl à 2 % (Solvant : double eau distillée et acide acétique) dans un tube EP de 1,5 mL pour 2 h.
- Déshydrater et submerger à travers 50% d’acétone, 70% d’acétone, 90% d’acétone (Solvant: double eau distillée), 2 changements d’acétone absolue, 15 min chacun.
- Pénétrer en 2 gouttes d’acétone (100%) /agent d’intégration (1:1) pour 1,5 h à RT. Epon812 agent d’incorporation, la recette est la suivante: Epon812, 62 mL et DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL et MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, en hiver), A:B=1:9 (v:v, en été). Intégration dans l’intégration des moules (Plaque en plastique souple avec grille à carreaux).
- Incuber séquentiellement à 37 °C pour 12 h, 45 °C pendant 12 h, puis 60 °C pendant 48 h.
- Préparer et observer les sections d’ultrathin (la plus grande zone ne peut pas dépasser 0,5 mm × 0,3 mm) par la machine de sections d’ultrathin et TEM (2 μm et 500 nm).
2. Détection de l’intensité de fluorescence mitochondriale
- Seed 2x 104 Cellules hepG2 dans des plaques de 6 puits. Ajouter β-HCH pendant 24 h.
- Ajouter un DMSO anhydre pour formuler une concentration finale de 1 mM de sonde fluorescente vert mitochondrial.
- Ajouter 1 mL solution de sonde fluorescente vert mitochondrial (concentration finale : 200 nM) à chaque puits de plaques de 6 puits, incuber à 37 °C pendant 45 min.
- Retirez la solution de sonde fluorescente vert mitochondrial et ajoutez le milieu de culture cellulaire fraîchement préparé (DMEM) à 37 °C avant l’imagerie.
- Observez la fluorescence vert mitochondrial par un microscope à fluorescence (10x). La longueur d’onde maximale d’excitation à la détection est de 490 nm et la longueur d’onde maximale d’émission est de 516 nm.
3. Essai des niveaux d’ATP cellulaires
- Semer les cellules hepG2 dans des plaques de 6 puits. Ajouter β-HCH pendant 24 h.
- Ajouter 200 μL de tampons de lyse du kit d’essai ATP luciferase-luciferin à chaque puits de plaques de 6 puits. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C, recueillir le supernatant avec des pipettes dans de nouveaux tubes.
- Diluer le réactif de détection ATP avec la dilution ATP à un ratio de 1: 5, comme tampon de détection ATP.
- Préparer la détermination de la courbe standard : diluer les 0,5 m M de solution standard ATP à 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM par tampons de lyse ATP.
- Ajouter 100 μL de tampon de détection ATP dans une plaque de 96 puits pendant 5 min à RT, et ajouter 100 μL de supernatant de cellule, détecter par un luminomètre (détecteur de chemiluminescence). Calculer la concentration d’ATP (nmol/L) à l’égard de la courbe standard.
- Détecter la concentration de protéines par un kit d’analyse de protéines BCA avec lecteur multimode.
- Préparation de la détermination de la courbe standard : diluer les 5 mg/mL de la solution standard protéique à 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 mg/mL par double eau distillée.
- Ajouter 1 μL de supernatant de cellule dans une plaque de 96 puits et ajouter 19 μL d’eau double distillée.
- Ajoutez 200 μL de solutions de détection BCA pour chaque puits. Incuber à 37 °C pendant 30 min. Détecter la valeur OD (densité optique) par un lecteur multimode avec 562 nm. Calculer la concentration de protéines (mg/mL) par la courbe standard.
- Corriger la teneur en ATP par mg de concentration de protéines (unité : concentration d’ATP/concentration de protéines, nmol/mg).
4. Évaluation du potentiel memitochondrial de membrane (MMP) par JC-1
- Recueillir les cellules HepG2 ensemencées dans des plaques de 6 puits. Digester les cellules avec 0,25% EDTA dans un tube EP de 1,5 mL, la centrifugeuse à 1000 x g pendant 3 min, jeter le supernatant et collecter les cellules.
- Ajouter 50 μL de JC-1 (200X) à 8 mL d’eau distillée pour vortexer et mélanger. Ajoutez 2 mL de tampon de teinture de coloration JC-1 (5X) comme solution de détection JC-1.
- Incuber les cellules avec un mélange de 0,5 mL de culture cellulaire moyenne et 0,5 mL de solution de détection JC-1 pour 20 min à 37 °C.
- Centrifugeuse à 600 x g pendant 3 min à 4 °C. Jetez le supernatant.
- Rincer en 2 changements de 1 mL de tampon de teinture JC-1 (1X), centrifugeuse à 600 x g pendant 3 min à 4 °C. Et jetez le supernatant.
- Suspendre les cellules dans 0,5 mL de tampon de teinture JC-1 (1X), analyser par cytométrie de flux pour détecter la fluorescence verte et rouge. Lorsque le polymère JC-1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 490 nm et la lumière d’émission à 530 nm. Lorsque le polymère JC-1 est détecté, réglez la lumière d’excitation à 525 nm et la lumière d’émission à 590 nm.
5. Mesures des taux de consommation d’oxygène (OCR)
- Semences cellules HepG2 dans les microplaques de culture cellulaire de 96 puits à une densité de 4500 cellules/100 μL par puits. Assurer les cellules couvertes de chaque puits après 24 h.
- Ajouter le volume approprié des réactifs préparés dans le port d’injection approprié, selon la littérature précédente13. Port A : 25 μL 1 μM d’oligomycine (COUPLER ATP); Port B : 25 μL 0,75 μM de FCCP (Contrôle électronique des gaz, accélérateur ETC); Port C : 25 μL 0,5 de μM d’antimycine A/roténone (inhibiteur mitochondrial A et inhibiteur mitochondrial B).
- Conserver la cartouche dans un incubateur de 37 °C sans CO2 jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
- Effectuez un changement moyen de la plaque cellulaire en enlevant le milieu de fonctionnement de chaque puits et en ajoutant au nouveau DMEM. Le volume final pour chaque puits est de 180 μL.
- Conserver la plaque cellulaire dans un incubateur de 37 °C sans CO2 pendant 1 h avant l’essai.
- Enregistrez automatiquement l’OCR par logiciel.
- Ouvrez le logiciel OCR.
- Choisissez Cell Mito Stress Test Kit dans le menu déroulant Apps.
- Cliquez sur le bouton Démarrer l’application.
- Cliquez sur le bouton Exécuter le test de stress. L’écran d’installation du test de stress cellulaire s’affiche.
- Procédez comme suit :
- Entrez le nombre de cellules ensemencées par puits dans la boîte d’ensemencement cellulaire # .
- Entrez l’OCR moyen dans la zone OCR basal moyenne.
- Entrez la concentration de travail finale pour chaque réactif et injectez les réactifs.
REMARQUE : La valeur moyenne de l’OCR basal pour la cellule aurait dû être détectée avant d’exécuter l’analyse d’optimisation lors de l’optimisation de la concentration d’ensemencement cellulaire. - Cliquez sur le bouton Suivant. L’écran d’informations de groupe s’affiche.
- Affectez un groupe aux puits non attribués en choisissant une couleur et en donnant un nom, puis en cliquant sur les puits appropriés.
REMARQUE : Les différents groupes sont définis comme différents traitements avant l’exécution du test de stress Cell Mito. Tous les puits de microplaques recevront les mêmes injections de réactif lorsque le test de résistance est exécuté. - Cliquez sur le bouton Suivant. L’écran de disposition d’injection de test de stress s’affiche.
- Cliquez sur Démarrer. Le test de résistance est maintenant exécuté sur l’analyseur. Lorsque l’exécution est terminée, suivez le point s dans le logiciel, retirez et jetez la cartouche et la plaque de cellule.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les cristae mitochondries des cellules hepG2 exposées au β-HCH ont été nettement endommagées. Les mitochondries dispersées ont été légèrement étendues, de forme irrégulière, et la crête mitochondriale a disparu avec l’architecture mitochondriale relativement anormale (figure 1).
L’intensité moyenne de fluorescence vert mitochondrial, qui représente les mitochondries, a diminué dans les cellules hepG2 exposées à β-HCH (figure 2), ainsi que dans les niveaux d’ATP (figure 3). L’intensité de la fluorescence et le niveau d’ATP ont diminué graduellement avec l’augmentation des concentrations d’exposition. Potentiellement, la réduction du nombre de mitochondries, ou les mitochondries endommagées, a causé l’intensité de fluorescence mitochondriale observée, et par conséquent la production réduite d’ATP.
Les résultats de la cytométrie du débit ont démontré que les rapports de fluorescence JC-1 rouge/vert dans le groupe β-HCH étaient significativement inférieurs à ceux du contrôle (figure 4). L’OCR des cellules HepG2 a été réduit d’une manière dépendante de la dose après l’exposition à la β-HCH. Par rapport au groupe témoin, les taux de respiration basale, la fuite de protons, la capacité respiratoire maximale et le chiffre d’affaires de l’ATP ont été significativement diminués dans les cellules HepG2 exposées à β-HCH (figure 5). Ces résultats ont indiqué que la fonction mitochondriale a été altérée après l’exposition de β-HCH.
Tous les instruments utilisés dans ces expériences ont été présentés dans la figure supplémentaire 1.
Figure 1: Micrographes TEM représentatifs des cellules hepG2 exposées au β-HCH (A : 6000×, B : 25000×). Les dommages typiques ont montré des mitochondries légèrement agrandies (M), des matrices d’électron-lucent, des cristae endommagés et des lacunes lâches d’organelle. M: mitochondries. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Détection de la fluorescence mitochondriale dans les cellules hepG2 traitées par β-HCH13. La quantité, l’emplacement et l’intensité de fluorescence des mitochondries (A) ont été montrés dans les images microscopiques de fluorescence et les niveaux quantitatifs de l’intensité de fluorescence mitochondriale étaient basés sur le ver mitochondrial fluorescent par cellule (B). *: P < 0,05, ***: P < 0,001 par rapport au contrôle. Chaque point de données était le moyen ± SEM de trois expériences distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Niveaux d’ATP dans les cellules hepG213. ***: P < 0,001 par rapport au contrôle, ##: P < 0,01 par rapport à 10 ng/mL β-HCH.Data ont été présentés comme moyenne ± SEM de trois expériences distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Effets sur MMP par la coloration ET la cytométrie du flux JC-113. (A) Parcelles de cytométrie de flux. L’axe Y a montré le rapport entre la fluorescence rouge et verte. PE: Fluorescence rouge, FITC: Fluorescence verte. (B).**: P < 0,01 par rapport au contrôle. Chaque point de données était le moyen ± SEM de trois expériences distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: Détection du taux de consommation d’oxygène cellulaire (OCR). (A) L’effet de β-HCH sur l’OCR cellulaire a été mesuré par l’analyseur de flux extracellulaire. Les quatre périodes représentent le taux de respiration basale cellulaire, le taux d’inhibition de l’ATP-synthase, le taux maximal de découplé, et le taux de roténone ou d’antimycine-A-inhibé. (B) Histogrammes quantitatifs des résultats d’OCR pour la ligne de base, fuite de protons, capacité respiratoire maximale, capacité d’andreserve de rotation d’ATP. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 par rapport au contrôle. Chaque point de données était le moyen ± SEM de trois expériences distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1: Tous les instruments utilisés dans les protocoles. (A) Microscopie électronique de transmission. (B) Microscope confocal à balayage laser. (C) Luminomètre. (D) Lecteur multimode. (E) Cytométrie de flux. (F) Analyseur de flux extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’utilisation d’une variété de méthodes expérimentales qui ont été couvertes par le phénotype au mécanisme est essentielle au succès du protocole de détection. Dans cette étude, les cellules d’HepG2 ont été cultivées dans DMEM avec la pénicilline et la streptomycine et le sérum bovin foetal de 10%. Lorsque les cellules ont atteint 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h. Nous avons d’abord utilisé TEM qui a montré les changements ultrastructuraux dans l’hépatocyte causés par les OCP représentatifs, β-HCH, montrant l’affaiblissement de la structure des mitochondries (Figure 1). En outre, l’essai de coloration fluorescente (figure 2), l’essai atp de luciferase-luciferin (figure 3), l’essai de tension de JC-1 (figure 4) et l’essai de test de résistance de mito de cellules (figure 5), qui évaluent généralement le dysfonctionnement de mitochondries, ont été exécutés. Ces résultats servent de base à l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents.
Dans les méthodes ci-dessus, les enquêteurs devraient prêter attention aux précautions à certaines étapes. Par exemple, dans la préparation de la cellule de microscopie électronique, le nombre de cellules doit être prêté attention, afin d’éviter une mauvaise fixation causée par un tissu trop grand ou un bloc cellulaire. 5% glutaraldéhyde agit comme un fixatif, il est préférable de ne pas stocker plus d’une demi-année afin d’éviter l’échec de détection. Les échantillons fixes sont placés à 4 °C pendant 24 h ou jusqu’à 1 mois avant l’étape suivante. Le colorant fluorescent vert mitochondrial est facile à étancher, et la lumière devrait être évitée pour ralentir l’extinction de fluorescence. Dans le test de niveau ATP cellulaire, lors de l’utilisation d’un luminomètre multifonctionnel qui peut détecter la chemiluminescence, le tableau noir opaque ou tableau blanc 96 plaques de puits doit être utilisé pour éviter les interférences mutuelles entre les trous adjacents. L’ATP, en particulier le clivage de l’ATP dans l’échantillon n’est pas stable à température ambiante, et l’expériment doit être actionné à 4 °C ou sur la glace. L’ATP peut être stable sur la glace jusqu’à 6 h. Dans la préparation de la solution de détection JC-1, le tampon de teinture de coloration JC-1 (5X) peut être ajouté après que le JC-1 (200X) soit complètement dissous et mélangé avec l’eau ultrapure, de sorte que la solution de détection JC-1 sera facile à dissoudre complètement. La sonde JC-1 doit être chargée et lavée dans les 30 minutes et sauvée à 4 °C ou de la glace pour effectuer l’essai de suivi. Dans les mesures OCR, la valeur moyenne basale d’OCR pour la cellule doit être détectée avant l’essai d’optimisation, lors de l’optimisation de la concentration d’ensemencement cellulaire.
Il y a certaines limites de ces méthodes. La mesure de l’OCR par un analyseur de flux extracellulaire se limite aux expériences cellulaires. La détection de la fonction mitochondriale n’est pas assez profonde puisque les produits métaboliques par mitochondries ne sont pas mesurés, tels que la mesure des acides gras et des métabolites dans les cycles de TCA dans les hépatocytes. En outre, l’expression des gènes et des protéines en ce qui concerne la synthèse et la dégradation des acides gras hépatiques pourrait être détectée par réaction en chaîne en temps réel de polymérase et tache occidentale, ce qui peut confirmer davantage les troubles moléculaires du métabolisme des acides gras et du dysfonctionnement mitochondrial13. Les images numériques des mitochondries peuvent être capturées dans les cellules vivantes sous microscopie confocale et analysées pour les changements de morphologie mitochondriale basés sur le facteur de forme (FF) et le rapport d’aspect (AR). La fonction métabolique des mitochondries a également été évaluée en mesurant le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) à l’aide d’un analyseur bioénergétique14. Certains anticorps marqueurs mitochondriaux (cytochrome c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA et STAT3) peuvent être mesurés par la tache occidentale4,15,16,17. Les activités des enzymes respectant la fonction mitochondriale et le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA), telles que la déshydrogénase malic, la déshydrogénase succinée, la synthétase citrate, ATPase, la déshydrogénase d’isocitrate et la déshydrogénase de malicoglutarate sont en évidence18. La fonction de la chaîne de transport d’électrons dans les cellules et dans les mitochondries isolées du foie est détectée à l’aide de la respirométrie à haute résolution19.
Nos protocoles se concentrent sur la détection de la morphologie mitochondriale, de la structure, de l’emplacement, de la quantité, de la capacité, du potentiel membranaires et de la fonction de la chaîne respiratoire. Ceux-ci sont fondamentalement capables d’évaluer la fonction mitochondriale de différents aspects. De plus, ces méthodes sont simples et faciles à utiliser. Les études de fonction mitochondriale ont été largement menées dans différents domaines, tels que le foie20, microbiote intestinal21, cellules souches pluripotentes22, et dans certaines maladies courantes, telles que le diabète de type 223, la maladie de Parkinson24 et la maladie inflammatoire de l’intestin25. Il peut y avoir plus de maladies associées aux mitochondries, et nos protocoles peuvent être utiles dans l’étude des mécanismes pertinents. En outre, d’autres travaux empiriques sont également nécessaires sur l’échelle complète et approfondie de ces effets avec des méthodes plus expérimentales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); le Fonds pour la jeunesse exceptionnel de la province du Jiangsu (SBK2014010296); le projet de recherche du ministère chinois de l’Éducation (213015A); le programme académique prioritaire de développement des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD), le développement majeur phare des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu; et le programme de projet ouvert du Laboratoire d’État clé de chimie environnementale et d’écotoxicologie (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
