Summary
Comprender la influencia de los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en la función mitocondrial en los hepatocitos es importante para explorar el mecanismo de los OCP que causan trastornos metabólicos. Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática.
Abstract
Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática para comprender mejor la causa de los trastornos metabólicos causados por los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en los hepatocitos. Las células hepG2 se expusieron al hexaclorociclohexano durante 24 h a una dosis equivalente de exposición interna en la población general. La ultraestructura en los hepatocitos se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para mostrar el daño de las mitocondrias. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5'-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. La intensidad de fluorescencia de las mitocondrias después de mancharse por la sonda fluorescente verde mitocondrial se observó con una microscopía de fluorescencia. La reacción luciferina-luciferasa se utilizó para determinar los niveles de ATP. El MMP fue detectado por el tinte catiónico JC-1 y analizado bajo citometría de flujo. El OCR se midió con un analizador de flujo extracelular. En resumen, estos protocolos se utilizaron en la detección de la función mitocondrial en hepatocitos con para investigar los daños de las mitocondrias.
Introduction
Los efectos de los plaguicidas organoclorados (OCP) en la salud, por ejemplo, interferencia reproductiva, toxicidad inmunológica, cambios metabólicos se han estudiado previamente1,2,3. Los métodos para detectar el metabolismo celular y descubrir la disfunción mitocondrial han permitido a los científicos comprender el papel de la función mitocondrial(es decir., niveles de STAT3 mitocondrial, lactato, piruvato, relación lactato-piruvato, coenzima Q10, fuga de protones mitocondriales, bioenergética, biogénesis y dinámica) en áreas como el envejecimiento, la obesidad, la diabetes, la función cardiovascular, el cáncer y la toxicidad para la seguridad4,,5,6,7. En este artículo, describimos los métodos para evaluar la disfunción mitocondrial causada por los OCP.
Hemos expuesto las células de HepG2 a un O-hexaclorociclohexano , un OCP representativo, durante 24 h a una dosis equivalente a la exposición interna de humanos. En primer lugar, se aplicó TEM para observar la ultraestructura de los hepatocitos, como núcleos, mitocondrias y retículo endoplasmático8. En comparación con los microscopios ordinarios, TEM permite explorar la ultraemetría 2D y 3D de células y componentes celulares (líneas celulares o tejidos), la morfología, composición química, así como la función de materiales naturales o artificiales que juegan un papel fundamental en la ciencia y la tecnología modernas. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5'-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. El verde mito-tracker es una sonda fluorescente verde de las mitocondrias que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de la célula viva. Las mitocondrias en los hepatocitos fueron manchadas por solución verde mito-tracker y se observó intensidad de fluorescencia mitocondrial, número y patrón con una microscopía confocal9. La sonda fluorescente verde mitocondrial se puede utilizar para manchar las células vivas. En comparación con la rhodamine 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondrial no depende del potencial de membrana mitocondrial para la tinción mitocondrial. Los niveles de ATP fueron determinados por un kit de luciferasa-luciferina y normalizados por la concentración de proteínas. Kit de ensayo de ATP se puede utilizar para detectar los niveles de ATP en soluciones comunes, células o tejidos. Este kit se basa en la luciasa de lucilyzed por fluoresceína para generar fluorescencia, cuando se requiere ATP para proporcionar energía. Cuando la luciasa de la luciosa y la fluoresceína son excesivas, en un cierto rango de concentración, la generación de fluorescencia es proporcional a la concentración de ATP. Además, este kit ha sido especialmente diseñado para optimizar la quimiuminoscencia de ATP. ATP, como las moléculas de energía más importantes, juega un papel importante en los diversos procesos fisiológicos o patológicos de las células. Los cambios en los niveles de ATP pueden reflejar defectos en la función celular, especialmente la producción de energía mitocondrial. Generalmente bajo apoptosis, necrosis o en algún estado tóxico, los niveles celulares de ATP redujeron 10. El kit de ensayo de MMP con JC-1 es un kit que utiliza JC-1 como sonda fluorescente para detectar células, tejidos o MMP purificados de forma rápida y sensible. Se puede utilizar para la detección temprana de apoptosis. El tinte catiónico JC-1 es una sonda fluorescente utilizada para detectar el MMP que se puede analizar bajo citometría de flujo indicada por cambios de relación de fluorescencia verde y roja. Cuando el MMP es alto, JC-1 se agrega en la matriz de las mitocondrias para formar un polímero (J-agregados), que produce fluorescencia roja. Cuando el MMP es bajo, JC-1 no se puede acumular, y forma monómero que produce fluorescencia verde11. Así que la proporción de fluorescencia roja y verde puede reflejar el nivel de MMP. El OCR de las células es un indicador crucial de la función celular normal12. Se considera como un parámetro para investigar la función mitocondrial. El kit de prueba de esfuerzo de mito celular proporciona un método estable para analizar los parámetros clave de la función mitocondrial. El kit proporciona control de calidad y reactivos predictivos, así como un método estándar para realizar pruebas de esfuerzo mitocondrial celular. Se puede utilizar para detectar todos los tipos de células, incluidas las células primarias, las líneas celulares, las células suspendidas, y también para los islotes, los nematodos, las levaduras y las mitocondrias aisladas.
La medición de OCR puede proporcionar información valiosa sobre el estado fisiológico o alteraciones de las células. Se determinó con un analizador de flujo extracelular para detectar la línea de base respiratoria, fuga de protones, respiratoria máxima, rotación de ATP y capacidad de reserva. En resumen, después de las mediciones basales de OCR, OCR se detectó después de agregar secuencialmente a la oligomicina (ACOPLAdor ATP), FCCP (desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial) y antimicina A/ rotenona (un inhibidor del consumo de oxígeno) por pozo.
En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de un protocolo más específico para la detección de la función mitocondrial en hepatocitos in vitro, presentamos aquí experimentos por TEM, microscopía confocal, luminómetro, citometría de flujo y analizador de flujo extracelular con aplicación futura en el estudio de los resultados adversos relacionados con el daño de las mitocondrias.
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Protocol
Todos los experimentos y los protocolos del experimento se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y fueron aprobados por el Comité ético local de la Universidad Médica de Nanjing.
1. Ultraestructura mitocondrial por TEM
- Recolección de células HepG2
- Células HepG2 de semilla en platos de 100 mm. Conservar a 37oC y 5% de CO2.
- Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo de 1,5 mLEP.
- Centrífuga a 1000 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante.
- Recoger 4-6 x 105 células HepG2.
- Añadir 1 ml de glutaraldehído al 5% (Solvente: agua doble destilada) con pipetas e incubar a 4oC durante 2 h.
- Añadir y lavar en 4 cambios de 1 ml de tampón de fosfato (que contiene Na2HPO4, KH2PO4, NaCl y KCl, pH 7.4), 15 min cada uno. Succionar el tampón de fosfato con pipetas.
- Añadir 200 m de 1% de osmio (solvente: agua destilada doble) e incubar a 4oC durante 2 h a muestra negra.
Precaución: El osmio es una sustancia altamente tóxica y volátil. Debe ser operado en el gabinete de drogas con cuidado. - Añadir y lavar en 2 cambios de 1 ml de tampón de fosfato, 5 min cada uno. Succionar el tampón de fosfato.
- Mancha en 2% solución de acetato de uranilo (Solvent: agua destilada doble y ácido acético) en tubo EP de 1,5 ml durante 2 h.
- Deshidratar y sumergir a través de 50% de acetona, 70% acetona, 90% acetona (Solvente: doble agua destilada), 2 cambios de acetona absoluta, 15 min cada uno.
- Penetra en 2 gotas de acetona (100%)/agente de incrustación (1:1) durante 1,5 h en RT. Epon812 agente de incrustación, la receta es la siguiente: A: Epon812, 62 mL y DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL y MNA 89 mL. A:B-2:8 (v:v, en invierno), A:B-1:9 (v:v, en verano). Incrustar en moldes de incrustación (placa de plástico suave con rejilla a cuadros).
- Incubar secuencialmente a 37oC durante 12 h, 45oC durante 12 h y luego 60oC durante 48 h.
- Preparar y observar secciones ultrafinas (el área más grande no puede superar los 0,5 mm a 0,3 mm) mediante secciones ultrafinas de máquina y TEM (2 m y 500 nm).
2. Detección de intensidad de fluorescencia mitocondrial
- Semilla 2x 104 células HepG2 en placas de 6 pozos. Añadir -HCH durante 24 h.
- Añadir DMSO anhidro para formular una concentración final de sonda fluorescente verde mitocondrial de 1 mM.
- Añadir 1 ml de solución de sonda fluorescente verde mitocondrial (concentración final: 200 nM) a cada pozo de placas de 6 pozos, incubar a 37 oC durante 45 min.
- Retire la solución de sonda fluorescente verde mitocondrial y agregue un medio de cultivo celular recién preparado (DMEM) a 37 oC antes de la toma de imágenes.
- Observe la fluorescencia verde mitocondrial por un microscopio de fluorescencia (10x). La longitud de onda máxima de excitación en la detección es de 490 nm y la longitud de onda de emisión máxima es de 516 nm.
3. Ensayo de los niveles celulares de ATP
- Células HepG2 de semilla en placas de 6 pozos. Añadir -HCH durante 24 h.
- Añadir 200 l de tampones de lysis del kit de ensayo de ATP luciferasa-luciferin a cada pocillo de placas de 6 pocillos. Centrifugar a 12.000 g durante 5 min a 4 oC, recoger el sobrenadante con pipetas en tubos nuevos.
- Diluir el reactivo de detección de ATP con la dilución de ATP en una proporción de 1: 5, como búfer de detección de ATP.
- Preparar la determinación de la curva estándar: diluir los 0,5 mM de la solución estándar DE ATP a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 m por búferes de lylisis ATP.
- Añadir 100 l de tampón de detección de ATP en una placa de 96 pocillos durante 5 minutos en RT, y añadir 100 l de sobrenadante de celda, detectar por un luminómetro (detector de quimiuminescencia). Calcular la concentración de ATP (nmol/L) a través de la curva estándar.
- Detecte la concentración de proteínas mediante un kit de ensayo de proteína bCA con lector multimodo.
- Preparación de la determinación de la curva estándar: diluir los 5 mg/ml de la solución estándar proteica a 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 mg/ml por agua destilada doble.
- Añadir 1 l de sobrenadante de célula en una placa de 96 pocillos y añadir 19 l de agua destilada doble.
- Agregue 200 l de soluciones de detección de BCA para cada pocól. Incubar a 37oC durante 30 min. Detecte el valor OD (densidad óptica) mediante un lector multimodo con 562 nm. Calcular la concentración de proteína (mg/ml) a través de la curva estándar.
- Corrija el contenido de ATP por concentración de proteína mg (unidad: concentración de ATP/concentración de proteínas, nmol/mg).
4. Evaluación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por JC-1
- Recoger células HepG2 sembradas en placas de 6 pozos. Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo EP de 1,5 ml, centrífuga a 1000 x g durante 3 min, deseche el sobrenadante y recoja las células.
- Añadir 50 l de JC-1 (200X) a 8 ml de agua destilada al vórtice y mezclar. Agregue 2 ml de tampón de tinción JC-1 (5X) como solución de detección JC-1.
- Incubar células con una mezcla de 0,5 ml de medio de cultivo celular y 0,5 ml de solución de detección JC-1 durante 20 min a 37oC.
- Centrifugar a 600 x g durante 3 min a 4oC. Deseche el sobrenadante.
- Enjuagar en 2 cambios de 1 ml de tampón de teñido JC-1 (1X), centrífuga a 600 x g durante 3 min a 4oC. Y desecha el sobrenadante.
- Suspenda las células en 0,5 ml del tampón de teñido JC-1 (1X), analice a través de la citometría de flujo para detectar la fluorescencia verde y roja. Cuando se detecte el polímero JC-1, ajuste la luz de excitación a 490 nm y la luz de emisión a 530 nm. Cuando se detecte el polímero JC-1, ajuste la luz de excitación a 525 nm y la luz de emisión a 590 nm.
5. Mediciones de las tasas de consumo de oxígeno (OCR)
- Células HepG2 de semilla en microplacas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 4500 células/100 l por pozo. Asegurar las células cubiertas con cada pozo después de 24 h.
- Añadir el volumen adecuado de los reactivos preparados en el puerto de inyección adecuado, según la documentación anterior13. Puerto A: 25 l 1 m de oligomicina (acoplador ATP); Puerto B: 25 l 0,75 m de FCCP (Control Electrónico del Acelerador, Acelerador ETC); Puerto C: 25 l 0,5 de antimicina A/rotenona (inhibidor mitocondrial A e inhibidor mitocondrial B).
- Conservar el cartucho en una incubadora de 37oC sinCO2 hasta que esté listo para usar.
- Realice un cambio medio de la placa celular quitando el medio de funcionamiento de cada pozo y añadiendo al nuevo DMEM. El volumen final para cada pozo es de 180 l.
- Conservar la placa celular en una incubadora de 37oC sinCO2 durante 1 h antes del ensayo.
- Registre OCR automáticamente por software.
- Abra el software OCR.
- Elija Cell Mito Stress Test Kit en el menú desplegable Apps.
- Haga clic en el botón Iniciar aplicación.
- Haga clic en el botón Ejecutar prueba de esfuerzo. Aparece la pantalla Configuración de la prueba de tensión celular.
- Siga estos pasos:
- Ingrese el número de celdas sembradas por pozo en el cuadro Siembra de celdas.
- Introduzca el OCR promedio en el cuadro OCR basal promedio.
- Introduzca la concentración de trabajo final para cada reactivo e inyecte los reactivos.
NOTA: El valor medio de OCR basal para la célula debería haberse detectado antes de ejecutar el ensayo de optimización al optimizar la concentración de siembra celular. - Haga clic en el botón Siguiente. Aparece la pantalla de información del grupo.
- Asigne un grupo a los pozos sin asignar eligiendo un color y dando un nombre, y luego haciendo clic en los pozos apropiados.
NOTA: Los diferentes grupos se definen como diferentes tratamientos antes de la ejecución de la Prueba de Estrés De Cell Mito. Todos los pozos de microplacas recibirán las mismas inyecciones de reactivos cuando se ejecute la prueba de esfuerzo. - Haga clic en el botón Siguiente. Aparece la pantalla Diseño de inyección de prueba de tensión.
- Haga clic en Inicio. La prueba de esfuerzo ahora se ejecuta en el analizador. Cuando termine la ejecución, siga el punto s del software, retire y deseche el cartucho y la placa de celda.
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Representative Results
Las mitocondrias cristae de las células de HepG2 expuestas a la HCH fueron marcadamente dañadas. Las mitocondrias dispersas fueron levemente expandidas, de forma irregular, y la cresta mitocondrial desapareció con una arquitectura mitocondrial relativamente anormal (Figura 1).
Intensidad media de fluorescencia verde mitocondrial, que representa las mitocondrias, disminución en las células de HepG2 expuestas a la -HCH(Figura 2),así como en los niveles de ATP (Figura 3). La intensidad de la fluorescencia y el nivel de ATP disminuyeron gradualmente con el aumento de las concentraciones de exposición. Potencialmente, la reducción en el número de mitocondrias, o mitocondrias dañadas, causó la intensidad de fluorescencia mitocondrial observada, y en consecuencia la reducción de la producción de ATP.
Los resultados de la citometría de flujo demostraron que las proporciones de fluorescencia JC-1 roja/verde en el grupo HCH eran significativamente más bajas que en el control (Figura 4). El OCR de las células de HepG2 se redujo de manera dependiente de la dosis después de la exposición a HCH. En comparación con el grupo de control, las tasas de respiración basal, la fuga de protones, la capacidad respiratoria máxima y la rotación de ATP se redujeron significativamente en las células HepG2 expuestas a laFigura 5. Estos resultados indicaron que la función mitocondrial se deterioró después de la exposición a HCH.
Todos los instrumentos utilizados en estos experimentos se mostraron en la Figura Suplementaria 1.
Figura 1: Micrografías TEM representativas de las células de HepG2 expuestas a la HCH (A: 6000o, B: 25000o). Los daños típicos mostraron mitocondrias ligeramente agrandadas (M), matrices de electrones-lucentes, cristae dañadas y brechas sueltas de orgánulos. M: mitocondrias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Detección de fluorescencia mitocondrial en células HepG2 tratadas con é-HCH13. La cantidad, ubicación e intensidad de fluorescencia de las mitocondrias (A) se mostraron en imágenes microscópicas de fluorescencia y los niveles cuantitativos de intensidad de fluorescencia mitocondrial se basaron en fluorescentes de color verde mitocondrial por célula (B). *: P < 0.05, ***: P < 0.001 en comparación con el control. Cada punto de datos fue la media de SEM de tres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Niveles de ATP en las células de HepG213. ***: P < 0.001 en comparación con el control, P < 0.01 en comparación con 10 ng/mL -HCH.Data se presentaron como la media de SEM de tres experimentos separados. P Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos sobre MMP por tinción JC-1 y citometría de flujo13. (A) Gráficas de citometría de flujo. El eje Y mostró la relación entre fluorescencia roja y verde. PE: Fluorescencia roja, FITC: fluorescencia verde. (B).**: P < 0,01 en comparación con el control. Cada punto de datos fue la media de SEM de tres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Detección de la tasa de consumo de oxígeno celular (OCR). (A) El analizador de flujo extracelular midió el efecto de la O-HCH en el OCR celular. Los cuatro períodos representan la tasa de respiración basal celular, la tasa inhibida por ATP sintasa, la tasa máxima desacoplada y la tasa inhibida por rotenona o antimicina-A. (B) Histogramas cuantitativos de los resultados de OCR para la línea de base, fuga de protones, capacidad respiratoria máxima, rotación de ATP y capacidad de reserva. *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001 en comparación con el control. Cada punto de datos fue la media de SEM de tres experimentos separados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Todos los instrumentos utilizados en los protocolos. (A) Microscopía electrónica de transmisión. (B) Microscopio confocal de escaneo láser. (C) Luminómetro. (D) Lector multimodo. (E) Citometría de flujo. (F) Analizador de flujo extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Crítico para el éxito del protocolo de detección es el uso de una variedad de métodos experimentales que se han cubierto el estudio desde el fenotipo hasta el mecanismo. En este estudio, las células HepG2 se cultivaron en DMEM con penicilina y estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Cuando las células alcanzaron el 40-50% de confluencia, se añadieron e incubaron los HCH (0, 10, 100 ng/ml) durante 24 h. En primer lugar, utilizamos TEM que mostró los cambios ultraestructurales en el hepatocito causados por los OCP representativos, hCH, mostrando el deterioro de la estructura de las mitocondrias (Figura 1). Además, se realizaron ensayos de tinción fluorescente (Figura 2),ensayo de ATP de luciferasa-luciferina (Figura 3), Ensayo JC-1 (Figura 4) y ensayo de prueba de estrés mito celular (Figura 5),que comúnmente evalúan la disfunción de las mitocondrias. Estos resultados sirven de base para la investigación de los mecanismos moleculares subyacentes.
En los métodos anteriores, los investigadores deben prestar atención a las precauciones en algunos pasos. Por ejemplo, en la preparación de células de microscopía electrónica, se debe prestar atención al número de células, con el fin de evitar una fijación deficiente causada por tejido demasiado grande o bloqueo celular. 5% glutaraldehído actúa como fijador, es mejor no almacenar más de medio año para evitar fallos de detección. Las muestras fijas se colocan a 4 oC durante 24 h o hasta 1 mes antes del siguiente paso. El tinte fluorescente verde mitocondrial es fácil de apagar, y se debe evitar la luz para ralentizar el temple de fluorescencia. En el ensayo de niveles de ATP celular, cuando se utiliza un luminómetro multifuncional que puede detectar quimiuminescencia, pizarra opaca o pizarra de 96 pozos placas deben utilizarse para evitar la interferencia mutua entre agujeros adyacentes. ATP, específicamente escote de ATP en la muestra no es estable a temperatura ambiente, y el experiencia debe ser operado a 4 oC o en hielo. ATP puede ser estable en hielo hasta 6 h. En la preparación de la solución de detección JC-1, se puede añadir el tampón de tinción JC-1 (5X) después de que el JC-1 (200X) se disuelva completamente y se mezcle con el agua ultrapura, de modo que la solución de detección JC-1 sea fácil de disolver por completo. La sonda JC-1 debe cargarse y lavarse en un plazo de 30 minutos y guardarse a 4 oC o hielo para completar la prueba de seguimiento. En las mediciones de OCR, el valor medio de OCR basal para la célula debe detectarse antes del ensayo de optimización, al optimizar la concentración de siembra celular.
Hay algunas limitaciones de estos métodos. La medición de OCR por un analizador de flujo extracelular se limita a experimentos celulares. La detección de la función mitocondrial no es lo suficientemente profunda ya que los productos metabólicos por las mitocondrias no se miden, como la medición de ácidos grasos y metabolitos en ciclos de TCA en hepatocitos. Además, la expresión de genes y proteínas con respecto a la síntesis y degradación de ácidos grasos hepáticos podría detectarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y la mancha occidental, lo que puede confirmar aún más los trastornos moleculares del metabolismo de los ácidos grasos y la disfunción mitocondrial13. Las imágenes digitales de las mitocondrias se pueden capturar en células vivas bajo microscopía confocal y analizarse en busca de cambios en la morfología mitocondrial en función de los valores del factor de forma (FF) y de la relación de aspecto (AR). La función metabólica de las mitocondrias también se evaluó midiendo la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando un analizador bioenergético14. Algunos anticuerpos marcadores mitocondriales (citocromo c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA y STAT3) se pueden medir por la mancha occidental4,15,16,17. Las actividades de las enzimas que respetan la función mitocondrial y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), como la deshidrogenasa mábica, la succinato deshidrogenasa, la citrato sintasa, la ATPasa, la isocitrato deshidrogenasa y la cetoglutarato deshidrogenasa están evidenciadas18. La función de la cadena de transporte de electrones en las células y en las mitocondrias hepáticas aisladas se detecta mediante respirometría de alta resolución19.
Nuestros protocolos se centran en la detección de morfología mitocondrial, estructura, ubicación, cantidad, capacidad, potencial de membrana y función de la cadena respiratoria. Estos son básicamente capaces de evaluar la función mitocondrial de diferentes aspectos. Además, estos métodos son simples y fáciles de operar. Los estudios de la función mitocondrial se han realizado ampliamente en diferentes áreas, como hígado20,microbiota intestinal21,células madre pluripotentes22,y en algunas enfermedades comunes, como tipo 2 diabetes23,enfermedad de Parkinson24 y enfermedad inflamatoria intestinal25. Puede haber más enfermedades asociadas con las mitocondrias, y nuestros protocolos pueden ser útiles en la investigación de los mecanismos pertinentes. Además, también se necesita un mayor trabajo empírico en la escala global y profunda de estos efectos con métodos más experimentales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 81573174, 81570574); el Fondo Para la Juventud Sobresaliente de la Provincia de Jiangsu (SBK2014010296); el Proyecto de Investigación del Ministerio de Educación de China (213015A); el Desarrollo prioritario del Programa Académico de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD), el desarrollo principal emblemático de las instituciones de educación superior de Jiangsu; y el Programa de Proyectos Abiertos del Laboratorio Estatal clave de Química Ambiental y Ecotoxicología (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
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