Summary
Comprendere l'influenza dei pesticidi organoclori ambientali (OC) sulla funzione mitocondriale negli epariti è importante per esplorare il meccanismo degli OC Che causano disturbi metabolici. Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico.
Abstract
Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico per comprendere meglio la causa dei disturbi metabolici causati dai pesticidi organoclori ambientali (OOC) negli epatociti. Le cellule di HepG2 sono state esposte β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) per 24 h ad una dose equivalente di esposizione interna nella popolazione generale. L'ultrastruttura negli eparociti è stata esaminata dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per mostrare il danno dei mitocondri. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale della membrana mitocondriale (MMP) nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. L'intensità della fluorescenza dei mitocondri dopo essere stata osservata con una microscopia a fluorescenza verde mitocondriale è stata osservata con una microscopia a fluorescenza. La reazione luciferina-luciferasi è stata utilizzata per determinare i livelli ATP. L'MMP è stato rilevato dal colorante cationico JC-1 e analizzato sotto la citometria di flusso. L'OCR è stato misurato con un analizzatore di flusso extracellulare. In sintesi, questi protocolli sono stati utilizzati nel rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti con per indagare sui danni dei mitocondri.
Introduction
Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l'interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentementestudiati 1,2,3. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l'invecchiamento, l'obesità, il diabete, la funzione cardiovascolare, il cancro e la tossicità di sicurezza4,5,6,7. In questo articolo, descriviamo i metodi per valutare la disfunzione mitocondriale causata da OCP.
Abbiamo esposto le cellule DiPG2 a β-esachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP rappresentativo, per 24 h ad una dose equivalente all'esposizione interna dell'uomo. In primo luogo, TEM è stato applicato per osservare l'ultrastruttura degli epariti, come nuclei, mitocondri e endoplasmice reticulum8. Rispetto ai normali microscopi, TEM consente di esplorare l'ultrastruttura 2D e 3D di cellule e componenti cellulari (linee cellulari o tessuti), la morfologia, la composizione chimica, nonché la funzione di materiali naturali o artificiali che svolgono un ruolo fondamentale nella scienza e nella tecnologia moderne. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale di membrana mitocondriale (MMP)nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. Mito-tracker green è una sonda fluorescente verde mitocondri che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente specifica mitocondriale a cellule vive. I mitocondri negli eparociti sono stati macchiati da soluzione verde mito-tracker e intensità di fluorescenza mitocondriale, numero e modello sono stati osservati con una microscopia confocale9. La sonda fluorescente verde mitocondriale può essere utilizzata per macchiare le cellule vive. Rispetto alla rodamina 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondriale non dipende dal potenziale di membrana mitocondriale per la colorazione mitocondriale. I livelli di ATP sono stati determinati da un kit luciferasi-luciferina e normalizzati dalla concentrazione di proteine. Kit di analisi ATP può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP in soluzioni comuni, cellule o tessuti. Questo kit si basa sulla luciferasi luccilice catalizzato dalla fluoresina per generare fluorescenza, quando l'ATP è necessario per fornire energia. Quando la luccilice luciferasi e la fluoresina sono eccessive, in un certo intervallo di concentrazione, la generazione di fluorescenza è proporzionale alla concentrazione di ATP. Inoltre, questo kit è stato appositamente progettato per ottimizzare la chemiluminescenza di ATP. L'ATP, come le molecole energetiche più importanti, svolge un ruolo importante nei vari processi fisiologici o patologici delle cellule. I cambiamenti nei livelli ATP possono riflettere i difetti nella funzione cellulare, in particolare la produzione di energia mitocondriale. Di solito sotto apoptosi, necrosi o in qualche stato tossico, i livelli di ATP cellulare ridotto 10. Il kit di analisi MMPs con JC-1 è un kit che utilizza JC-1 come sonda fluorescente per rilevare cellule, tessuti o MMP purificati in modo rapido e sensibile. Può essere utilizzato per la diagnosi precoce di apoptosi. Il colorante cationico JC-1 è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare l'MMP che può essere analizzata sotto la citometria di flusso indicata dai cambiamenti del rapporto di fluorescenza verde e rossa. Quando l'MMP è alto, JC-1 viene aggregato nella matrice dei mitocondri per formare un polimero (J-aggregati), che produce fluorescenza rossa. Quando l'MMP è basso, JC-1 non può accumularsi e forma monomero che produce fluorescenza verde11. Quindi il rapporto tra fluorescenza rossa e verde può riflettere il livello di MMP. L'OCR delle cellule è un indicatore cruciale della normale funzione cellulare12. È considerato come un parametro per la ricerca della funzione mitocondriale. Cell mito stress test kit fornisce un metodo stabile per l'analisi dei parametri chiave della funzione mitocondriale. Il kit fornisce il controllo di qualità e reagenti predittivi, nonché un metodo standard per l'esecuzione di test di stress mitocondriale cellulare. Può essere utilizzato per rilevare tutti i tipi di cellule, comprese le cellule primarie, linee cellulari, cellule sospese, e anche per isolotti, nematodi, lieviti e mitocondri isolati.
La misurazione OCR può fornire preziose informazioni sullo stato fisiologico o sulle alterazioni delle cellule. È stato determinato con un analizzatore di flusso extracellulare per rilevare la linea di base respiratoria, la perdita di protoni, il massimo respiratorio, il turnover ATP e la capacità di riserva. In breve, dopo le misurazioni di base di OCR, OCR è stato rilevato dopo l'aggiunta sequenziale a oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilazione ossidativa mitocondriale) per pozzo.
Nel tentativo di facilitare lo sviluppo di un protocollo più specifico per rilevare la funzione mitocondriale negli eparociti in vitro, presentiamo qui esperimenti di TEM, microscopia confocale, luminometro, citometria di flusso e analizzatore di flusso extracellulare con futura applicazione nello studio dei danni ai mitocondri relativi agli esiti avversi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti e i protocolli dell'esperimento sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e approvati dal Comitato Etico locale dell'Università di Medicina di Nanjing.
1. Ultrastruttura mitocondriale di TEM
- Raccolta di celle HepG2
- Seme Cellule HepG2 in piatti da 100 mm. Conservare a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
- Digerire le cellule con 0,25% EDTA in tubo 1,5 mLEP.
- Centrifuga a 1000 x g per 3 min a temperatura ambiente (RT). Scarta il supernatant.
- Raccogli 4-6 x 105 cellule HepG2.
- Aggiungere 1 mL di glutaraldeide del 5% (Solvente: acqua doppia distillata) con pipette e incubare a 4oC per 2 h.
- Aggiungere e lavare in 4 cambi di 1 mL di tampone fosfato (contenente Na2HPO4, KH2PO4, NaCl e KCl, pH 7.4), 15 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato con pipette.
- Aggiungere 200 m di osmio dell'1% (Solvente: acqua doppia distillata) e incubare a 4 s per 2 h al campione nero.
Attenzione: L'osmio è una sostanza altamente tossica e volatile. Dovrebbe essere operato con attenzione nell'armadietto della droga. - Aggiungere e lavare in 2 cambi di 1 mL di tampone di fosfato, 5 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato.
- Macchia nella soluzione di acetato di uranil al 2% (Solvente: acqua doppia distillata e acido acetico) in tubo EP da 1,5 mL per 2 h.
- Disidratare e immergere attraverso il 50% di acetone, 70% acetone, 90% di acetone (Solvente: doppia acqua distillata), 2 cambi di acetone assoluto, 15 min ciascuno.
- Penetrare in 2 gocce di acetone (100%)/agente di incorporamento (1:1) per 1,5 h a RT. Epon812 agente di incorporamento, la ricetta è la seguente: A: Epon812, 62 mL e DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL e MNA 89 mL. A:B-2:8 (v:v, in inverno), A:B'1:9 (v:v, in estate). Incorporamento in stampi di incorporamento (piastra di plastica morbida con griglia a scacchi).
- Incubare in sequenza a 37 gradi centigradi per 12 h, 45 gradi centigradi per 12 h, e poi 60 gradi per 48 h.
- Preparare e osservare le sezioni ultrasossine (l'area più grande non può superare 0,5 mm e 0,3 mm) con la macchina delle sezioni ultrasossive e TEM (2 m e 500 nm).
2. Rilevamento dell'intensità della fluorescenza mitocondriale
- Seme 2x 104 Cellule HepG2 in piastre a 6 well. Aggiungere β-HCH per 24 h.
- Aggiungere un DMSO anidrosio per formulare una concentrazione finale di sonda fluorescente verde mitocondriale da 1 mM.
- Aggiungere la soluzione di sonda fluorescente verde mitocondriale 1 mL (concentrazione finale: 200 nM) ad ogni pozzo di piastre da 6 pozzetti, incubare a 37 gradi centigradi per 45 min.
- Rimuovere la soluzione della sonda fluorescente verde mitocondriale e aggiungere il mezzo di coltura cellulare (DMEM) appena preparato a 37 gradi centigradi prima dell'imaging.
- Osservare la fluorescenza verde mitocondriale con un microscopio a fluorescenza (10x). La lunghezza d'onda massima di eccitazione al rilevamento è di 490 nm e la lunghezza d'onda massima di emissione è di 516 nm.
3. Analisi dei livelli ATP cellulari
- Seme Cellule HepG2 in piastre 6-pozzo. Aggiungere β-HCH per 24 h.
- Aggiungere 200 tamponi di lysis dal kit di analisi ATP lucifera-luciferin ad ogni pozzo di piastre a 6 gradi. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, raccogliere il supernante con le pipette in nuovi tubi.
- Diluire il reagente di rilevamento ATP con la diluizione ATP con un rapporto di 1: 5, come buffer di rilevamento ATP.
- Preparare la determinazione della curva standard: diluire 0,5 mM della soluzione standard ATP a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 M dai buffer di lysi ATP.
- Aggiungere 100 L di buffer di rilevamento ATP in una piastra da 96 pozzetti per 5 min a RT, e aggiungere 100 L di supernatant della cellula, rilevate da un luminometro (rilevatore di chemiluminescenza). Calcolare la concentrazione ATP (nmol/L) attraverso la curva standard.
- Rileva la concentrazione proteica da un kit di analisi delle proteine BCA con lettore multimodo.
- Preparazione della determinazione della curva standard: diluire il 5 mg/mL della soluzione standard proteica a 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL con acqua doppia distillata.
- Aggiungere 1 L di supernatant di cellule in una piastra da 96 po 'e aggiungere 19 L di acqua doppia distillata.
- Aggiungere 200 soluzioni di rilevamento BCA per ogni pozzo. Incubate a 37 gradi centigradi per 30 min. Rilevare il valore OD (densità ottica) da un lettore multimodo con 562 nm. Calcolare la concentrazione di proteine (mg/mL) attraverso la curva standard.
- Correggere il contenuto ATP per concentrazione di proteina mg (unità: concentrazione ATP/concentrazione proteica, nmol/mg).
4. Valutazione del potenziale della membrana mitocondriale (MMP) da parte di JC-1
- Raccogliere le cellule HepG2 semitesse in piastre di 6 pozzo. Digerire le cellule con 0,25% EDTA nel tubo EP da 1,5 mL, centrifugare a 1000 x g per 3 min, scartare il supernante e raccogliere le cellule.
- Aggiungere 50 L di JC-1 (200X) a 8 mL di acqua distillata al vortice e mescolare. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione delle macchie JC-1 (5X) come soluzione di rilevamento JC-1.
- Incubare le cellule con una miscela di 0,5 mL di coltura cellulare media e 0,5 mL di soluzione di rilevamento JC-1 per 20 min a 37 gradi centigradi.
- Centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. Scarta il supernatant.
- Risciacquare in 2 cambi di 1 mL di tampone di tintura JC-1 (1X), centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. E scartare il supernante.
- Sospendere le cellule in 0,5 mL di buffer di tintura JC-1 (1X), analizzare tramite citometria di flusso per rilevare la fluorescenza verde e rossa. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 490 nm e la luce di emissione su 530 nm. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 525 nm e la luce di emissione su 590 nm.
5. Misure dei tassi di consumo di ossigeno (OCR)
- Seme cellule HepG2 in microplacchi di coltura cellulare di 96-pozzo ad una densità di 4500 cellule / 100 L per pozzo. Assicurarsi che le cellule siano coperte con ogni pozzo dopo 24 h.
- Aggiungere il volume appropriato dei reagenti preparati nella porta di iniezione appropriata, secondo la precedente letteratura13. Porta A: 25 L 1 M di oligomicina (ATP Coupler); Porta B: 25 L 0,75 M di FCCP (Controllo elettronico della limitazione, etc acceleratore); Porta C: 25 L 0,5 di antimicina A/rotenone (inibitore mitocondriale A e inibitore mitocondriale B).
- Conservare la cartuccia in un'incubatrice a 37 gradi centigradi senza CO2 fino a quando non è pronta per l'uso.
- Apportare una modifica media della piastra cellulare rimuovendo il supporto di corsa da ogni pozzo e aggiungendo al nuovo DMEM. Il volume finale per ogni pozzo è di 180 L.
- Conservare la piastra cellulare in un'incubatrice di 37 gradi centigradi senza CO2 per 1 h prima del saggio.
- Registrare automaticamente l'OCR tramite software.
- Aprire il software OCR.
- Scegliere Cell Mito Stress Test Kit nel menu a discesa App.
- Fare clic sul pulsante Avvia app.
- Fare clic sul pulsante Esegui test di stress. Viene visualizzata la schermata Impostazione test stress cella.
- Effettuare le seguenti operazioni:
- Immettere il numero di celle di cui viene il seeding per pozzo nella casella Semina cella.
- Immettere l'OCR medio nella casella OCR basale medio.
- Immettere la concentrazione di lavoro finale per ogni reagente e iniettare i reagenti.
NOTA: il valore OCR basale medio per la cella avrebbe dovuto essere rilevato prima di eseguire il test di ottimizzazione durante l'ottimizzazione per la concentrazione di seeding delle celle. - Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata delle informazioni di gruppo.
- Assegnare un gruppo ai pozzetti non assegnati scegliendo un colore e assegnando un nome, quindi facendo clic sui pozzetti appropriati.
NOTA: I diversi gruppi sono definiti come diversi trattamenti prima dell'esecuzione del Test di Stress Mito Cellulare. Tutti i pozzi di microplaline ottengono le stesse iniezioni di reagente quando viene eseguito il test di stress. - Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata Layout iniezione test di stress.
- Fare clic su Start. Il test di stress viene ora eseguito sull'analizzatore. Quando la corsa è finita, seguire il punto s nel software, rimuovere e scartare la cartuccia e la piastra cellulare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I mitocondri di cellule HepG2 esposte a β-HCH sono stati notevolmente danneggiati. I mitocondri sparsi erano leggermente espansi, di forma irregolare, e la cresta mitocondriale scomparve con un'architettura mitocondriale relativamente anormale (Figura 1).
Intensità media di fluorescenza verde mitocondriale, che rappresenta i mitocondri, diminuita nelle cellule HepG2 esposte a β-HCH (Figura 2), così come nei livelli ATP (Figura 3). L'intensità della fluorescenza e il livello ATP sono diminuiti gradualmente con l'aumento delle concentrazioni di esposizione. Potenzialmente, la riduzione del numero di mitocondri, o mitocondri danneggiati, ha causato l'intensità di fluorescenza mitocondriale osservata, e di conseguenza la produzione ridotta di ATP.
I risultati della citometria di flusso hanno dimostrato che i rapporti di fluorescenza JC-1 rosso/verde nel gruppo β-HCH erano significativamente inferiori a quelli del controllo (Figura 4). L'OCR delle cellule Di HepG2 è stato ridotto in modo dipendente dalla dose dopo β-HCH. Rispetto al gruppo di controllo, i tassi di respirazione basale, la perdita di protoni, la capacità respiratoria massima e il fatturato ATP sono stati significativamente diminuiti nelle cellule HepG2 esposte al β-HCH (Figura 5). Questi risultati hanno indicato che la funzione mitocondriale è stata compromessa dopo β-HCH.
Tutti gli strumenti utilizzati in questi esperimenti sono stati mostrati nella Figura supplementare 1.
Figura 1: Micrografie rappresentative TEM delle cellule HepG2 esposte β-HCH (A: 6000, B: 25000). I danni tipici mostravano mitocondri leggermente ingranditi (M), matrici elettrone-lucenti, cristae danneggiate e lacune di organelli sciolti. M: mitocondri. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento della fluorescenza mitocondriale nelle cellule HepG2 trattate con β-HCH13. La quantità, la posizione e l'intensità della fluorescenza dei mitocondri (A) sono state mostrate in immagini microscopiche di fluorescenza e i livelli quantitativi di intensità della fluorescenza mitocondriale erano basati sul fluorescente verde mitocondriale per cellula (B). P < 0,05, P < 0,001 rispetto al controllo. Ogni punto dati era la media , SEM di tre esperimenti separati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli ATP nelle celleHepG2 13. . . . . . . . P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti sulla colorazione e la citometria di flusso di MMP da partedi JC-113. (A) Trame di citometria di flusso. L'asse Y ha mostrato il rapporto tra fluorescenza rossa e verde. PE: Fluorescenza rossa, FITC: fluorescenza verde. (B). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ogni punto dati era la media , SEM di tre esperimenti separati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rilevamento del tasso di consumo di ossigeno cellulare (OCR). (A) L'effetto β-HCH sull'OCR cellulare è stato misurato dall'analizzatore di flusso extracellulare. I quattro periodi rappresentano il tasso di respirazione basale cellulare, tasso inibito ATP-synthase, tasso massimo disaccoppiato, e rotenone-o tasso antimicina-A-inibito. (B) Istogrammi quantitativi dei risultati dell'OCR per la linea di base, la perdita di protoni, la capacità respiratoria massima, il fatturato ATP e la capacità di riserva. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001 rispetto al controllo. Ogni punto dati era la media , SEM di tre esperimenti separati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Tutti gli strumenti utilizzati nei protocolli. (A) Microscopia elettronica di trasmissione. (B) Microscopi confocale a scansione laser. (C) Luminometro. (D) Lettore multimodo. (E) Citometria di flusso. (F) Analizzatore di flusso extracellulare. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fondamentale per il successo del protocollo di rilevamento è l'uso di una varietà di metodi sperimentali che sono stati trattati lo studio dal fenotipo al meccanismo. In questo studio, le cellule Dicale sono state colturate in DMEM con penicillina e streptomicina e siero bovino fetale al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) sono stati aggiunti e incubati per 24 h. In primo luogo abbiamo usato TEM che ha mostrato i cambiamenti ultrastrutturali nell'eparitocita causati dai PPI rappresentativi, β-HCH, che mostrano la compromissione della struttura dei mitocondri (Figura 1). Inoltre, sono stati eseguiti il saggio di colorazione fluorescente (Figura2),l'analisi ATP lucifera-luciferina (Figura3),il saggio JC-1 (Figura 4)e l'analisi del test di stress mito cellulare (Figura5). Questi risultati servono come base per lo esame dei meccanismi molecolari sottostanti.
Nei metodi di cui sopra, gli investigatori dovrebbero prestare attenzione alle precauzioni in alcuni passaggi. Ad esempio, nella preparazione di cellule di microscopia elettronica, il numero di cellule dovrebbe essere prestato attenzione, al fine di evitare una cattiva fissazione causata da tessuto troppo grande o blocco cellulare. 5% glutaraldeide agisce come un fissativo, è meglio non memorizzare più di metà anno in modo da evitare il fallimento del rilevamento. I campioni fissi sono collocati a 4 gradi centigradi per 24 h o fino a 1 mese prima della fase successiva. Il colorante fluorescente verde mitocondriale è facile da placare e la luce dovrebbe essere evitata per rallentare il disseccamento della fluorescenza. Nei livelli di ATP cellulari, quando si utilizza un luminometro multifunzionale in grado di rilevare la chemiluminescenza, la lavagna opaca o la lavagna a 96 pozzetti devono essere utilizzati per evitare interferenze reciproche tra fori adiacenti. L'ATP, in particolare la scissione dell'ATP nel campione non è stabile a temperatura ambiente, e l'esperienza deve essere azionata a 4 gradi centigradi o su ghiaccio. ATP può essere stabile sul ghiaccio per un massimo di 6 h. Nella preparazione della soluzione di rilevamento JC-1, il buffer di colorazione JC-1 (5X) può essere aggiunto dopo che il JC-1 (200X) è completamente disciolto e mescolato con l'acqua ultrapura, in modo che la soluzione di rilevamento JC-1 sarà facile da sciogliere completamente. La sonda JC-1 deve essere caricata e lavata entro 30 minuti e salvata a 4 gradi centigradi o ghiaccio per completare il test di follow-up. Nelle misurazioni OCR, il valore OCR basale medio per la cella deve essere rilevato prima del test di ottimizzazione, quando si ottimizza per la concentrazione di seeding delle cellule.
Esistono alcune limitazioni di questi metodi. La misurazione OCR da parte di un analizzatore di flusso extracellulare è limitata agli esperimenti cellulari. La rilevazione della funzione mitocondriale non è abbastanza profonda poiché i prodotti metabolici dei mitocondri non vengono misurati, come la misurazione degli acidi grassi e dei metaboliti nei cicli TCA negli epatociti. Inoltre, l'espressione di geni e proteine per quanto riguarda la sintesi e la degradazione degli acidi grassi epatici potrebbe essere rilevata dalla reazione a catena della polimerasi in tempo reale e dalla macchia occidentale, che può confermare ulteriormente i disturbi molecolari del metabolismo degli acidi grassi e della disfunzione mitocondriale13. Le immagini digitali dei mitocondri possono essere catturate in cellule viventi sotto microscopia confocale e analizzate per i cambiamenti della morfologia mitocondriale in base ai valori del fattore di forma (FF) e delle proporzioni (AR). La funzione metabolica dei mitocondri è stata valutata anche misurando il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) utilizzando un analizzatore bioenergetico14. Alcuni anticorpi marcatore mitocondriale (citocromo c, HSP60, PHB1, SOD1, VDCA e STAT3) possono essere misurati da western blot4,15,16,17. Le attività degli enzimi che rispettano la funzione mitocondriale e il ciclo dell'acido tricarboxylico (TCA), come la diidrogena malica, la disidrogenasi succinata, la sintesi del citrato, l'ATPase, la disidrogena isocitrata e la disidrogenasi z-ketoglutarate sono evidetti18. La funzione della catena di trasporto degli elettroni nelle cellule e nei mitocondri epatici isolati viene rilevata utilizzando respirometria ad altarisoluzione 19.
I nostri protocolli si concentrano sul rilevamento della morfologia mitocondriale, della struttura, della posizione, della quantità, della capacità, del potenziale della membrana e della funzione della catena respiratoria. Questi sono fondamentalmente in grado di valutare la funzione mitocondriale da diversi aspetti. Inoltre, questi metodi sono semplici e facili da usare. Studi sulle funzioni mitocondriali sono stati ampiamente condotti in diverse aree, comeil fegato 20, il microbiotaintestinale 21, le cellule staminali pluripotenti22e in alcune malattie comuni, come il diabete di tipo2 23, il morbo di Parkinson24 e la malattia infiammatoriaintestinale 25. Ci possono essere più malattie associate ai mitocondri, e i nostri protocolli possono essere utili nello esame dei meccanismi pertinenti. Inoltre, è necessario un ulteriore lavoro empirico sulla scala completa e approfondita di questi effetti con metodi più sperimentali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); l'Eccezionale Fondo Giovanile della Provincia di Jiangsu (SBK2014010296); il Progetto di Ricerca del Ministero dell'Istruzione cinese (213015A); il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore Jiangsu (PAPD), il flagship major development degli istituti di istruzione superiore Jiangsu; e il Programma Open Project del Laboratorio Chiave di Stato di Chimica Ambientale ed Ecotossicologia (KF2015-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
