Laminar Flow-baseret Assays til at undersøge leukocyt ansættelse på kulturperler vaskulære celler og vedhængende blodplader

Summary

Leukocytter interagere begærligt med vaskulære celler og blodplader efter fartøjet væg skade eller under betændelse. Her, beskriver vi en ligetil laminar flow-baseret analyse for at karakterisere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem leukocytter og deres cellulære partnere.

Abstract

Ansættelse af leukocytter efter skade eller betændelse til steder af skade eller vævsskade er blevet undersøgt i løbet af de seneste årtier og har resulteret i begrebet leukocyt adhæsion cascade. Men de præcise molekylære mekanismer involveret i leukocyt rekruttering har endnu ikke blevet fuldt ud identificeret. Da leukocyt rekruttering er stadig et vigtigt emne i feltet af infektion, inflammation og (auto-) immune forskning, præsenterer vi en enkel laminar flow-baseret analyse at studere underliggende mekanismer af vedhæftning, nedtrapning vedhæftning, og transmigration af leukocytter under venøse og arterielle flow regimer. In vitro- analysen kan bruges til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem leukocytter og deres cellulære partnere i forskellige modeller af vaskulære betændelse. Denne protokol beskriver en laminar flow-baseret analyse ved hjælp af en parallel-strømmen kammer og et omvendt fase kontrast mikroskop tilsluttet et kamera til at studere samspillet af leukocytter og endotelceller eller blodplader, som kan visualiseres og indspillede derefter analyseret offline. Endotelceller, blodplader eller leukocytter kan blive forbehandlet med hæmmere eller antistoffer til at bestemme rollen af specifikke molekyler under denne proces. Shear betingelser, dvs arteriel eller venøs shear stress, kan tilpasses nemt af viskositet og strømningshastigheden af de perfused væske og højden af kanalen.

Introduction

Skade, betændelse eller infektion svare leukocytter hurtigt til patogen - eller skade-associeret molekylære mønstre (PAMPs, DAMPs), ændre i en aktiveret tilstand, og flytte ud af blodet til lokaliteter af betændelse og vævsskader. Leukocytter evne til at interagere med deres cellulære og molekylære miljø er afgørende for deres korrekte funktion som immunceller, som fremhævet af genetiske sygdomme såsom leukocyt adhæsion mangel¹. Leukocyt adhæsion har været genstand for intense undersøgelser i løbet af de seneste årtier, og dette har resulteret i begrebet leukocyt adhæsion kaskade i de tidlige 1990s^2,3. Leukocyt adhæsion initieres selectin-medieret tilfangetagelsen af leukocytter til endotelet, forårsager celler til at rulle over den vaskulære overflade. Denne rullende gør det muligt for leukocytter at scanne for endotel-bundet vandrende stikord, fx, kemokiner, som inducerer aktivering af integriner. Efterfølgende, mægle de aktiverede integriner binding til endotel ligander, hvilket resulterer i fast leukocyt anholdelse. Leukocytter kan efterfølgende forberede extravasate af gennemgang og breder sig, før gennemtrængende i endothelial éncellelag og transmigrating i det underliggende væv. Det grundlæggende koncept for den kanoniske leukocyt kaskade har stort set uændret siden introduktionen, tilsat nogle mellemliggende trin⁴. Ikke desto mindre, de præcise molekylære mekanismer og roller for de mange aktører involveret i leukocyt rekruttering er ikke klarlagt hidtil, og leukocyt rekruttering forbliver et vigtigt emne i feltet af infektion, inflammation, og (auto) immun forskning.

For eksempel steg vaskulære inflammatoriske sygdomme som åreforkalkning, leukocyt rekruttering til fartøj væg drev plaque udvikling. Ustabile aterosklerotisk plaque kan briste, hvilket fører til massive aktivering af trombocytter og koagulation system, og efterfølgende okklusion af fartøjet⁵. Dette kan resultere i alvorlige kardiovaskulære udfald som myokardieinfarkt eller slagtilfælde. Derudover endotel denudation som det opstår klinisk, fx efter stent i en koronararterie, fører til et væld af samspillet af leukocytter og trombocytter til udsatte fartøj væg interiør (f.eks.matrix komponenter og glat muskel celler) og af leukocytter med blodplader dækker den vaskulære skade. Disse interaktioner er vigtigt for den videre udvikling af sygdommen som monocyt-trombocyttal interaktioner kan drive neointima dannelse^6,7. Derudover trombocyt-leukocyt interaktioner medieret af leukocyt integrin Mac-1 (α_Mβ₂) og trombocyttal GPIbα er for nylig blevet identificeret som roman drivere for trombose hos mus⁸.

Givet den bred tilgængelighed af menneskers og dyrs blod som en kilde af leukocytter og trombocytter for forskning, og det brede spektrum af isolerede matrix molekyler og udødeliggjort cellelinjer leukocyt og vaskulær oprindelse, er det muligt at simulere leukocyt interaktioner under flow i et laboratorium indstilling, ved hjælp af specialdesignede flow perfusion kamre. Mange varianter har udformet i de seneste årtier, lige fra vakuum-drevet til selvklæbende perfusion kamre. Alle varianter har til fælles, den immobile del (f.eks., kulturperler vaskulære celler eller matrix proteiner) er samlet i et større lækagesikre kammer udstyret med en pre-defineret kanal aktivering perfusion af væsker over den immobile del. Derudover aktiveret forskud i molding teknologi udvikling af skræddersyede løsninger baseret på silica polymerer⁹. Viskositet og strømningshastigheden af de perfused væske og højden af kanalen bestemmer hovedsagelig shear stress Karakteristik af flow perfusion enhed¹⁰. I denne artikel præsenterer vi en in vitro- metode til at studere underliggende mekanismer af vedhæftning, nedtrapning vedhæftning og transmigration af leukocytter under venøse og arterielle flow regimer. Fordelen ved de metoder, der præsenteres her er at de kan udføres ved hjælp af en fælles kamera tilsluttet fluorescens mikroskop, og kræver ikke en eksperimentatorer til besidder høje tekniske færdigheder. I vitro assay kan manipuleres på mange måder (f.eks.ved at tilføje hæmmere eller blokere antistoffer), og er således gældende i forskellige modeller af vaskulære betændelse og giver mulighed for undersøgelse af adhæsion protein funktioner eller den evaluering af særlige forbindelser.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den medicinske etiske og dyr etiske nævn af Maastricht Universitet.

1. flow-baseret analyse med humane celler

1. Isolering af trombocytter fra humant blod
   1. Trække venøse blod i citrat (3,2%) antikoagulans.
   2. Tilføj 1/15 bind af syre citrat Dextrose (ACD: 80 mM Trinatriumcitrat, 52 mM citronsyre og 183 mM glukose) til blodet.
   3. Der centrifugeres ved 350 x g uden bremse for 15 min at få blodplader rige plasma (PRP).
   4. Overføre supernatanten til en 15 mL konisk slange og tilføje 1/20 bind af ACD.
   5. Der centrifugeres ved 1110 g uden bremse for 15 min at få blodplader fattige plasma (PPP).
   6. Supernatanten. Skåret ud i slutningen af afpipetteres tip (P 1000), gør det brede bore, som støtte i forebyggelse af trombocyt aktivering, og omhyggeligt suspendere trombocyt pellet i den samme volumen som PRP i trombocyttal buffer pH 6.6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,1% bovint serumalbumin og 0,1% glukose). Tilsæt 1/20 bind af ACD og forsigtigt blandes.
   7. Pellet blodplader ved 1110 g uden bremse for 15 min.
   8. Supernatanten og omhyggeligt suspendere blodplader som ovenfor i 1 mL trombocyt buffer (pH 7,5).
   9. Mål koncentrationen af blodplader i en 1/10 fortynding med en automatiseret hæmatologi analyzer.
   10. Justere lydstyrken med trombocyt buffer (pH 7,5) at opnå en optælling af 2 x 10⁷/mL.
2. Isolering af polymorfkernede celler fra humant blod (tilpasset fra Brinkmann et al. ¹¹ )
   1. Tegne 24 mL blod i heparin (10 U/mL) som antikoagulans.
   2. Tilføj 6 mL af 1.077 g/mL tæthed polysucrose-natrium diatrizoate medium (Se Tabel af materialer) til en 15 mL konisk rør, og omhyggeligt lag 5-6 mL fuldblod på toppen.
   3. Der centrifugeres i 20 min. ved 800 x g uden bremse.
   4. Opsug og kassere det klart gullige øverste lag og overføre den lavere rødlige fase indeholdende granulocytter i frisk 15 mL konisk rør. Vaske cellerne ved at tilføje PBS, som indeholder 2 mM EDTA til en endelig mængde 14 mL, og der centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g uden bremse.
   5. I mellemtiden forbereder en tæthed gradient medium (f.eks.percoll, se Tabel af materialer) arbejdsgruppe løsning ved at blande 18 mL tæthed gradient medium med 2 mL 10 x PBS stamopløsning. Fortynde denne brugsopløsning med PBS (1 x) at opnå 4,25 mL hver af 85%, 80%, 75%, 70% og 65% gradient medium løsninger.
   6. Forbered 2 koniske rør med tæthed farveforløb ved lagdeling 2 mL af hvert medium procentdel oven på hinanden. Starte med den højeste koncentration og fortsætte i faldende rækkefølge. Markere lag på røret med en markør, vand-bevis.
   7. Omhyggeligt layer 2 mL af celle suspensioner på hver af de to rede forløb.
   8. Der centrifugeres i 20 min. ved 800 x g uden bremse i en nøje afbalanceret centrifuge.
   9. Efter centrifugering, fjerne det øverste lag og de fleste af 65% lag (første ring) med PBMC, og indsamler i nye rør hvid resterende interphases indtil 85% lag (anden ring, PMN).
   10. Vaske cellerne ved at fylde op rør med PBS 2 mM EDTA, og der centrifugeres i 10 min. ved 300 x g uden bremse.
   11. Fjern supernatanten og suspendere aflejret cellerne (typisk ≥95% er PMN) i 1 mL af Hank's buffer (pH 7,45), der indeholder 10 mM Hepes og 0,2% humant albumin (analysebuffer).
   12. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og suspendere celler på 1 x 10⁶/mL.
   13. Fortsætte med fluorescerende mærkning og perfusion af leukocytter (trin 3.3).
3. Forberedelse af vedhængende trombocyt- og vaskulære celle-encellelag
   1. Celle kultur parabol forberedelse (kulturperler celler)
      1. Pre pels 35 mm celle kultur retter med 1 mL fortyndet rotte hale kollagen (30 µg/mL fortyndet i PBS filtreret over en 0,2 µm filter).
      2. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C, kassere kollagen løsning og vaske parabol en gang med PBS.
   2. Kultur af vaskulære celler i kultur retter
      1. Frigøre primære (f.eks.HUVEC, HAoEC, HAoSMC) eller udødeliggjort vaskulære celler (f.eks., EA. Hy926, SVEC) vokset til sammenløbet i T75 kolbe med 1,5 mL celle detachement løsning (fx, accutase). Tilføje 4,5 mL af passende vækstmediet at neutralisere den celle detachement løsning og bestemme den celle koncentration med en celle tælle kammer. Suspendere celler på 0,5 x 10⁵ celler/mL i passende vækstmediet (f.eks., komplet endotel celle vækstmedium).
      2. Tilsættes 2 mL cellesuspension til hver 35 mm parabol. Kultur celler i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO₂ indtil sammenløbet (tager 24-48 timer, afhængigt af hvilken celle).
   3. Glas coverslip forberedelse (vedhængende blodplader)
      1. Fordyb glas coverslip engang i HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
      2. Skyl coverslip 2 gange i ultrarent vand.
      3. Tørre coverslip under N₂.
      4. Før pelsen glas coverslip med 100 µL i overensstemmelse med holdning af kanal perfusion kammer af fortyndet rotte hale kollagen type I (30 µg/mL fortyndet i PBS filtreret over en 0,2 µm filter).
      5. Inkuber i 30 min. ved RT, kassere kollagen løsning og vaske coverslip 3 x med PBS.
      6. Blok kollagen belagt coverslip med 1% BSA i HEPES til 0,5 h på RT.
      7. Vaske og tørre coverslip og montere den i perfusion kammer. Isolere trombocytter fra menneskelige eller mus blod som beskrevet i trin 1.1 og 2.1, henholdsvis.
   4. Immobilisering af blodplader
      1. Tilføje 70 µL af en 2 x 10⁷/mL trombocyt suspension pr. kanal, og Inkuber i 1,5 timer ved 37 ° C og 5% CO₂.
      2. Omhyggeligt Erstat ikke-tilhænger blodplader med blokerende løsning (5% BSA i HEPES) i mindst 30 min på RT. Fortsæt med fluorescerende mærkning og perfusion af leukocytter (trin 3.3).
   5. Stimulation af vaskulære celle éncellelag
      1. Stimulere de vaskulære celler ved at erstatte mediet med friske medier indeholdende 10 ng/mL tumor nekrose faktor α (TNFα) i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO₂.

2. flow-baseret analyse med Murine celler

1. Isolering af trombocytter fra mus blod
   1. Trække blod af cardiac punktering ved hjælp af en 21 G nål (~ 1 mL) fra bedøvede (ketamin 80 mg/kg og medetomidine 0,3 mg/kg) 6-8 ugers-gamle mus (C57Bl/6) i citrat (3,2%) som antikoagulans.
   2. Tilføj 1/6 bind af ACD.
   3. Centrifuge på 220 x g, medium bremse for 5 min at få blodplader rige plasma (PRP).
   4. Overføre supernatanten (~ 600 µL) plus 1/3 af røde blodlegemer til en ny tube
   5. Der centrifugeres ved 95 x g uden bremse til 6 min.
   6. Overføre supernatanten (PRP) og måle koncentrationen af blodplader i en 1/10 fortynding i Tyrode's buffer (TH buffer: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH₂PO₄* H₂O, 2 mM MgCl₂, 0,1% bovint serumalbumin og 0,1% glukose) med en automatiseret hæmatologi analyzer.
   7. Vask af trombocytterne ved at tilføje 1/25 bind af ACD + 0,1 U/mL apyrase, og der centrifugeres ved 2870 g, medium bremse for 2 min.
   8. Supernatanten og tilføje 600 µL TH buffer, 1/10 bind af ACD og 0,1 U/mL apyrase. Afbrød afpipetteres tip (P 1000), bore at gøre det bredt, som aids-forebyggelse af trombocyt aktivering, og forsigtigt suspendere pelleten.
   9. Der centrifugeres ved 2870 g, medium bremse for 2 min
   10. Supernatanten og forsigtigt suspendere blodpladerne i TH buffer.
   11. Justere lydstyrken med TH buffer til at opnå en optælling af 2 x 10⁷/mL.
2. Forberedelse af vedhængende trombocyt encellelag
   1. Forbered glas coverslip (vedhængende blodplader) pr 1.3.3.
3. Immobilisering af blodplader
   1. Tilsæt 100 µL af en 2 x 10⁷/mL trombocyt suspension pr. kanal, og Inkuber i 1,5 timer ved 37 ° C og 5% CO₂.
   2. Omhyggeligt Erstat ikke-tilhænger blodplader med blokerende løsning (5% BSA i HEPES) i mindst 30 min på RT. Fortsæt med fluorescerende mærkning og perfusion af leukocytter (trin 3.3)
4. Stimulation af musen trombocyttal éncellelag
   1. Før perfusion af leukocytter (trin 3.3), stimulerer blodpladerne af perfusion af thrombin (0,5 nM) i HHHSA buffer i 3 minutter ved 37 ° C.

3. fluorescerende mærkning og Perfusion af leukocytter (PMN eller THP-1 for menneske- og RAW264.7 eller primære mus monocytter for Murine Flow-baseret analyse)

1. Fluorescerende mærkning
   1. Label leukocytter (1 x 10⁶/mL) med celle-permeant grøn fluorescerende nukleinsyre pletten (1 µM). Inkuber celler i 30 minutter ved 37 ° C.
   2. Cellerne vaskes med PBS ved centrifugering ved 300 x g i 5 min, og suspendere celler til en koncentration på 0,5 x 10⁶ celler/mL (5 mL pr test tilstand, afhængig af strømningshastigheden) i analysebuffer.
2. Flow kammer assay forberedelse
   1. For leukocyt adhæsion på en celle éncellelag, kassere cellekulturmedium fra fadet, og samle det ind i flow kammeret. Tilsluttes sprøjten slangen. Tilslut mikro diaset for leukocyt adhæsion på immobiliserede blodplader, at sprøjten. Pre varmt vandbad på 37 ° C.
   2. Tage en perfusion sprøjte (50 mL), installere sprøjte på sprøjten indehaveren, og sæt pumpen på trække tilstand. Indstille pumpens lydstyrke til 0 mL, og angive diameter 26.70 mm til 50 mL sprøjten.
   3. Tilslut en vinklet luer forbindelse til den ene ende af slangen. Placer en luer lock kobling til sprøjten og Tilslut slangen med vinklet luer forbindelse til luer lock kobling. Slut enden med gratis slanger til flow kammer.
3. Leukocyt perfusion og vedhæftning
   1. For leukocyt adhæsion på en celle éncellelag, kassere cellekulturmedium fra fadet, og samle det ind i flow kammeret. Tilsluttes sprøjten slangen. Tilslut mikro diaset for leukocyt adhæsion på immobiliserede blodplader, at sprøjten.
   2. For leukocyt perfusion og vedhæftning over en kar- eller trombocyttal éncellelag, placere den anden slange ind i en 50 mL konisk rør indeholdende analysebuffer og fyld slanger med 1 mL pipette, og derefter presse slangen og tilslutte det til et flow kammer.
   3. Før leukocyt perfusion, tilføjer 3 mM CaCl₂ og 2 mM MgCl₂ til cellesuspension og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
   4. Perfuse analysebuffer før perfusion af celler til at fjerne eventuel luft fra salen og slanger.
   5. Luk røret ender ved at klemme dem stram og skifte slange fra analysebuffer til cellesuspension, undgå luftbobler fra at blive fanget. Perfuse celler med passende flow sats/shear stress, indtil de første celler ankommer.
   6. Perfuse celler med passende flow sats/shear stress for 2 min, og fange mindst 6 billeder mellem 2 – 6 min rullende og vedhængende celler med en omvendt fase kontrast/fluorescens mikroskop (fxEVOS-FL) ved hjælp af 100 X forstørrelse forbundet til en digital CCD- eller CMOS kamera.
      Bemærk: Strømmen sats/shear stress afhænger flow kammer dimensioner og viskositet af perfusate. Perfusion kammer bruges her (Se Tabel af materiale):
      Τ =η* 97.1*Φ
      Τ: shear stress (1 dyn/cm²)
      Η: viskositet (0.015 dyn * s/cm²)
      Φ: strømningshastighed (0,67 mL/min)
4. Leukocyt nedtrapning vedhæftning
   1. For de-adhesion, skal du skifte slange fra cellesuspension til analysebuffer ved at klemme på slangen, undgå luftbobler fra at blive fanget.
   2. Frigør celler ved perfusion med analysebuffer med et passende flow sats/shear stress (se punkt 3.3.7 bemærkning).
5. Leukocyt transmigration
   1. For leukocyt transmigration, perfuse leukocytter (trin 3) indtil en passende mængde af leukocytter overholde (~ 50 celler/Se felt).
   2. Erstatte leukocyt suspension med analysebuffer.
   3. Optage transmigrating celler af tidsforskydningen hver 10-15 s for 30-60 min. ved 37 ° C.

Representative Results

Til studier i endothelial-leukocyt adhæsion, var fluorescently mærket THP-1 celler perfunderet over en TNFα - eller ikke-stimuleret endotel éncellelag for 2 min på 3 dyne/cm². Det samlede antal vedhængende monocytic celler blev fastsat efter 2 min af perfusion af fanger 6 uafhængige felter over en periode på 2-6 min. De vedhængende celler blev kvantificeret i mindst 6 billeder taget med en omvendt fase kontrast/fluorescens mikroskop (fxEVOS-FL) via 10 X forstørrelse er sluttet til en digital CCD- eller CMOS kamera og gennemsnitlige blev udtrykt som vedhængende celler / mm². På endotel stimulation med TNFα, THP-1 anholdelse steg betydeligt i forhold til unstimulated endotelet. Repræsentative micrographs og kvantificering af fast eller TNFα-ustimuleret endotelceller tilhænger THP-1 præsenteres i figur 1. Trombocyt-leukocyt adhæsion blev vurderet af perfusion af fluorescently mærket neutrofiler i en TRAP-6 - eller ikke-stimuleret trombocyttal éncellelag i 2 minutter ved 1 dyne/cm². Vedhængende neutrofiler var kvantificeres som nævnt ovenfor. TRAP-6 stimulation steget betydeligt vedhæftning af neutrofile i forhold til unstimulated blodplader. Repræsentative videoer og kvantificering af fast vedhængende neutrofiler til eller FÆLDE-6-ustimuleret trombocyttal éncellelag er præsenteret i figur 1B.

Figur 1 : Endotel - og trombocyttal-leukocyt adhæsion under strømningsforhold. Kvantificering og repræsentant micrographs af vedhæftning af humane monocytic celler (THP-1) i endothelial celler (HUVEC) seedede på kollagen-belagt kultur retter på flow betingelser, med eller uden TNFα aktivering (10 ng/mL) (A). Kvantificering og repræsentant micrographs af vedhæftning af human neutrofiler til menneskelige blodplader immobiliseret på kollagen-belagt glas dias under strømningsforhold, uden eller med TRAP-6 aktivisering (50 µM) (B). P værdier blev beregnet ved den uparret t-test (n = 3; betyde ± SD). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Desuden kan denne analyse gennemføres for at studere rollen af adhæsionsmolekyler, såsom trombocyt junctional vedhæftning molekyle en (JAM-A). Vedhæftning af RAW264.7 musen monocyt/makrofag til et trombocyttal éncellelag fra JAM-A (trJAM-A^{+/ +}) og JAM-A-mangel (trJAM-A^{- / -}) mus blev vurderet i vores tidligere undersøgelse⁷. Som observeret deri, øget trombocytaggregation JAM-A-mangel vedhæftning af musen monocytter til trombocyttal éncellelag sammenlignet med vildtype mus (figur 2A-B). Alternativt, primære mus neutrofiler kan isoleres fra mus som beskrevet¹².

For at studere underliggende mekanismer, såsom adhæsionsmolekyler trombocyt-leukocyt interaktioner, kan specifikke overflade receptorer være blokeret. I den førnævnte undersøgelse faldt blokere trombocyt GPIbα og leukocyt α_Mβ₂ betydeligt monocyt vedhæftning, identificere en rolle for GPIbα-α_Mβ₂ akse i øget monocyt rekruttering til JAM-A^{- / -} blodplader (figur 2A-B). Derudover kan celle detachement eksperimenter udføres for at undersøge shear stress afhængighed af trombocyt-leukocyt interaktioner. Til måling af flow-afhængige udstationering af monocytter, blev shear stress gradvist øget fra 0 til 20 Dynerne/cm². I denne undersøgelse, vedhæftning af RAW264.7 celler på JAM-A^{- / -} blodplader var mere modstandsdygtige over for shear stress i forhold til JAM-A^{+/ +} blodplader (figur 2C).

Figur 2 : A-JAM-mangel fremmer flow-resistent monocytic celle vedhæftning. Vedhæftning af musen monocyt/makrofag RAW264.7 celler til trombocytter fra JAM-A^{+/ +} og JAM-A^{- / -} mus immobiliseret på kollagen-belagt glas dias under strømningsforhold, med eller uden thrombin aktivering (IIa, 0,5 nM) i angivne hæmmere (A). Repræsentative micrographs af musen monocyt/makrofag RAW264.7 celler tilhænger til JAM-A^{+/ +} og JAM-A^{- / -} blodplader efter behandling med isotype kontrol eller anti-GPIbα antistoffer (B). Celle vedhæftning udtrykt som procentdel af oprindeligt vedhængende celler under gradvist øget shear stress (dyne/cm²) på immobiliserede blodplader efter thrombin aktivering (IIa, 0,5 nM). P værdier blev beregnet af ANOVA med Tukeys post-test (n = 3-5; betyde ± SEM). Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al. ⁷ Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Langvarig optagelse gang (30-60 min) af enkelt felter efter leukocyt perfusion og vedhæftning giver mulighed for undersøgelse af leukocyt gennemgang og sprede adfærd og endelige transmigration på tværs i endothelial lag. Inden for denne undersøgelse, har vi analyseret transmigration af primære humane monocytter (isoleret med monocyt isolering kit, ifølge producentens instruktioner som beskrevet¹³) på tværs af en endotel lag. Som præsenteret i figur 3, følgende faste anholdelse til endotelet, forberede monocytter extravasate af gennemgang og breder sig indtil det foretrukne site for transmigration er nået. Efterfølgende, monocytter trænge ind i endothelial celle barrieren enten af para- eller transcellular migration. Transmigrating celler blev defineret som celler, der spredt ud over endotelceller, ved at udvide deres pseudopodia og passerer gennem den endotel barriere, dermed mindske deres lysstyrke.

Figur 3: In vitro transmigration af primære monocytter på tværs af en endotel éncellelag. Monocyt kravlende og spredning og endelige transmigration på tværs af endotelet blev indspillet hver 15 s i 30 min. venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Discussion

Denne i vitro assay er en enkel metode til at undersøge underliggende mekanismer af leukocyt rekruttering under vaskulære betændelse, men der er nogle kritiske punkter skal bemærkes. Det første krav til udført dette assay er perfusion af leukocytter løbet en intakt og Konfluerende vaskulære eller trombocyttal éncellelag. Dette kan opnås ved forudgående belægning af overflader med kollagen type jeg. Generelt, når du arbejder med primære vaskulære celler, er det vigtigt at forsigtigt løsne celler ved hjælp af de anbefalede collagenase-holdige detachement løsning (Se Tabel af materialer), som er mindre strenge, men så effektiv som trypsin. For trombocyt encellelag er det vigtigt at forsigtigt vaske blodplader under isolation at forhindre trombocyt aktivering og sammenlægning.

En anden kritisk overvejelse er at bevare kontinuiteten i pumpen tilbagetrækning tilstand bruges til perfusion, da en diskontinuitet fører til forstyrret sats og shear strømningsforhold. Dermed resulterer dette i unøjagtighed af faktiske shear stress og efterfølgende, at fejlfortolkning af fysiologisk shear-afhængige processer. Dette kan forhindres ved regelmæssig vedligeholdelse af pumpen. Derudover kritisk for kontinuitet under perfusion er brugen af en frisk sprøjte til hvert eksperiment. Siden tekstur af gummi i sprøjten ændringer med stigende brug og tid mellem eksperimenter, forhindrer det en kontinuerlig tilbagetrækning.

Et yderligere vigtigt skridt er forebyggelse af luft bliver fanget under perfusion af leukocytter, da luften vil efterfølgende rive celler fra overfladen og ændre shear forhold. Dette kan forhindres ved at skylle alle slanger før brug med ultra rent vand og derefter med analysebuffer. Også, når du forbinder rør fra analysebuffer til cellesuspension eller fra én tilstand til en anden, det er vigtigt at opretholde flydende grænseflader under tilslutning. Dette kan opnås ved at klemme slangen eller ved ikke at ændre de flydende niveauer inden for slanger. Yderligere, den væske volumen af perfusate skal altid være tilstrækkelig til at forhindre niveauet falder under slangen ende og således luft bliver taget i systemet.

En eventuel begrænsning af denne analyse kan være anvendelsen af dyrkede celler, der er fastholdt i et kunstigt miljø, dvs kulturperler på en plastik overflade, omgivet af et medium, der ikke præcist model i vivo stat. Selvom lægemiddels og fysiologiske miljø kan styres nøjagtigt, har dyrkede celler en hurtig vækstrate, hvilket øger genetiske variation og dermed heterogenitet af celler i en befolkning. Desuden, den kar- eller trombocyttal éncellelag består af en enkelt celletype kun. I særdeleshed, når undersøger endotel-leukocyt interaktioner, dvs, transmigration af leukocytter på tværs i endothelial celle barriere, fysiologisk relevante rolle underliggende endotel-celle basalmembranen og pericytes kan ikke tages i betragtning. Alternativt kan det være interessant at skabe en flercellet miljø ved at implementere 3D-celle dyrkningsbaserede teknikker i denne analyse.

At opsummere, tager disse punkter i betragtning, laminar flow-baseret analysen kan effektivt anvendes i forskellige modeller af vaskulære betændelse. Navnlig, kan det let modificeret til at behandle specifikke forskningsspørgsmål, dvs. justering af shear stress af enten varierer strømningshastigheden af perfusate, den flydende viskositet, eller kanal højde og bredde. Især er sidstnævnte vigtigt da ændringer i flow kammer dimensioner reducere væske volumen eller celler behov. Yderligere, forskellige fluorescens mærkning af leukocytter eller specifikke molekyler af vaskulær eller trombocyt encellelag kan bruges til at studere celle-celle interaktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	corning	353001
50 mL syringe	Becton Dickinson	300137
Silicone tubing	VWR	228-0700
Elbow Luer Connector Male	Ibidi	10802
Female Luer Lock Coupler	Ibidi	10823
Flow chamber	University Hospital RWTH Aachen		Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005.
Ibidi sticky slide VI 0.4	Ibidi	80608
Coverslips for sticky slides	Ibidi	10812
Collagen Type I, rat tail	Life Technologies Europe bv	A1048301
Recombinant Human TNF-α	Peprotech	300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain	Life Technologies Europe bv	S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x	Sigma-Aldrich Chemie	H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid	Life Technologies Europe bv	15630049
BUMINATE Albumin, 25%	Baxter	60010
Water for injection	B. Braun	3624315
Calcium chloride dihydrate	Merck	102382
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
Apyrase	Sigma-Aldrich Chemie	A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Promocell GmbH	C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell GmbH	C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)	ATCC	PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium	ATCC	PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE	ATCC	PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)	ATCC	PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926	ATCC	CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)	ATCC	CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1	DSMZ	ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine	Lonza	BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7	ATCC	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose	Gibco	11965092
Accutase	Promocell GmbH	C-41310
Percoll	Sigma-Aldrich Chemie	P1644
Histopaque 1119	Sigma-Aldrich Chemie	11191
10x PBS	Life Technologies Europe bv	14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin	Becton Dickinson	367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%	Greiner Bio	455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water	Sigma-Aldrich Chemie	Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood