Summary
Leukocyter interagera glupskt med vaskulära celler och trombocyter efter fartyget vägg skada eller vid inflammation. Här beskriver vi en okomplicerad laminärt flöde-baserad analys för att karakterisera de molekylära mekanismer som ligger bakom interaktioner mellan leukocyter och deras cellulära partner.
Abstract
Rekrytering av leukocyter vid skada eller inflammation till platser i vävnad skada har undersökts under de senaste decennierna och har resulterat i begreppet leukocyt vidhäftning kaskad. Dock har de exakta molekylära mekanismerna som är involverade i leukocyt rekrytering ännu inte fullt identifierats. Eftersom leukocyt rekrytering förblir ett viktigt ämne i fältet av infektion, inflammation och (auto-) immun forskning, presenterar vi en enkel laminärt flöde-baserad analys att studera bakomliggande mekanismer för vidhäftningen, avinstallation vidhäftning, och transmigration av leukocyter under venösa och arteriella flödet regimer. In vitro- analysen kan användas för att studera molekylära mekanismer som ligger bakom interaktioner mellan leukocyter och deras cellulära partner i olika modeller av vaskulär inflammation. Det här protokollet beskriver en laminär-baserad analys använder en parallell-flow-kammare och en inverterad fas kontrast mikroskopet ansluten till en kamera för att studera samspelet mellan leukocyter och endotelceller eller blodplättar, vilket kan visualiseras och registreras sedan analyserade offline. Endotelceller, trombocyter eller leukocyter kan vara förbehandlade med hämmare eller antikroppar att bestämma specifika molekyler roll under denna process. Skeva villkor, dvs arteriell eller venös skjuvspänning, kan enkelt anpassas av viskositet och flödet av perfunderade vätskorna och höjden på kanalen.
Introduction
Vid skada, inflammation eller infektion svara leukocyter snabbt till patogen - eller skada-associerade molekylära mönster (PAMPs, dämpar), ändra i ett aktivt tillstånd och flytta ut blodet till platser i inflammation och vävnad. Leukocyter förmåga att interagera med deras cellulära och molekylära miljö är avgörande för deras rätta funktion som immunceller, som framhållits av genetiska sjukdomar såsom leukocyt vidhäftning brist1. Leukocyt vidhäftning har varit föremål för intensiv utredning under de senaste decennierna och detta har resulterat i begreppet leukocyt vidhäftning kaskad i början av 1990-talet2,3. Leukocyt vidhäftning initieras av selektin-medierad tillfångatagandet av leukocyter till endotelet, orsakar celler att rulla över vaskulär ytan. Denna rullande möjliggör leukocyter att skanna för endotel-bundna flyttande ledtrådar, t.ex., chemokiner, som inducerar aktivering av integriner. Därefter medla de aktiverade integriner bindningen till endotelceller ligander, vilket resulterar i fast leukocyt gripandet. Leukocyter kan därefter förbereda till extravasate genom att krypa och sprider, innan genomträngandet i endothelial enskiktslager och transmigrating in i underliggande vävnad. Det grundläggande konceptet för den kanoniska leukocyt kaskaden har förblivit i stort sett oförändrad sedan dess införande, med några mellanliggande steg till4. Ändå de exakta molekylära mekanismerna och rollerna för de många aktörerna i leukocyt rekrytering inte har klarlagts hittills och leukocyt rekrytering förblir ett viktigt ämne i fältet av infektion, inflammation och (auto-) immun forskning.
Exempelvis ökade under vaskulär inflammatoriska sjukdomar som åderförkalkning, leukocyt rekrytering till fartyget vägg enheter plack utveckling. Instabila aterosklerotiska plack kan brista, vilket leder till massiv aktivering av trombocyter och koagulationssystemet, och därefter ocklusion av fartyget5. Detta kan resultera i allvarliga kardiovaskulära utfall såsom hjärtinfarkt eller stroke. Dessutom endothelial denudation som det uppstår kliniskt, e.g. efter stentning av ett kranskärl, leder till en mängd interaktioner av leukocyter och trombocyter till utsatta fartyg vägg interiör (t.ex., matrix komponenter och slät muskel celler) och av leukocyter med trombocyter som täcker den vaskulära skadan. Dessa interaktioner är viktiga för den fortsatta utvecklingen av sjukdomen som monocyt-trombocyter interaktioner kan driva neointima bildning6,7. Dessutom trombocyt-leukocyt interaktioner medierade av leukocyt integrin Mac-1 (αMβ2) och trombocytantal GPIbα har nyligen identifierats som romanen förare av trombos i möss8.
Med tanke på den stora tillgången på människors och djurs blod som en källa av leukocyter och trombocyter för forskning, och den breda spectrumen av isolerade matrix molekyler och förevigade cellinjer leukocyt och vaskulär ursprung, är det möjligt att simulera leukocyter interaktioner under flöde i ett laboratorium inställning, med specialdesignade flöde perfusion chambers. Många varianter har utformats under de senaste decennierna, alltifrån vakuum-driven till självhäftande perfusion chambers. Alla varianter har det gemensamt att den orörliga delen (t.ex., odlade vaskulära celler eller matrix proteiner) monteras i en större läcka-bevis kammare utrustade med en fördefinierad kanal aktivera perfusion vätska över orörliga delen. Dessutom möjliggjort framsteg inom formsprutning teknik utvecklingen av skräddarsydda lösningar baserade på kisel polymerer9. Med viskositet och flödet av perfunderade vätskorna och höjden av kanalen bestämmer främst flödet perfusion enhet10skjuvspänningen egenskaper. I denna artikel presenterar vi en in vitro- Metod för att studera bakomliggande mekanismer för vidhäftningen, avinstallation adhesion och migration av leukocyter under venösa och arteriella flödet regimer. Fördelen med de metoder som presenteras här är att de kan utföras med vanliga kamera-anslutna fluorescens Mikroskop, och kräver inte en praktiker att inneha hög teknisk kompetens. In vitro- analysen kan manipuleras på många sätt (t.ex., lägga till hämmare eller blockera antikroppar), och är således tillämplig i olika modeller av vaskulär inflammation och gör utredningen av vidhäftning protein funktioner eller utvärdering av särskilda föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av medicinsk etisk och djur etiska nämnder av Maastricht University.
1. flödesbaserade Assay med mänskliga celler
-
Isolering av trombocyter från humanblod
- Rita venöst blod i citrat (3,2%) antikoagulans.
- Tillsätt 1/15 mängd syra citrat dextros (ACD: 80 mM Trinatriumcitrat, 52 mM citronsyra och 183 mM glukos) till blodet.
- Centrifugera vid 350 x g utan broms för 15 min att få trombocyter rika plasma (PRP).
- Överför supernatanten till ett 15 mL koniska rör och tillsätt 1/20 volym av ACD.
- Centrifugera 1.110 g utan broms för 15 min att få trombocyter fattiga plasma (PPP).
- Kassera supernatanten. Klippte av slutet av Pipettera spetsen (P 1000), vilket gör det brett tråkmåns, som stöd i förebyggande av trombocytaktivering, och noggrant centrifugerade trombocyter i samma volym som PRP i trombocytantal buffert pH 6,6 (PB: 136 mM NaCl, 10 mM Hepes 2,7 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1% bovint serumalbumin och 0,1% glukos). Lägg till 1/20 volym av ACD och blanda försiktigt.
- Pellet trombocyter vid 1 110 g utan broms för 15 min.
- Avlägsna supernatanten och noggrant avbryta blodplättarna som ovan i 1 mL trombocytantal buffert (pH 7,5).
- Mäta trombocyter koncentration i en 1/10 utspädning med en automatiserad hematologi analysator.
- Justera volymen med trombocytantal buffert (pH 7,5) att uppnå en sammanräkning av7/2 x 10 ml.
-
Isolering av polymorfonukleära celler från humant blod (anpassad från Brinkmann o.a. 11 )
- Rita 24 mL blod i heparin (10 U/mL) som antikoagulans.
- Tillsätt 6 mL 1.077 g/mL densitet polysucrose-natrium diatrizoate medium (se Tabell för material) till en 15 mL koniska tube och noggrant skikt 5-6 mL helblod på toppen.
- Centrifugera i 20 min vid 800 x g utan broms.
- Aspirera och kasta det klar gulaktig översta lagret och överföra den lägsta rödaktig fasen som innehåller granulocyter i färsk 15-mL koniska rör. Tvätta cellerna genom att lägga till PBS som innehåller 2 mM EDTA till en slutlig volym av 14 mL och Centrifugera i 10 min vid 300 x g utan broms.
- Under tiden förbereder en täthet lutning medium (t.ex., percoll, se Tabell för material) fungerande lösning genom att blanda 18 mL täthet lutning medium med 2 mL 10 x PBS stamlösning. Späd ut denna fungerande lösning med PBS (1 x) för att erhålla 4.25 mL varje 85%, 80%, 75%, 70% och 65% lutning medelstora lösningar.
- Förbered 2 koniska rör med täthetlutningen genom att skikta 2 mL av varje medium procentsats ovanpå varandra. Börja med den högsta koncentrationen och fortsätta i fallande ordning. Markera lagrarna på tuben med en vattentät markör.
- Noggrant lager 2 mL av cellsuspensioner på varje av de två förberedda Övertoningarna.
- Centrifugera i 20 min vid 800 x g utan broms i en noga avvägd centrifug.
- Efter centrifugering, ta bort det översta lagret och de flesta av de 65% lager (första ring) med PBMC, och samla in nya rör det vita kvar interphases till 85% lagret (andra ring, PMN).
- Tvätta cellerna genom att fylla upp rören med PBS 2 mM EDTA och Centrifugera i 10 min vid 300 x g utan broms.
- Avlägsna supernatanten och avbryta sedimenterade cellerna (≥ 95% är vanligtvis PMN) i 1 mL av Hanks buffert (pH 7,45), innehållande 10 mM Hepes och 0,2% humant albumin (analysbuffert).
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och avbryta celler på6/1 x 10 ml.
- Fortsätta med fluorescerande märkning och perfusion av leukocyter (steg 3.3).
-
Beredning av vidhäftande trombocyt- och vaskulära cell-enskiktslager
-
Cell kultur maträtt förberedelse (odlade celler)
- Pre päls 35 mm cell kultur rätter med 1 mL utspädd rat tail kollagen (30 µg/mL utspädd i PBS filtreras över ett 0,2 µm filter).
- Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C, kassera kollagen lösningen och tvätta skålen en gång med PBS.
-
Kultur av vaskulära celler i kultur rätter
- Lossa primär (t.ex., HUVEC, HAoEC, HAoSMC) eller förevigade vaskulära celler (t.ex., EA. Hy926, SVEC) vuxit till sammanflödet i en T75 kolv med 1,5 mL cell avlossning lösning (t.ex., accutase). Tillsätt 4,5 mL lämpligt odlingsmedium att neutralisera cell avlossning lösningen och bestämma cellkoncentrationen med en cell räknar kammare. Upphäva cellerna på 0,5 x 105 celler/mL i lämpligt odlingsmedium (t.ex., komplett endotelceller odlingsmedium).
- Tillsätt 2 mL cellsuspension till varje 35 mm maträtt. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 tills sammanflödet (ta 24 – 48 timmar, beroende på cell).
-
Glas täckglas förberedelse (vidhäftande trombocyter)
- Fördjupa täckglaset en gång i HCl-EtOH (1,2 M / 50% v/v).
- Skölj täckglaset 2 gånger i ultrarent vatten.
- Torka täckglaset under N2.
- Före pälsen på täckglas med 100 µL, i enlighet med ståndpunkten av kanalisera av perfusion kammare av utspädda rat tail kollagen typ I (30 µg/mL utspädd i PBS filtreras över ett 0,2 µm filter).
- Inkubera i 30 min på RT, kassera kollagen lösningen och tvätta täckglaset 3 x med PBS.
- Blockera det kollagen belagda täckglaset med 1% BSA i HEPES för 0,5 h på RT.
- Tvätta och torka täckglaset och montera den in i perfusion kammaren. Isolera trombocyter från mänskliga eller mus blod som beskrivs i steg 1.1 eller 2.1, respektive.
-
Immobilisering av trombocyter
- Tillsätt 70 µL av en 2 x 107/ml trombocytantal suspension per kanal och inkubera i 1,5 h på 37 ° C och 5% CO2.
- Försiktigt ersätta icke-anhängare blodplättar med blockerande lösning (5% BSA i HEPES) under minst 30 minuter vid RT. Fortsätt fluorescerande etiketterings-och perfusion av leukocyter (steg 3.3).
-
Stimulering av vaskulära cell enskiktslager
- Stimulera de vaskulära cellerna genom att ersätta mediet med färska media som innehåller 10 ng/mL tumörnekrosfaktor α (TNFα) under 4 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
-
Cell kultur maträtt förberedelse (odlade celler)
2. flödesbaserade Assay med murin celler
-
Isolering av trombocyter från mus blod
- Dra blod av hjärt punktering med en 21 G nål (~ 1 mL) från bedövas (ketamin 80 mg/kg och Medetomidin 0,3 mg/kg) 6 – 8 veckors-gamla möss (C57Bl/6) i citrat (3,2%) som antikoagulans.
- Tillsätt 1/6 volym av ACD.
- Centrifugera vid 220 x g, medellång broms för 5 min att få trombocyter rika plasma (PRP).
- Överför supernatanten (~ 600 µL) plus 1/3 av röda blodkroppar till en ny tub
- Centrifugera vid 95 x g utan broms 6 min.
- Överför supernatanten (PRP) och mäta trombocyter koncentration i en 1/10 utspädning i Tyrodes buffert (TH buffert: 136 mM NaCl, 5 mM Hepes, 2,7 mM KCl, 0,42 mM NaH2PO4* H2O, 2 mM MgCl2, 0,1% bovint serumalbumin och 0,1% glukos) med en automatiserad hematologi analysator.
- Tvätta av blodplättar genom att lägga till 1/25 volym av ACD + 0,1 U/mL apyrase och centrifugera 2870 g, medellång broms i 2 min.
- Avlägsna supernatanten och lägga till 600 µL TH buffert, 1/10 volym av ACD och 0,1 U/mL apyrase. Avskurna Pipettera spetsen (P 1000), tråkmåns vilket gör det brett, som hjälpmedel för förebyggande av trombocytaktivering och försiktigt centrifugerade.
- Centrifugera vid 2870 g, medellång broms för 2 min
- Avlägsna supernatanten och försiktigt avbryta blodplättarna i TH buffert.
- Justera volymen med TH buffert för att uppnå en sammanräkning av7/2 x 10 ml.
-
Beredning av vidhäftande trombocytantal enskiktslager
- Förbereda täckglas (vidhäftande trombocyter) enligt 1.3.3.
-
Immobilisering av trombocyter
- Tillsätt 100 µL av en 2 x 107/ml trombocytantal suspension per kanal och inkubera i 1,5 h på 37 ° C och 5% CO2.
- Försiktigt ersätta icke-anhängare blodplättar med blockerande lösning (5% BSA i HEPES) under minst 30 minuter vid RT. Fortsätt fluorescerande etiketterings-och perfusion av leukocyter (steg 3.3)
-
Stimulering av mus trombocytantal enskiktslager
- Innan perfusion av leukocyter (steg 3.3), stimulerar trombocyter av perfusion av trombin (0,5 nM) i HHHSA buffert under 3 minuter vid 37 ° C.
3. fluorescerande märkning och Perfusion av leukocyter (PMN eller THP-1 för mänskliga och RAW264.7 eller primära mus monocyter för murina flödesbaserade Assay)
-
Fluorescerande märkning
- Märka leukocyter (1 x 10-6/ml) med cell-diffusionskoefficient grön fluorescerande nukleinsyra fläcken (1 µM). Inkubera cellerna under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna med PBS genom centrifugering vid 300 x g i 5 min, och stänga av celler till en koncentration av 0,5 x 106 celler/mL (5 mL per Testvillkor, beroende på flödet) i analysbuffert.
-
Flöde kammare assay förberedelse
- Leukocyt vidhäftning på en cell enskiktslager, kassera cellodlingsmedium från skålen och montera det in i flödet kammaren. Anslut slangen till sprutan. Leukocyt vidhäftning på immobiliserade trombocyter, Anslut micro bilden till sprutan. Pre varma badkar vatten till 37 ° C.
- Ta en perfusion spruta (50 mL), installera spruta på sprutan innehavaren och ställa pumpen på återkalla läge. Ställa in pumpen volymen till 0 mL, och ange diametern till 26.70 mm för 50 mL sprutan.
- Anslut en vinklad luer koppling till ena änden av slangen. Placera en luer lock fästet på sprutan och Anslut slangen med i armbågen luerfattningen till luer lås kopplingen. Anslut gratis slang änden till avdelningen i flödet.
-
Leukocyt perfusion och vidhäftning
- Leukocyt vidhäftning på en cell enskiktslager, kassera cellodlingsmedium från skålen och montera det in i flödet kammaren. Anslut slangen till sprutan. Leukocyt vidhäftning på immobiliserade trombocyter, Anslut micro bilden till sprutan.
- För leukocyt perfusion och vidhäftning över en vaskulär- eller trombocytantal enskiktslager, placera den andra slangen till en 50 mL konisk tub som innehåller analysbuffert och fyll rör med 1 mL Pipettera, sedan pressa slangen och ansluta den till en flöde kammare.
- Före leukocyt perfusion, lägga till 3 mM CaCl2 och 2 mM MgCl2 cellsuspensionen och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- BEGJUTA analysbuffert före perfusion av celler för att avlägsna eventuella luft från plenisalen och slangar.
- Nära röret slutar klämma dem tätt och växla slangen från analysbuffert cellsuspension, förhindra luftbubblor från att bli instängd. BEGJUTA celler med lämpligt flöde klassar/skjuvspänningen tills de första cellerna kommer fram.
- BEGJUTA celler med lämpligt flöde klassar/skjuvspänning i 2 min och fånga minst 6 bilder mellan 2 – 6 min av rullande och vidhäftande celler med en inverterad fas kontrast/fluorescens Mikroskop (t.ex., EVOS-FL) använder 100 X förstoring ansluten till en CCD eller CMOS digitalkamera.
Obs: Flow rate/skjuvspänningen beror på flöde kammare dimensioner och viskositet perfusatet. För perfusion kammare används här (se Tabell för material):
Τ =η* 97.1*Φ
Τ: skjuvspänning (1 dyn/cm2)
Η: viskositet (0,015 dyn * s/cm2)
Φ: flödet (0,67 mL/min)
-
Leukocyt avinstallation vidhäftning
- För de-adhesion, byta slangen från cellsuspension analysbuffert genom att klämma slangen, förhindra luftbubblor från att bli instängd.
- Lossa cellerna av perfusion med Analysbuffert med ett lämpligt flöde klassar/skjuvspänning (se 3.3.7 anteckning).
-
Leukocyt själavandring
- För leukocyt själavandring, BEGJUTA leukocyter (steg 3) tills en tillräcklig mängd leukocyter följa (~ 50 celler/Visa fält).
- Ersätta leukocyt suspension med Analysbuffert.
- Spela in transmigrating celler genom tid förfaller varje 10-15 s under 30 – 60 minuter vid 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att studera endothelial-leukocyt vidhäftning, var fluorescently märkt THP-1 celler perfusion över en TNFα - eller icke-stimulerad endotelial enskiktslager i 2 min på 3 dyn/cm2. Det totala antalet vidhäftande monocytic celler bestämdes efter 2 min av perfusion av erövrare 6 oberoende fält under en period av 2-6 min. De vidhäftande cellerna kvantifierades i minst 6 bilder tagna med en inverterad fas kontrast/fluorescens Mikroskop (t.ex., EVOS-FL) med 10 X förstoring ansluten till en CCD eller CMOS digitalkamera och genomsnittligt uttrycktes vidhäftande celler / mm2. Vid endothelial stimulering med TNFα, THP-1 gripande betydligt ökade jämfört med ostimulerade endotelet. Representativa micrographs och kvantifiering av fast anhängare THP-1 till icke - eller TNFα-stimulerad endotelceller presenteras i figur 1. Trombocyt-leukocyt vidhäftning bedömdes av perfusionen i fluorescently märkt neutrofiler över en TRAP-6 - eller icke-stimulerad trombocytantal enskiktslager i 2 minuter på 1 dyn/cm2. Vidhäftande neutrofiler kvantifierades som nämnts ovan. TRAP-6 stimulering ökat betydligt adhesionen av neutrofiler i förhållande till ostimulerade trombocyter. Representativa videor och kvantifiering av fast vidhäftande neutrofiler till icke - eller TRAP-6-stimulerad trombocytantal enskiktslager presenteras i figur 1B.
Figur 1 : Endothelial - och trombocyt-leukocyt vidhäftning enligt flödesförhållanden. Kvantifiering och representant micrographs vidhäftning av mänskliga monocytic celler (THP-1) till endotelceller (HUVEC) dirigeras till kollagen-belagd kultur rätter under flödesförhållanden, med eller utan TNFα aktivering (10 ng/mL) (A). Kvantifiering och representant micrographs vidhäftning av humana neutrofiler till humana trombocyter orörlig på kollagen-belagd glasskivor flöde villkor, utan eller med TRAP-6 aktiveringen (50 µM) (B). P-värdena beräknades av oparat t-test (n = 3; genomsnitt ± SD). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Denna analys kan dessutom genomföras för att studera rollen av adhesionsmolekyler, såsom trombocyter Junktional vidhäftning molekyl A (JAM-A). Vidhäftningen av RAW264.7 mus monocyt/makrofag till ett trombocytantal enskiktslager från JAM-A (trJAM-A+/ +) och JAM-A-brist (trJAM-A- / -) möss bedömdes i vår tidigare studie7. Som observerats däri, ökat trombocyter JAM-vitaminbrist adhesionen av mus monocyter till den trombocytantal enskiktslager jämfört med vildtyp möss (figur 2A-B). Alternativt, primära mus neutrofiler kan isoleras från möss som beskrivs12.
För att studera bakomliggande mekanismer, såsom adhesionsmolekyler som är involverade i interaktioner med trombocyt-leukocyt, kan specifika yta receptorer blockeras. I den ovan nämnda studien minskade blockering av trombocytantal GPIbα och leukocyt αMβ2 betydligt monocyt vidhäftning, identifiera en roll för GPIbα-αMβ2 axel i ökad monocyt rekrytering till JAM-A- / - trombocyter (figur 2A-B). Dessutom kan cell avlossning experiment utföras för att undersöka skjuvspänningen beroendet av trombocyt-leukocyt interaktioner. För mätning av flöde-beroende avlossning av monocyter höjdes skjuvspänningen stegvis från 0 till 20 dynes cm2. I denna studie, vidhäftningen av RAW264.7 celler på JAM-A- / - trombocyter var mer motståndskraftiga mot shear stress jämfört med sylt-A+/ + trombocyter (figur 2C).
Figur 2 :-JAM-vitaminbrist främjar flödet-resistenta monocytic celladhesion. Vidhäftning av mus monocyt/makrofag RAW264.7 celler till trombocyter från JAM-A+/ + och sylt-A- / - möss orörlig på kollagen-belagd glasskivor flöde villkor, med eller utan trombin aktivering (IIa, 0,5 nM) i närvaro av indikerade hämmare (A). Representativ micrographs av mus monocyt/makrofag RAW264.7 celler anhängare till JAM-A+/ + och sylt-A- / - trombocyter efter behandling med isotypen kontroll eller anti-GPIbα antikroppar (B). Cell adhesion uttryckt i procent av initialt vidhäftande celler under stegvis ökad skjuvspänning (dyn/cm2) på immobiliserade trombocyter efter trombin aktivering (IIa, 0,5 nM). P-värdena beräknades av ANOVA med Tukeys post-test (n = 3-5; menar ± SEM). Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Zhao o.a. 7 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Långvarig inspelningstiden (30 – 60 min) för enstaka fält efter leukocyt perfusion och vidhäftning kan studiet av leukocyt kryper och sprider beteende och slutgiltiga transmigration över endothelial lagret. Vi har analyserat transmigrationen av primära humana monocyter (isolerad med monocyt isolering kit, enligt tillverkarens instruktioner som beskrivs13) över ett endotel lager inom denna studie. Som presenteras i figur 3, följande fast gripandet till endotelet, förbereda monocyter till extravasate genom att krypa och sprida tills den önskade platsen för själavandring nås. Därefter, penetrera monocyter endotelceller barriären antingen genom para- eller transcellular migration. Transmigrating celler definierades som celler utspridda över endotelceller, genom att utvidga sina pseudopodia och passerar genom endotel barriären, vilket minskar deras ljusstyrka.
Figur 3: In vitro transmigration av primära monocyter över en endothelial enskiktslager. Monocyt krypande och fördelande och slutgiltiga transmigration över endotelet spelades varje 15 s för 30 min. Klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna in vitro- analys är en enkel metod för att undersöka bakomliggande mekanismer för leukocyt rekrytering vid vaskulär inflammation, men det finns några kritiska punkter noteras. Det första kravet för att framgångsrikt utföra denna analys är perfusionen i leukocyter över en intakt och konfluenta vaskulär eller trombocytantal enskiktslager. Detta kan uppnås genom tidigare beläggning av ytor med kollagen typ jag. I allmänhet när du arbetar med primära vaskulära celler, är det viktigt att försiktigt lossa cellerna med den rekommenderade kollagenas-innehållande avlossning lösningen (se Tabell för material), vilket är mindre strikt, men lika effektivt som trypsin. För trombocyter enskiktslager är det viktigt att försiktigt tvätta trombocyter under isolering att förhindra trombocytaktivering och aggregering.
En annan kritisk faktor är att upprätthålla kontinuiteten i pumpen uttag-läge används för perfusionen, eftersom en diskontinuitet leder till störd flödesförhållanden ränta och skjuvning. Sålunda, detta resulterar i felaktighet av faktiska skjuvspänning och därefter till feltolkning av fysiologiskt skjuvning-beroende processer. Detta kan förhindras genom regelbundet underhåll av pumpen. Dessutom viktigt för kontinuiteten under perfusion är användningen av en ny spruta för varje experiment. Sedan texturen av gummi inom spruta ändringarna med ökande användning och tid mellan experiment, förhindrar det en kontinuerlig uttag.
Ett ytterligare avgörande steg är förebyggande av luft att bli instängd under perfusionen av leukocyter, eftersom luften kommer därefter Riv celler från ytan och förändra skeva villkor. Detta kan förhindras genom att skölja alla slangar före användning med ultrarent vatten och sedan med Analysbuffert. Dessutom när du ansluter slangen från analysbuffert att cellsuspensionen eller från ett tillstånd till den andra, är det viktigt att upprätthålla flytande gränssnitt under anslutning. Detta kan uppnås genom att klämma slangen eller genom att inte ändra flytande nivåer inom slangar. Ytterligare, volymen av perfusatet alltid vara tillräcklig för att förhindra nivån faller under slangar slutet och, således, luft tas upp i systemet.
En möjlig begränsning av denna analys kan vara användning av odlade celler som upprätthålls i en artificiell miljö, dvs odlade på en plast yta som omges av ett medium som inte exakt modellerar i vivo staten. Även om de fysiokemiska och fysiologiska miljön kan kontrolleras exakt, har odlade celler en snabb tillväxt, vilket ökar genetisk variation och därmed heterogena celler inom en befolkning. Dessutom den vaskulära- eller trombocytantal enskiktslager består av en enda cell-typ bara. I synnerhet, när du undersöker endothelial-leukocyt interaktioner, dvs, transmigration av leukocyter över endotelceller barriären, den underliggande basalmembranet endotelceller och pericyter fysiologiskt relevanta roll inte kan beaktas. Alternativt kan det vara intressant att skapa en multicellulär miljö genom att implementera 3D-cell odlingsskålar tekniker i denna analys.
Att sammanfatta, beaktar dessa punkter, laminärt flöde-baserade analysen kan effektivt tillämpas i olika modeller av vaskulär inflammation. I synnerhet kan det enkelt ändras till adress konkreta forskningsfrågor, dvs justering av skjuvspänningen genom att antingen variera flödet klassar av perfusatet, flytande viskositeten, eller kanal höjd och bredd. Särskilt är det senare av betydelse eftersom förändringar i flödet kammare dimensioner minska volym eller celler som behövs. Ytterligare, olika fluorescens märkning av leukocyter eller specifika molekyler av vaskulär eller trombocytantal enskiktslager kan användas för att studera cell-cell interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Drs. Martin M. Schmitt och Line Fraemohs. Detta arbete stöddes av Nederländerna stiftelse för vetenskaplig forskning (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Foundation för blodtransfusion forskning (LSBR Nr. 1638) och Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB1123/A2) tilldelas R.R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
