Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

लामिना प्रवाह आधारित परख ल्युकोसैट की जांच करने के लिए प्रसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं और अनुयाई प्लेटलेट्स पर भर्ती

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57009
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Department of Vascular Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine

Summary

ल्यूकोसाइट्स avid के पोत दीवार चोट के बाद या सूजन के दौरान संवहनी कोशिकाओं और प्लेटलेट्स के साथ बातचीत । यहां, हम एक सीधा लामिना प्रवाह का वर्णन आधारित परख के लिए आणविक तंत्र है कि आबाद ल्यूकोसाइट्स और उनके सेलुलर भागीदारों के बीच बातचीत की विशेषताएं ।

Abstract

चोट या चोट या ऊतक क्षति की साइटों के लिए सूजन पर ल्यूकोसाइट्स की भर्ती हाल के दशकों के दौरान जांच की गई है और ल्युकोसैट आसंजन झरना की अवधारणा में हुई है । हालांकि, ल्युकोसैट भर्ती में शामिल सटीक आणविक तंत्र अभी पूरी तरह पहचाने नहीं गए हैं । चूंकि ल्युकोसैट भर्ती संक्रमण, सूजन, और (ऑटो) प्रतिरक्षा अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण विषय रहता है, हम एक सीधा लामिना प्रवाह आधारित परख के लिए आसंजन, de-आसंजन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन वर्तमान, और शिरापरक और धमनी प्रवाह शासन के तहत ल्यूकोसाइट्स के स्थानांतरगमन । इन विट्रो परख आणविक तंत्र है कि आबाद संवहनी सूजन के विभिंन मॉडलों में ल्यूकोसाइट्स और उनके सेलुलर भागीदारों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लामिना प्रवाह एक समानांतर प्रवाह कक्ष और एक औंधा चरण कंट्रास्ट एक कैमरे से जुड़े माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए ल्यूकोसाइट्स और endothelial कोशिकाओं या प्लेटलेट्स की बातचीत का अध्ययन है, जो कल्पना और दर्ज किया जा सकता है तो-परख आधारित ऑफ़लाइन विश्लेषण किया गया । Endothelial कोशिकाओं, प्लेटलेट्स, या ल्यूकोसाइट्स अवरोधकों या एंटीबॉडी के साथ इस प्रक्रिया के दौरान विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए इलाज किया जा सकता है । कतरनी की स्थिति, यानी धमनी या शिरापरक कतरनी तनाव, आसानी से perfused तरल पदार्थ और चैनल की ऊंचाई चिपचिपापन और प्रवाह की दर से अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

चोट, सूजन, या संक्रमण पर, ल्यूकोसाइट्स जल्दी से रोगज़नक़ का जवाब-या नुकसान-आणविक पैटर्न (PAMPs, नम), एक सक्रिय राज्य में परिवर्तन, और रक्त प्रवाह के बाहर सूजन और ऊतक क्षति की साइटों के लिए कदम । ल्यूकोसाइट्स की क्षमता उनके सेलुलर और आणविक वातावरण के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में उनके सही कार्य के लिए आवश्यक है, के रूप में आनुवंशिक विकारों द्वारा इस तरह के रूप में प्रकाश डाला ल्युकोसैट आसंजन की कमी1. ल्युकोसैट आसंजन पिछले दशकों के दौरान गहन जांच का विषय रहा है और यह 1990 के दशक2,3में ल्युकोसैट आसंजन झरना की अवधारणा में हुई है । ल्युकोसैट आसंजन endothelium करने के लिए ल्यूकोसाइट्स की selectin मध्यस्थता कब्जा द्वारा शुरू की है, कोशिकाओं संवहनी सतह पर रोल करने के लिए कारण. इस रोलिंग ल्यूकोसाइट्स endothelium-बाध्य प्रवासी cues, के लिए स्कैन करने के लिए सक्षम बनाता है, जैसे, chemokines, जो integrins के सक्रियण प्रेरित । इसके बाद, सक्रिय integrins मध्यस्थता endothelial लाइगैंडों करने के लिए बाध्यकारी, जिसके परिणामस्वरूप फर्म ल्युकोसैट गिरफ्तारी. ल्यूकोसाइट्स बाद में रेंगने और प्रसार, endothelial monolayer और transmigrating अंतर्निहित ऊतक में मर्मज्ञ से पहले extravasate करने के लिए तैयार कर सकते हैं । विहित ल्युकोसैट झरना की मूल अवधारणा अपने परिचय के बाद से मोटे तौर पर अपरिवर्तित बनी हुई है, कुछ मध्यवर्ती चरणों के साथ4जोड़ा गया । फिर भी, सटीक आणविक तंत्र और ल्युकोसैट भर्ती में शामिल कई खिलाड़ियों की भूमिकाओं को इस प्रकार अब तक स्पष्ट नहीं किया गया है, और ल्युकोसैट भर्ती संक्रमण, शोथ, और (ऑटो) प्रतिरक्षा के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण विषय बनी हुई है अनुसंधान.

उदाहरण के लिए, atherosclerosis के रूप में संवहनी भड़काऊ रोगों के दौरान, पोत दीवार ड्राइव पट्टिका विकास में वृद्धि हुई ल्युकोसैट भर्ती । अस्थिर atherosclerotic पट्टिका टूटना, प्लेटलेट्स और जमावट प्रणाली के बड़े पैमाने पर सक्रियण के लिए अग्रणी हो सकता है, और बाद में पोत के रोड़ा के लिए5। इस तरह के रोधगलन या स्ट्रोक के रूप में गंभीर हृदय परिणामों में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, endothelial अनाच्छादन के रूप में यह नैदानिक होता है, एक कोरोनरी धमनी के स्टेंटिंग के बाद उदा , उजागर पोत दीवार इंटीरियर के लिए ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की बातचीत की एक भीड़ की ओर जाता है (उदा, मैट्रिक्स घटकों और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) और प्लेटलेट्स संवहनी चोट को कवर के साथ ल्यूकोसाइट्स की । ये बातचीत monocyte-प्लेटलेट बातचीत neointima गठन6,7ड्राइव हो सकता है के रूप में रोग के आगे विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, प्लेटलेट ल्युकोसैट ल्युकोसैट integrin मैक-1 (αएमβ2) और प्लेटलेट GPIbα द्वारा मध्यस्थता हाल ही में चूहों8में घनास्त्रता के उपंयास ड्राइवरों के रूप में पहचान की गई है ।

अनुसंधान के लिए ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स के एक स्रोत के रूप में मानव और पशु रक्त की व्यापक उपलब्धता को देखते हुए, और अलग मैट्रिक्स अणुओं की व्यापक स्पेक्ट्रम और ल्युकोसैट और संवहनी मूल के अमर कोशिका लाइनों, यह अनुकरण करने के लिए व्यवहार्य है ल्युकोसैट एक प्रयोगशाला की स्थापना में प्रवाह के तहत बातचीत, विशेष रूप से डिजाइन प्रवाह छिड़काव कक्षों का उपयोग कर । कई वेरिएंट पिछले दशकों में डिजाइन किया गया है, वैक्यूम से लेकर स्वयं चिपकने वाला छिड़काव कक्षों के लिए प्रेरित । सभी वेरिएंट आम में है कि मोबाइल हिस्सा (जैसे, प्रसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं या मैट्रिक्स प्रोटीन) एक बड़ा रिसाव-सबूत एक पूर्व परिभाषित चैनल के साथ सुसज्जित कक्ष में इकट्ठे हुए है एक से अधिक तरल पदार्थ के छिड़काव सक्षम करने के लिए । इसके अतिरिक्त, मोल्डिंग प्रौद्योगिकी में अग्रिमों ने सिलिका पॉलीमर्स9के आधार पर कस्टम-निर्मित समाधानों के विकास को सक्षम किया । चिपचिपाहट और प्रवाह की दर perfused तरल पदार्थ और चैनल की ऊंचाई मुख्य रूप से प्रवाह छिड़काव डिवाइस की कतरनी तनाव विशेषताओं का निर्धारण10। इस अनुच्छेद में, हम एक इन विट्रो विधि आसंजन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए मौजूद है, de-आसंजन, और स्थानांतरगमन के तहत ल्यूकोसाइट्स के शिरापरक और धमनी प्रवाह शासन । यहां प्रस्तुत तरीकों का लाभ यह है कि वे एक आम कैमरे से जुड़े प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है, और एक प्रयोगकर्ता उच्च तकनीकी प्रवीणता के अधिकारी की आवश्यकता नहीं है । इन विट्रो परख कई मायनों में हेरफेर किया जा सकता है (जैसे, अवरोधकों को जोड़ने या एंटीबॉडी अवरुद्ध द्वारा), और इस प्रकार संवहनी सूजन के विभिन्न मॉडलों में लागू है और आसंजन प्रोटीन कार्यों की जांच की अनुमति देता है या विशिष्ट यौगिकों का मूल्यांकन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को Maastricht यूनिवर्सिटी के मेडिकल एथिकल और एनिमल एथिकल बोर्ड्स ने मंजूरी दी है ।

1. प्रवाह आधारित मानव कोशिकाओं के साथ परख

  1. मानव रक्त से प्लेटलेट्स का अलगाव
    1. साइट्रेट में शिरापरक रक्त ड्रा (3.2%) थक्कारोधी ।
    2. जोड़ें 1/15 एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज की मात्रा (एसीडी: 80 मिमी trisodium साइट्रेट, 52 मिमी साइट्रिक एसिड और 183 mm ग्लूकोज) रक्त के लिए ।
    3. 15 मिनट के लिए ब्रेक के बिना 350 एक्स जी पर केंद्रापसारक प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) प्राप्त करने के लिए ।
    4. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण और एसीडी की मात्रा 1/20 जोड़ें ।
    5. 15 मिनट के लिए ब्रेक के बिना १,११० जी पर केंद्रापसारक प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) प्राप्त करने के लिए ।
    6. supernatant को त्यागें । प्लास्टिक टिप (पी 1000) के अंत में कटौती, यह व्यापक बोर है, जो प्लेटलेट सक्रियण की रोकथाम में एड्स, और ध्यान से प्लेटलेट गोली में एक ही मात्रा में पीआरपी के रूप में निलंबित करने के लिए बंद करने के लिए एक प्रकार का , 2.7 mm KCl, 2 mm MgCl2, 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और 0.1% ग्लूकोज) । जोड़ें 1/20 एसीडी की मात्रा और धीरे मिश्रण.
    7. 15 मिनट के लिए ब्रेक के बिना १,११० जी पर प्लेटलेट्स गोली ।
    8. supernatant को छोड़ें और सावधानीपूर्वक प्लेटलेट्स को 1 मिलीलीटर प्लेटलेट बफ़र (pH 7.5) में ऊपर के रूप में निलंबित कर दें ।
    9. एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक के साथ एक 1/10 कमजोर पड़ने में प्लेटलेट एकाग्रता को मापने ।
    10. 2 x 107/mL. की गिनती को प्राप्त करने के लिए प्लेटलेट बफर (पीएच 7.5) के साथ मात्रा समायोजित करें
  2. मानव रक्त से polymorphonuclear कोशिकाओं का अलगाव (Brinkmann एट अल से अनुकूलित । 11 )
    1. हेपरिन में रक्त की 24 मिलीलीटर ड्रा (10 यू/एमएल) थक्कारोधी के रूप में ।
    2. १.०७७ ग्राम/एमएल घनत्व polysucrose-सोडियम diatrizoate मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के 6 मिलीलीटर जोड़ें, और ध्यान से परत 5-6 मिलीलीटर पूरे रक्त शीर्ष पर ।
    3. ब्रेक के बिना 800 x जी में 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. महाप्राण और स्पष्ट पीले ऊपर परत त्यागें और निचले लाल granulocytes युक्त चरण ताजा 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में स्थानांतरण । 14 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए 2 मिमी EDTA युक्त पंजाबियों को जोड़कर, और ब्रेक के बिना 300 x जी पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक की कोशिकाओं को धो लें ।
    5. इस बीच, एक घनत्व ढाल माध्यम तैयार (जैसे, percoll, सामग्री की तालिकादेखें) 2 मिलीलीटर 10x पंजाब शेयर समाधान के साथ 18 मिलीलीटर घनत्व ढाल मध्यम मिश्रण से समाधान काम कर रहे । पंजाब के साथ इस काम समाधान को पतला (1x) 85%, 80%, 75%, 70%, और 65% ढाल माध्यम समाधान के 4.25 मिलीलीटर प्रत्येक प्राप्त करने के लिए ।
    6. एक दूसरे के शीर्ष पर हर मध्यम प्रतिशत के 2 मिलीलीटर लेयरिंग द्वारा घनत्व ढाल के साथ 2 शंकु ट्यूबों तैयार करें । उच्चतम एकाग्रता के साथ शुरू और घटते क्रम में जारी है । ट्यूब पर एक पानी प्रूफ मार्कर के साथ परतों मार्क ।
    7. ध्यान से दो तैयार ढाल के प्रत्येक पर सेल निलंबन की परत 2 मिलीलीटर ।
    8. एक सावधानी से संतुलित केंद्रापसारक में ब्रेक के बिना 800 x जी में 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    9. केंद्रापसारक के बाद, ऊपर की परत को हटा दें और 65% परत के अधिकांश (पहली अंगूठी) PBMCs के साथ, और नई ट्यूबों में जमा 85% परत तक सफेद शेष चरण (दूसरी अंगूठी, PMN) ।
    10. पंजाब के साथ ट्यूबों को भरने से धो कोशिकाओं 2 मिमी EDTA, और ब्रेक के बिना 300 एक्स जी में 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    11. supernatant निकालें और अवसादी कोशिकाओं को निलंबित (आमतौर पर ≥ 95% PMN हैं) है हांक बफर के 1 मिलीलीटर में (पीएच 7.45), 10 मिमी Hepes और 0.2% मानव एल्ब्युमिन (परख बफर) युक्त ।
    12. 1 x 106/mL. पर hemocytometer और निलंबित कक्षों का उपयोग करते हुए कक्ष गिनना
    13. फ्लोरोसेंट लेबलिंग और ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव (कदम 3.3) के साथ जारी रखें ।
  3. अनुयाई प्लेटलेट-और संवहनी कोशिका की तैयारी-monolayers
    1. सेल कल्चर डिश तैयारी (प्रसंस्कृत कोशिकाओं)
      1. पूर्व कोट 35 मिमी पतला चूहे पूंछ कोलेजन के 1 मिलीलीटर (30 µ g/एमएल एक 0.2 µm फ़िल्टर से अधिक फ़िल्टर किए गए पंजाब में पतला के साथ सेल संस्कृति व्यंजन) ।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन, कोलेजन समाधान त्यागें, और पंजाब के साथ एक बार पकवान धो लो ।
    2. संस्कृति व्यंजन में संवहनी कोशिकाओं की संस्कृति
      1. अलग प्राथमिक (जैसे, HUVEC, HAoEC, HAoSMC) या अमर संवहनी कोशिकाओं (जैसे, EA । Hy926, SVEC) 1.5 मिलीलीटर सेल टुकड़ी समाधान (जैसे, accutase) के साथ एक T75 कुप्पी में संगम को उगाया । सेल टुकड़ी समाधान बेअसर और सेल गिनती कक्ष के साथ सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उचित विकास माध्यम के 4.5 मिलीलीटर जोड़ें । कोशिकाओं को निलंबित 0.5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में उपयुक्त वृद्धि मध्यम (जैसे, पूरा endothelial सेल विकास माध्यम) ।
      2. प्रत्येक 35 मिमी डिश के लिए सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर जोड़ें । संस्कृति एक humidified मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सह के साथ2 संगम तक कोशिकाओं (24-48 एच, सेल प्रकार के आधार पर) ले ।
    3. ग् coverslip वडा (अनुयाई प्लेटलेट्स)
      1. एक बार एचसीएल-ेतोः में ग् coverslip विसर्जित करना (1.2 M/50% v/v/
      2. coverslip को ultrapure पानी में 2 बार कुल्ला कर लें ।
      3. N2के अंतर्गत coverslip को सुखाएं ।
      4. पूर्व कोट 100 µ एल के साथ गिलास coverslip, पतला चूहे पूंछ कोलेजन के छिड़काव चैंबर के चैनल की स्थिति के अनुसार मैं (30 µ g/एमएल एक 0.2 µm फ़िल्टर से अधिक फ़िल्टर किए गए पंजाब में पतला) ।
      5. आर टी में 30 मिनट के लिए मशीन, कोलेजन समाधान त्यागें, और coverslip 3x पंजाबियों के साथ धो लो ।
      6. ब्लॉक कोलेजन लेपित coverslip के साथ 1% BSA के लिए HEPES में 0.5 एच पर आरटी ।
      7. coverslip को धोकर सुखा लें और इसे छिड़काव चैम्बर में माउंट करें । क्रमशः 1.1 या 2.1 कदम में उल्लिखित के रूप में मानव या माउस रक्त से प्लेटलेट्स को अलग ।
    4. प्लेटलेट्स के स्थिरीकरण
      1. एक 2 x 107/mL प्लेटलेट निलंबन प्रति चैनल के 70 µ एल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2में 1.5 घंटे के लिए मशीन ।
      2. ध्यान से नॉन-अनुयाई प्लेटलेट्स को ब्लॉकिंग समाधान के साथ बदलें (5% HEPES में BSA) RT. फ्लोरोसेंट लेबलिंग और ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव (कदम 3.3) के साथ जारी रखें ।
    5. संवहनी कोशिका monolayer की उत्तेजना
      1. ताजा मीडिया के साथ मीडिया की जगह द्वारा संवहनी कोशिकाओं को उत्तेजित 10 एनजी/एमएल ट्यूमर परिगलन कारक α (TNFα) 4 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह2।

2. Murine कोशिकाओं के साथ प्रवाह आधारित परख

  1. चूहे के खून से प्लेटलेट्स का अलगाव
    1. एक 21 जी सुई (~ 1 एमएल) anesthetized से (ketamine 80 मिलीग्राम/किलोग्राम और medetomidine 0.3 मिलीग्राम/किलोग्राम) 6-8 सप्ताह पुराने चूहों (C57Bl/थक्कारोधी के रूप में 3.2%) में से एक का उपयोग करके रक्त ड्रा ।
    2. जोड़ें 1/6 एसीडी की मात्रा ।
    3. में 220 x g, 5 मिनट के लिए मध्यम ब्रेक प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) प्राप्त करने के लिए केंद्रापसारक ।
    4. स्थानांतरण supernatant (~ 600 µ एल) प्लस एक नई ट्यूब के लिए लाल रक्त कोशिकाओं के 1/
    5. 6 मिनट के लिए ब्रेक के बिना 95 x g पर केंद्रापसारक ।
    6. स्थानांतरण supernatant (पीआरपी) और Tyrode के बफर में एक 1/10 कमजोर पड़ने में प्लेटलेट एकाग्रता को मापने (गु बफर: 136 एमएम NaCl, 5 एमएम Hepes, 2.7 एमएम KCl, 0.42 एमएम णः2पीओ4* एच2ओ, 2 एमएम MgCl2, 0.1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन और 0.1% ग्लूकोज) एक स्वचालित रुधिर विश्लेषक के साथ ।
    7. 1/25 एसीडी की मात्रा + 0.1 U/एमएल apyrase जोड़कर प्लेटलेट्स धो लें, और २,८७० जी, 2 मिनट के लिए मध्यम ब्रेक पर केंद्रापसारक ।
    8. supernatant को छोड़ें और 600 µ l TH बफर, 1/10 वॉल्यूम एसीडी, और 0.1 U/mL apyrase जोड़ें । प्लास्टिक टिप (पी 1000) से कट, यह व्यापक बोर, जो प्लेटलेट सक्रियण की रोकथाम में एड्स, और धीरे गोली निलंबित कर रही है ।
    9. २,८७० जी, 2 मिनट के लिए मध्यम ब्रेक पर केंद्रापसारक
    10. supernatant त्यागें और धीरे से गु बफर में प्लेटलेट्स निलंबित ।
    11. 2 x 107/mL. की गिनती प्राप्त करने के लिए गु बफर के साथ मात्रा समायोजित करें
  2. अनुयाई प्लेटलेट monolayers की तैयारी
    1. 1.3.3 के अनुसार ग् coverslip (अनुयाई प्लेटलेट्स) तैयार करें ।
  3. प्लेटलेट्स के स्थिरीकरण
    1. एक 2 x 107/mL प्लेटलेट निलंबन प्रति चैनल के 100 µ एल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2में 1.5 h के लिए मशीन ।
    2. ध्यान से नॉन-अनुयाई प्लेटलेट्स को ब्लॉकिंग समाधान के साथ बदलें (5% HEPES में BSA) RT. फ्लोरोसेंट लेबलिंग और ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव के साथ जारी रखें (3.3 चरण)
  4. माउस प्लेटलेट monolayer की उत्तेजना
    1. ल्यूकोसाइट्स (कदम 3.3) के छिड़काव से पहले, HHHSA बफर में thrombin (0.5 एनएम) के छिड़काव द्वारा प्लेटलेट्स 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उत्तेजित ।

3. फ्लोरोसेंट लेबलिंग और ल्यूकोसाइट्स (PMN या THP-1 के लिए मानव और कच्चे 264.7 या Monocytes प्रवाह के लिए प्राथमिक माउस Murine के लिए छिड़काव-आधारित परख)

  1. फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    1. ल्यूकोसाइट्स (1 x 106/mL) को सेल-permeant ग्रीन फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग (1 µ m) के साथ लेबल कर ᱶ । 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    2. 5 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक द्वारा पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो, और 0.5 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को निलंबित/एमएल (5 परीक्षण हालत प्रति मिलीलीटर, प्रवाह दर के आधार पर) परख बफर में ।
  2. फ्लो चैंबर परख तैयारी
    1. एक कोशिका monolayer पर ल्युकोसैट आसंजन के लिए, डिश से कोशिका संस्कृति मध्यम त्यागें, और यह प्रवाह कक्ष में इकट्ठा । सिरिंज के लिए टयूबिंग कनेक्ट. मैटीरियल प्लेटलेट्स पर ल्युकोसैट आसंजन के लिए, माइक्रो स्लाइड को सिरिंज से कनेक्ट करें । पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान ।
    2. एक छिड़काव सिरिंज ले लो (50 मिलीलीटर), सिरिंज धारक पर सिरिंज स्थापित करें, और वापस मोड पर पंप सेट. 0 मिलीलीटर के लिए पंप मात्रा सेट, और 50 मिलीलीटर सिरिंज के लिए २६.७० mm करने के लिए व्यास सेट ।
    3. एक कोहनी luer कनेक्टर टयूबिंग के एक छोर से कनेक्ट करें । सिरिंज के लिए एक luer ताला युग्मक प्लेस और luer ताला युग्मक को कोहनी luer संबंधक के साथ टयूबिंग कनेक्ट । फ्लो चैंबर के लिए नि: शुल्क टयूबिंग अंत कनेक्ट ।
  3. ल्युकोसैट छिड़काव और आसंजन
    1. एक कोशिका monolayer पर ल्युकोसैट आसंजन के लिए, डिश से कोशिका संस्कृति मध्यम त्यागें, और यह प्रवाह कक्ष में इकट्ठा । सिरिंज के लिए टयूबिंग कनेक्ट. मैटीरियल प्लेटलेट्स पर ल्युकोसैट आसंजन के लिए, माइक्रो स्लाइड को सिरिंज से कनेक्ट करें ।
    2. एक संवहनी या प्लेटलेट monolayer पर ल्युकोसैट छिड़काव और आसंजन के लिए, एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में दूसरी टयूबिंग जगह परख बफर युक्त और 1 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ टयूबिंग भरने के लिए, तो टयूबिंग निचोड़ और यह एक प्रवाह कक्ष से कनेक्ट ।
    3. ल्युकोसैट छिड़काव करने से पहले, 3 मिमी CaCl2 और 2 मिमी MgCl2 सेल निलंबन करने के लिए और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में मशीन जोड़ें ।
    4. कक्ष और टयूबिंग से संभव हवा को दूर करने के लिए कोशिकाओं के छिड़काव से पहले Perfuse परख बफर ।
    5. बंद ट्यूब उंहें तंग निचोड़ और परख बफर से सेल निलंबन के लिए टयूबिंग स्विच द्वारा समाप्त होता है, से हवा के बुलबुले को रोकने फंस जा रहा है । पहले कक्ष आने तक उचित प्रवाह दर/कतरनी तनाव के साथ Perfuse कोशिकाओं ।
    6. 2 मिनट के लिए उचित प्रवाह दर/कतरनी तनाव के साथ Perfuse कोशिकाओं, और एक औंधा चरण कंट्रास्ट के साथ रोलिंग और अनुयाई कोशिकाओं के 6 मिनट के बीच कम से कम 6 चित्रों पर कब्जा (जैसे, EVOS-FL) 100X इज़ाफ़ा का उपयोग कर जुड़ा करने के लिए एक डिजिटल सीसीडी या CMOS कैमरा ।
      नोट: प्रवाह दर/कतरनी तनाव फ्लो चैंबर आयामों और perfusate की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है । छिड़काव चैंबर के लिए यहां इस्तेमाल किया ( सामग्री की तालिकादेखें):
      τ =η* ९७.१ *Φ
      τ: कतरनी तनाव (1 dyn/
      η: चिपचिपापन (०.०१५ dyn * एस/
      Φ: प्रवाह दर (०.६७ मिलीलीटर/
  4. ल्युकोसैट डे-आसंजन
    1. de-आसंजन के लिए, कक्ष निलंबन से ट्यूबिंग बफर करने के लिए टयूबिंग निचोड़ द्वारा टयूबिंग स्विच, बनने से हवा के बुलबुले को रोकने फंस ।
    2. एक उचित प्रवाह दर/कतरनी तनाव के साथ परख बफर के साथ छिड़काव द्वारा अलग कोशिकाओं (3.3.7 नोट देखें) ।
  5. ल्युकोसैट स्थानांतरगमन
    1. ल्युकोसैट स्थानांतरगमन के लिए, perfuse ल्यूकोसाइट्स (चरण 3) ल्यूकोसाइट्स का एक पर्याप्त मात्रा में पालन (~ 50 कोशिकाओं/
    2. बदलें ल्युकोसैट निलंबन परख बफर के साथ ।
    3. रिकॉर्ड transmigrating कोशिकाओं को समय से चूक हर 10-15 एस के लिए 30-60 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस पर ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

endothelial-ल्युकोसैट आसंजन का अध्ययन करने के लिए, फ्लोरोसेंट THP-1 कोशिकाओं पर perfused थे एक TNFα-या गैर उत्तेजित endothelial monolayer 2 मिनट के लिए 3 डाइन/ अनुयाई monocytic कोशिकाओं की कुल संख्या 2-6 मिनट की अवधि में 6 स्वतंत्र क्षेत्रों पर कब्जा करके छिड़काव के 2 मिनट के बाद निर्धारित किया गया था । अनुयाई कोशिकाओं में quantified एक उल्टे चरण कंट्रास्ट/प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (जैसे, EVOS-FL) के साथ कब्जा कर लिया 10x आवर्धन एक डिजिटल सीसीडी या CMOS कैमरा से जुड़ाहैऔर औसत अनुयाई कोशिकाओं के रूप में व्यक्त किया गया था के साथ कैप्चर किया गया था/ मिमी2. TNFα के साथ endothelial उत्तेजना पर, THP-1 गिरफ्तार काफी उत्तेजित endothelium की तुलना में वृद्धि हुई है । प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ और दृढ़ता से अनुयाई THP के ठहराव-1 गैर या TNFα उत्तेजित endothelial कोशिकाओं में प्रस्तुत है चित्रा 1। प्लेटलेट-ल्युकोसैट आसंजन एक ट्रैप-6 पर न्यूट्रोफिल लेबल के छिड़काव द्वारा मूल्यांकन किया गया था-या गैर उत्तेजित प्लेटलेट monolayer 2 मिनट के लिए 1 डाइन/ अनुयाई न्यूट्रोफिल के रूप में उपर्युक्त quantified थे । ट्रैप-6 उत्तेजना काफी उत्तेजित प्लेटलेट्स के सापेक्ष न्यूट्रोफिल के आसंजन में वृद्धि हुई । प्रतिनिधि वीडियो और ठहराव के लिए मजबूती से अनुयाई न्यूट्रोफिल के गैर या ट्रैप-6-उत्तेजित प्लेटलेट monolayer में प्रस्तुत किया जाता है चित्रा 1बी.

Figure 1
चित्र 1 : Endothelial-और प्लेटलेट-प्रवाह की स्थिति के तहत आसंजन ल्युकोसैट. ठहराव और मानव monocytic कोशिकाओं के आसंजन के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ (THP-1) endothelial कोशिकाओं के लिए (HUVEC) प्रवाह की स्थिति के तहत कोलेजन पर लेपित संस्कृति व्यंजन पर बीज, के साथ या बिना TNFα सक्रियण (10 एनजी/एमएल) (A) । मानव प्लेटलेट्स के लिए मानव न्यूट्रोफिल के आसंजन के ठहराव और प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ का प्रवाह शर्तों के तहत कोलेजन लेपित ग्लास स्लाइड पर मैटीरियल, बिना या ट्रैप-6 सक्रियण के साथ (50 µ m) (B) । P मान ख़राब t-परीक्षण (n = 3; माध्य ± SD) द्वारा परिकलित किए गए थे । स्केल बार = 100 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

इसके अलावा, इस परख जैसे प्लेटलेट जंक्शनीय आसंजन अणु एक (जाम एक) के रूप में आसंजन अणुओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । एक प्लेटलेट monolayer को जाम से मैक्रोफेज करने के लिए कच्चे 264.7 माउस monocyte के आसंजन/एक (trJAM-a+/) और जाम एक की कमी (trJAM-a-/चूहों हमारे पूर्व अध्ययन में मूल्यांकन किया गया था7. जैसा कि उसमें देखा, प्लेटलेट जाम-एक कमी के लिए माउस monocytes के आसंजन वृद्धि हुई प्लेटलेट monolayer करने के लिए जंगली प्रकार चूहों की तुलना में (चित्रा 2A-B). वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक माउस न्यूट्रोफिल चूहों से पृथक किया जा सकता है के रूप में वर्णित12।

इस तरह के प्लेटलेट-ल्युकोसैट बातचीत में शामिल आसंजन अणुओं, विशिष्ट सतह रिसेप्टर्स अवरुद्ध किया जा सकता है के रूप में अंतर्निहित तंत्र, अध्ययन करने के लिए । aforementioned अध्ययन में, प्लेटलेट GPIbα के अवरुद्ध और ल्युकोसैट αMβ2 काफी कमी monocyte आसंजन, GPIbα-αMβ2 अक्ष के लिए एक भूमिका की पहचान करने के लिए बढ़ा monocyte भर्ती में जाम एक-/ प्लेटलेट्स (चित्रा 2ए-बी) । इसके अलावा, कोशिका टुकड़ी प्रयोगों प्लेटलेट की कतरनी तनाव निर्भरता की जांच करने के लिए किया जा सकता है-ल्युकोसैट बातचीत । monocytes के प्रवाह-निर्भर टुकड़ी की माप के लिए, कतरनी तनाव वृद्धिशील रूप से बढ़ गया था 0 से 20 डाइन/ इस अध्ययन में, जाम पर कच्चे 264.7 कोशिकाओं के आसंजन एक-/ प्लेटलेट्स जाम की तुलना में कतरनी तनाव के लिए प्रतिरोधी था एक+/ प्लेटलेट्स (चित्रा 2सी) ।

Figure 2
चित्र 2 : जाम एक कमी प्रवाह प्रतिरोधी monocytic सेल आसंजन को बढ़ावा देता है । माउस के आसंजन monocyte/मैक्रोफेज कच्चे 264.7 कोशिकाओं को जाम से प्लेटलेट्स के लिए-a+/ और जैम-a-/ चूहों की उपस्थिति में thrombin सक्रियण (आईआईए, 0.5 एनएम) के साथ या बिना प्रवाह शर्तों के अंतर्गत, कोलेजन लेपित ग्लास स्लाइड पर मैटीरियल संकेत अवरोधकों (A) । के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ माउस monocyte/मैक्रोफेज कच्चे 264.7 कोशिकाओं को जाम करने के लिए अनुयाई-एक+/ isotype नियंत्रण या एंटी-GPIbα एंटीबॉडी (बी) के साथ इलाज के बाद एक-/ प्लेटलेट्स । कोशिका आसंजन thrombin सक्रियण (आईआईए, 0.5 एनएम) के बाद मैटीरियल प्लेटलेट्स पर वृद्धिशील वृद्धि कतरनी तनाव (डाइन/cm2) के तहत शुरू में अनुयाई कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की । P मान Tukey के पोस्ट-परीक्षण (n = 3-5; मतलब ± SEM) के साथ ANOVA द्वारा परिकलित किए गए थे । स्केल बार = 100 µm । यह आंकड़ा Zhao एट अल से संशोधित किया गया है । 7 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

लंबे समय तक रिकॉर्डिंग समय (30-60 मिनट) एक ल्युकोसैट छिड़काव और आसंजन निंनलिखित क्षेत्रों के अध्ययन की अनुमति देता है ल्युकोसैट रेंगने और व्यवहार और endothelial परत के पार अंतिम स्थानांतरगमन के प्रसार । इस अध्ययन के भीतर, हमने प्राथमिक मानव monocytes के स्थानांतरगमन का विश्लेषण किया है (monocyte आइसोलेशन किट के साथ पृथक, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक endothelial परत में13) । के रूप में चित्रा 3में प्रस्तुत, endothelium के लिए फर्म की गिरफ्तारी के बाद, monocytes रेंगने और स्थानांतरगमन के लिए पसंदीदा स्थल तक फैल द्वारा extravasate तैयार करने के लिए पहुंच गया है । इसके बाद, monocytes या तो पैरा-या transcellular प्रवास के द्वारा endothelial सेल बाधा घुसना । Transmigrating कक्षों को उन कक्षों के रूप में परिभाषित किया गया है जो endothelial कक्षों पर फैले हुए हैं, उनके pseudopodia को विस्तृत करके और endothelial अवरोध से गुजरते हुए, जिससे उनकी चमक कम हो जाती है.

Movie 1
चित्र 3: इन विट्रो एक endothelial monolayer भर के प्राथमिक monocytes के स्थानांतरगमन । Monocyte रेंगने और फैलाने और endothelium भर में अंतिम स्थानांतरगमन 30 मिनट के लिए हर 15 एस दर्ज की गई थी. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस में इन विट्रो परख एक सरल तरीका संवहनी सूजन के दौरान ल्युकोसैट भर्ती के अंतर्निहित तंत्र की जांच है, लेकिन वहां कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना है । सफलतापूर्वक इस परख प्रदर्शन के लिए पहली आवश्यकता एक बरकरार और धाराप्रवाह संवहनी या प्लेटलेट monolayer पर ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव है । यह कोलेजन प्रकार मैं के साथ सतहों के पूर्व कोटिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । सामांय में, जब प्राथमिक संवहनी कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, यह धीरे से सिफारिश की collagenase युक्त टुकड़ी समाधान का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग महत्वपूर्ण है ( सामग्री की तालिकादेखें), जो कम कठोर है, लेकिन trypsin के रूप में के रूप में प्रभावी । प्लेटलेट monolayers के लिए, प्लेटलेट सक्रियण और एकत्रीकरण को रोकने के लिए अलगाव के दौरान प्लेटलेट्स को धीरे से धोना जरूरी है ।

एक और महत्वपूर्ण विचार पंप वापसी छिड़काव के लिए इस्तेमाल मोड की निरंतरता को बनाए रखने है, एक विच्छेदन के बाद से परेशान प्रवाह दर और कतरनी की स्थिति की ओर जाता है । इस प्रकार, वास्तविक कतरनी तनाव की अशुद्धि में इस परिणाम और, बाद में, शारीरिक कतरनी पर निर्भर प्रक्रियाओं की अशुद्ध व्याख्या करने के लिए । इस पंप के नियमित रखरखाव से रोका जा सकता है । इसके अतिरिक्त, छिड़काव के दौरान निरंतरता के लिए महत्वपूर्ण हर प्रयोग के लिए एक ताजा सिरिंज का उपयोग है । प्रयोग के बीच में बढ़ती उपयोग और समय के साथ सिरिंज परिवर्तन के भीतर रबर की बनावट के बाद से, यह एक सतत वापसी रोकता है.

एक और महत्वपूर्ण कदम हवा की रोकथाम ल्यूकोसाइट्स के छिड़काव के दौरान फंस रहा है, क्योंकि हवा बाद में सतह से बंद कोशिकाओं आंसू और कतरनी की स्थिति बदल जाएगा । इस अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ प्रयोग करने से पहले सभी टयूबिंग धोने से रोका जा सकता है और फिर परख बफर के साथ । इसके अलावा, जब परख बफ़र से सेल निलंबन, या एक शर्त से दूसरे से टयूबिंग जोड़ने, यह महत्वपूर्ण है कनेक्शन के दौरान तरल इंटरफेस बनाए रखने के लिए । इस टयूबिंग निचोड़ या टयूबिंग के भीतर तरल स्तर को बदलने से नहीं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, perfusate की तरल पदार्थ की मात्रा हमेशा टयूबिंग अंत नीचे गिरने के स्तर को रोकने के लिए पर्याप्त होना चाहिए और, इस प्रकार, हवा प्रणाली में लिया जा रहा है ।

इस परख की एक संभावित सीमा है कि एक कृत्रिम वातावरण में बनाए रखा जाता है, यानी एक प्लास्टिक की सतह पर एक मध्यम है कि सही नहीं vivo राज्य में मॉडल से घिरा हुआ है पर संस्कृति का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि physiochemical और शारीरिक वातावरण ठीक नियंत्रित किया जा सकता है, प्रसंस्कृत कोशिकाओं को एक तेजी से विकास दर है, जो आनुवंशिक भिन्नता बढ़ जाती है और इस प्रकार एक आबादी के भीतर कोशिकाओं के विविधता. इसके अलावा, संवहनी-या प्लेटलेट monolayer केवल एक ही सेल प्रकार के होते हैं । विशेष रूप से, जब जांच endothelial-ल्युकोसैट बातचीत, यानी, endothelial कोशिका बाधा के पार ल्यूकोसाइट्स के स्थानांतरगमन, अंतर्निहित endothelial के शारीरिक रूप से प्रासंगिक भूमिका-कोशिका तहखाने झिल्ली और pericytes को ध्यान में नहीं रखा जा सकता । वैकल्पिक रूप से, यह इस परख में 3d सेल संवर्धन तकनीकों को लागू करने से एक कोशिकीय वातावरण बनाने के लिए दिलचस्प हो सकता है ।

संक्षेप में, खाते में इन बिंदुओं को लेकर, लामिना प्रवाह आधारित परख कुशलता से संवहनी सूजन के विभिंन मॉडलों में लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, यह आसानी से विशिष्ट अनुसंधान के सवालों का पता संशोधित किया जा सकता है, अर्थात् या तो perfusate, द्रव चिपचिपापन, या चैनल ऊंचाई और चौड़ाई की प्रवाह दर अलग से कतरनी तनाव का समायोजन । विशेष रूप से, बाद महत्व के प्रवाह चैंबर आयामों में परिवर्तन के बाद से तरल पदार्थ की मात्रा या कोशिकाओं की जरूरत कम है । इसके अलावा, ल्यूकोसाइट्स के विभिन्न प्रतिदीप्ति लेबलिंग, या संवहनी या प्लेटलेट monolayers के विशिष्ट अणुओं के सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डीआरएस को धन्यवाद देते हैं । मार्टिन एम Schmitt और रेखा Fraemohs । इस काम के लिए नीदरलैंड फाउंडेशन द्वारा समर्थित वैज्ञानिक अनुसंधान (ZonMW विडि 016.126.358, Landsteiner फाउंडेशन रक्त आधान अनुसंधान के लिए (LSBR Nr. १६३८) और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. को संमानित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. Education Program 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 134 ल्युकोसैट आसंजन झरना रिमॉडलिंग संवहनी सूजन प्लेटलेट्स integrins selectins chemokines जंक्शनीय आसंजन अणु
लामिना प्रवाह आधारित परख ल्युकोसैट की जांच करने के लिए प्रसंस्कृत संवहनी कोशिकाओं और अनुयाई प्लेटलेट्स पर भर्ती
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vajen, T., Heinzmann, A. C. A.,… More

Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter