في هذه الورقة، ونحن مناقشة الاستعدادات المخ الثلاثة المستخدمة لتسجيل المشبك التصحيح خلية كله للدراسة على حلبة ريتينوتيكتال من الضفادع الصغيرة ليفيس النمو . ويساهم كل إعداد، بمزاياه الخاصة، المقاييس التجريبية من شرغوف النمو كنموذج لدراسة وظيفة الدوائر العصبية.
حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو ، تتألف من خلايا العقدة الشبكية (رجكس) في العين التي تشكل synapses مباشرة على الخلايا العصبية في الألياف البصرية تيكتوم، نموذج شعبية لدراسة الدوائر العصبية كيفية تجميع ذاتي. القدرة على القيام بكل خلية تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية تيكتال، وتسجيل الاستجابات التي أثارت حكومة كمبوديا الملكية، أما في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل، وقد ولدت مجموعة كبيرة من البيانات العالية الاستبانة حول الآليات الكامنة وراء العادي ، وغير طبيعي، تشكيل الدائرة والدالة. هنا ونحن تصف كيفية تنفيذ في فيفو الإعداد، إعداد كامل الدماغ الأصلي، وأكثر مؤخرا بوضع إعداد شريحة الدماغ الأفقية للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال. إعداد كل مزايا فريدة من نوعها التجريبية. ويمكن الإعداد في فيفو تسجيل استجابة الخلايا العصبية تيكتال المباشر للمنبهات البصرية المسقطة على العين. إعداد كامل الدماغ تسمح لحكومة كمبوديا الملكية محاور عصبية لتفعيلها على نحو شديد، وإعداد شريحة الدماغ الأفقي يسمح التسجيل من عبر كل الطبقات تكتم.
حلبة ريتينوتيكتال هو العنصر الرئيسي في النظام المرئي البرمائية. أنها تتألف من رجكس في العين، والمشروع على محاور عصبية تكتم الألياف البصرية حيث تشكل الاتصالات متشابك مع الخلايا العصبية تيكتال بوستسينابتيك. حلبة ريتينوتيكتال شرغوف النمو نموذج إنمائي شعبية لدراسة تشكيل الدوائر العصبية ووظيفة. وهناك العديد من سمات هذا شرغوف ريتينوتيكتال الدائرة التي تجعل من نموذج تجريبي قوية1،2،3. سمة رئيسية واحدة، والتركيز في هذه المقالة، هو القدرة على القيام بتسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال، في فيفو أو استخدام إعداد كامل للعقل. مع منصة الكهربية لتجهيزه مع مكبر للصوت التي تدعم الجهد والحالية-المشبك تسجيل وسائط، تسمح تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية العصبية تتسم بدقة عالية. نتيجة لذلك قدمت تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية من الخلايا العصبية تيكتال عبر المراحل الرئيسية لتشكيل الدائرة ريتينوتيكتال فهم مفصل وشامل لتنمية واللدونه الجوهرية4،5 , 6 , 7 و متشابك8،9،،من1011 خصائص. الجمع بين الخلية كله التصحيح المشبك العصبية تيكتال التسجيلات، يعزز القدرة على التعبير عن الجينات أو مورفولينوس من الفائدة في هذه الخلايا العصبية12، وأسلوب لتقييم سلوك الإرشادية البصرية عن طريق اختبار إبطال بصرية ثابتة13 تحديد الصلات بين الجزيئات، ووظيفة الدائرة، والسلوك.
من المهم ملاحظة أن نوع عالية الدقة البيانات التي يحصل عليها من تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة لا يمكن استخدام أحدث النهج التصوير مثل مؤشر الكالسيوم الوراثية GCaMP6، لأنه على الرغم من أن استخدام مؤشرات الكالسيوم تصاريح التصوير الكالسيوم ديناميات عبر عدد كبير من السكان من الخلايا العصبية في نفس الوقت، هناك لا مباشرة أو طريقة واضحة أن المعلمات الكهربائية محددة يمكن الحصول على قياس fluorescence دلتا في سوماتى، ولا توجد طريقة للجهد المشبك العصبية لقياس علاقات الجهد الحالي. وضوح هذه نهجين متميزين والتسجيلات الكهربية وتصوير الكالسيوم، تمتلك القوة غير متداخلة وتوليد أنواع مختلفة من البيانات. هكذا فإن أفضل نهج يعتمد على مسألة تجريبية محددة يجري تناولها.
هنا، يمكننا وصف لدينا طريقة للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح خلية كاملة من الخلايا العصبية تكتم الألياف البصرية شرغوف استخدام في فيفو إعداد، الإعداد الكامل للعقل، وأحدث تعديل لإعداد كامل الدماغ التي تم تطويرها في لدينا مختبر14 . في مقطع النتائج الممثل، نبدي مزايا التجريبية لكل إعداد وأنواع مختلفة من البيانات التي يمكن الحصول عليها. حدود ونقاط القوة في التحضيرات المختلفة، فضلا عن نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، يتم تضمين في جزء المناقشة.
جميع الأساليب الموصوفة في هذا العمل هي الأمثل لتسجيل تيكتال الخلايا العصبية من الضفادع الصغيرة بين مرحلة النمو 42 و 49 (نظموا وفقا نيووكوب وإبر15). بمرحلة 42، الضفادع الصغيرة كبيرة بما فيه الكفاية والمتقدمة بما فيه الكفاية حتى أنه يمكن وضع دبابيس الحشرات على أي من جانبي الدماغ لل?…
The authors have nothing to disclose.
يدعم منح المعاهد الوطنية للصحة أمانة اتفاقية بازل نحاس 1P20GM121310-01.
Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
Sterile Polystyrene Petri Dish – 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |