Summary
마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.
Abstract
유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)은 암과 같은 인간의 질병의 개시 그리고 진행 성 메커니즘에 새로운 생물 학적 통찰력을 공개에 매우 중요 합니다. 유전자 변형 및 조건부 녹아웃 쥐 유전자 overexpression 자주 사용 되었습니다 또는 특정 조직 또는 세포 제거에 비보유형. 그러나, 생식 마우스 모델 생성 시간과 비용이 많이 드는 수 있습니다. 최근 발전 기술과 DNA 플라스 미드 바이러스 성 감염에 의해 제공의 타당성을 편집 진에 여러 장기에 대 한 비 생식 autochthonous 마우스 암 모델의 빠른 생성을 활성화 했습니다. 방광 액세스, 취재는 urothelium glycosaminoglycan 계층의 존재 때문에 바이러스 성 벡터에 대 한 어려운 되었습니다 기관 이다. 여기, 우리가 마우스 방광 urothelium 비보에 플라스 미드 DNA의 효율적인 배달에 대 한 실험실에서 개발 된 새로운 방법을 설명 합니다. PCAG-GFP DNA 플라스 미드의 intravesical 주입 및 수술 노출된 방광의 electroporation를 통해 우리는 DNA 플라스 미드 방광 urothelial 셀 과도 식으로 구체적으로 전달 될 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법은 overexpression 및 마우스 방광에 유전자의 최저 신속 하 고 편리한 방법 이며 방광 암 및 다른 비뇨기과 질환의 GEMMs를 건물에 적용할 수 있습니다.
Introduction
유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 동물 개발, 유전자 기능에서 vivo에서및 질병 진행1,2의 메커니즘에 대 한 우리의 지식을 확장에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 생식 GEMMs는 전통적으로 두 가지 방법으로 개발 됩니다. 첫 번째 pseudopregnant 여성에 zygotes의 이식 뒤 DNA 플라스 미드의 pronuclear를 주입 하 여 유전자 변형 생쥐의 창조 이다. 다른 노크-아웃/노크-에서 생쥐 배아 줄기 세포에서 동종 재결합에 의해의 생성 및 키메라의 개발 이다. 특정 조직 또는 세포 유형의 관심 있는 유전자의 조건부 녹아웃 포함 여러 세대에 대 한 Cre flox 사이트와 대립 유전자 조작된 유전자의 번 식을 한다. 전체 프로세스는 비싸고 시간이 많이 걸리는, 목표는 조직 특히 여러 유전자를 대상으로 하는 경우에 특히 될 수 있습니다. 최근, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 같은 유전자 편집 기술 학위 암3, 모델링에 대 한 조직의 특정 유전 변경 유도를 쥐의 여러 장기에 적용 된 4,5,,67 또는 정확한 병 변이 라8, 에서9. 이러한 연구에서 gRNA 벡터의 전달 기관 또는 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 adenoviral 또는 lentiviral 감염을 통해 일반적으로 달성 되었다. 폐와 간 CRISPR 부품의 납품의 상대적 용이성은 편리 하 고 암 전통적인 Cre Lox 기반 마우스 모델에 비해 이러한 기관에서 모델링의 효율성에 크게 향상 됩니다.
방광 urothelium 대부분 방광 종양의 발원지 이다. 암 모델링 이나 유전자 치료에 대 한 방광 urothelium DNA 벡터의 배달 glycosaminoglycan 레이어 전염 성 바이러스10,11의 준수에 대 한 장벽 역할 꼭대기 urothelial 표면에 의해 방해 된다. Syn3 라우릴-β-d-maltoside 등 여러 가지 전처리 에이전트 하이 배리어를 중단 하 고 아 데 노비 루스 감염 효율12,,1314강화 사용 되었습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAVs) 효과적으로 방광을 감염 수 있습니다 여부 하지 보고 되었습니다. 전반적으로, 비 바이러스 성 기반된 전달 방법 바람직한 것입니다. 여기는 요도 도관 법 및 electroporation 통해 마우스 urothelium 효율적인 DNA 플라스 미드 배달 위한 실험실에서 개발 된 새로운 방법에 설명 합니다. 우리의 접근 glycosaminoglycan 레이어 또는 바이러스 생산의 화학 전처리를 포함 하지 않습니다, 때문에 그것은 크게 마우스 방광 urothelium로 DNA 플라스 미드의 납품을 간소화 하 고 다양 한 생체 내에서 연구를 촉진 해야 방광 질환의.
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Protocol
여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 지침에 따라 수행 했다.
1. 플라스 미드 및 도구 준비
- 각 방광 transfect에 대 한 DNA 플라스 미드 (1 µ g / µ L)의 적어도 20 µ L를 준비 합니다.
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 플라스 미드 솔루션의 20 µ L을 Trypan 블루의 1 µ L를 추가 합니다. 잘 섞어 피 펫입니다.
- 압력솥에 모든 수술 장비 및 작업 영역 70% 에탄올으로 소독. 자주 수술 기구와 장갑 70% 에탄올 스프레이 또는 무 균 상태를 유지 하기 위해 다음 단계를 수행할 때 유리 구슬 소독 기를 사용.
2. 동물 anaesthetizing
- 테이블 상단 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize isoflurane와 동물. O2 탱크를 켜고 1 L/min에 산소 유량을 조정.
- 유도 실에서 성인 여성 C57BL/6J 마우스를 놓습니다. 설정 하 고 유도 3 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다. 마우스 선제 무 통 유도 챔버에서 마우스의 제거에 따라 피하 마 취 2 분 관리 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg) 이내에 있어야 한다.
참고:이 프로토콜에서 여성 쥐로 사용 됩니다, 그들은 요도 도관 법 동안에 함께 작동 하도록 쉽습니다. 프로토콜 또한 남성 마우스 작동 하지만 여분의 주의 3 단계를 수행할 때 필요 하다. - 건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 코 콘에 그것의 코를 가진 난방 패드에 향하도록 anaesthetized 마우스를 놓습니다. 공기 회로 스위치 isoflurane 코 콘을 통과 하도록 설정 합니다.
- 머리와 접착 테이프로 코 콘 제 지. 유지 보수에 대 한 2 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다.
- 접착 테이프를 가진 사지를 제 지. 동물과 깊은 마 취에 복 부 영역을 면도 되도록 발가락-핀치 테스트를 수행 합니다.
3. 소변 고갈 및 방광 세 정
- 카 테 터 (24 G, 2.11 c m의 길이, 0.045 cm의 외부 직경)에 윤활제를 적용 하 고 그것의 외부 표면 완전히 덮여 확인 합니다.
- 요도 오프닝으로 카 테 터를 삽입 하 고 이때 소변 카 테 터를 통해 밖으로 흘러 한다 방광에 도달할 때까지 천천히 그것을 밀어. 부드럽게 소변 고갈 수 있도록 복 부를 누릅니다.
- 카 테 터 삽입 됩니다 올바르게 방광에 자동 소변 흐름 밖을 관찰 하 여 확인 하십시오. 요도 방광 벽을 피어 싱을 방지 하 고 필요한 경우 윤 활 유를 여러 번 적용.
- 폐기물 비 커에는 피 펫으로 소변을 삭제 합니다.
- 방광에 여전히 다른 끝으로 카 테 터의 외부 끝에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 80 µ L 플라스틱. 신중 하 게 카 테 터를 1 mL 주사기를 연결 합니다. 부드럽게 PBS을 방광에 주입 하는 주사기를 밀어. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 일부 PBS를 남겨 주세요.
- 주사기를 제거 합니다. PBS는 방광에서 배수를 기다립니다. 부드럽게 복 부 PBS 대피를 누릅니다.
- 폐기물 비 커에는 피 펫으로 카 테 터에 PBS를 삭제 합니다.
- PBS (단계 3.4-3.6) 세척 두 번 더 반복 합니다.
참고: 이러한 세척 단계 동안 부드럽게 작동에 필수적입니다. 카 테 터 또는 자동의 실패에 피가 밖으로 액체의 흐름 일반적으로 요도 통해 피어 싱을 나타냅니다. 그들은 electroporation 효율성을 줄일 것으로 소개 하는 공기 방울을 피하기 위해 중요 한 이기도 합니다.
4. 플라스 미드 배달
- 마우스 복 부에 70% 에탄올을 적용 하 고 메스를 사용 하 여 방광 위의 복 부 피부 열을 1 cm의 수직 절 개를 하 게.
- 플라스 미드 플러스 Trypan 블루 솔루션의 적어도 20 µ L, 카 테 터의 외부 끝에 플라스틱 하 고 주사기를 연결 합니다.
- 방광에 플라스 미드 솔루션을 삽입할. 방광 파란색 경우, 주사에 성공한 것입니다. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 어떤 액체를 남겨 주세요.
- 핀셋을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 카 테 터와 주사기를 제거. 문자열을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 조여. 문자열 두 개의 루프를 확인 하 고 두 개의 매듭으로 묶어.
참고:이 요도의 강화 플라스 미드 액체의 역류를 방지 하기 위한 중요 합니다. - 다음 매개 변수 electroporation 발전기 설정: 33V, 작업 시간과 950 간격 시간 50 ms.
- 핀셋으로 방광을 누른 두 전극으로 방광을 꼬집어. 수행은 electroporation에 발 페달을 밀어.
참고: 전기 펄스 각 페달 푸시 후 5 번 짧은 간격으로 발생 하도록 설정 됩니다. 마우스는이 과정에는 트 위치 수 있습니다. 발 페달을 여러 번 추진 전달 효율을 높일 수 있습니다 하지만 너무 많은 전기 펄스는 urothelium의 조직의 무결성을 손상 시킬 수 있습니다.- 불꽃 생성 됩니다 핀셋과 전극, 사이 어떤 접촉을 든 지 피하십시오.
5입니다. 복구
- 무 균 수술 봉합 및 클립 복 부와 피부 열기 봉합 요오드는 상처에 적용 됩니다.
- Isoflurane 시스템에서 동물을 제거 합니다. 수술 후 통증을 완화 시키기 위해 피하 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.
- 난방 패드에 동물을 유지 하 고 전체 복구 후 홈 케이지 돌아갑니다. 적어도 한 번 매일 정상적인 이동성, 음주와 절 개 치유 되 고 다음 클립 제거 될 때까지 동작 및 감염의 흔적을 먹이 대 한 동물을 확인 하십시오. 동물 손질, 공격 성, 그리고 발성 증가 감소와 같은 통증 증상을 표시 하는 경우 후속 buprenorphine 진통제 주사를 관리 합니다.
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Representative Results
설명 하기 위해 방광 urothelium로 유전자 배달의 성공, 우리 electroporation pCAG GFP15 플라스 미드 사용. 20 µ L 플라스 미드 및 Trypan 블루 솔루션의 요도 통해 주입 했다 그리고 5 전기 펄스 관리 되었다. 48 h 후 마우스 방광을 해 부 하 고 부정적인 electroporation 보여주었다 (그림 1A) GFP 신호를 받아야 하지 않았다 방광을 제어 하는 반면 해 부 형광 현미경 GFP 형광의 패치를 관찰. 우리 면역 형광 염색 sectioned 방광 조직 cytokeratin (CK) 5, CK18의 수행 될 때 GFP 항 체, 우리는 찾았지만 GFP 우산, 중간, 존재 하 고 기저 세포 신호는 근육 안에 레이어 (그림 1B), 그리고 플라스 미드는 urothelium에 배달의 좋은 특이성을 나타내는. Urothelial 셀의 약 15%는 GFP+, 그리고 같은 클론 자연 암 종양은 일반적으로 개별 셀에서 시작 하는 때문에, 모델링에 적합 해야 한다.
그림 1: 마우스 방광 urothelium pCAG GFP 플라스 미드의 성공적인 납품. (A) (오른쪽) (왼쪽) 그 electroporation 성공적으로 녹색으로 켜져 방광 보여주는 부정적인 제어 방광을 electroporation 수술 방광의 비교. (B) 면역 형광 sectioned 방광 조직 우산에 GFP+ 세포의 모자이크 식 패턴을 보여주는의 얼룩 (CK18+), 중간 (CK5+CK18+), 그리고 기저 (CK5+) urothelial 레이어. 눈금 막대에 에서 해당 1 m m, b에서 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Electroporation 세포 막 침투성을 강화 하 고 유전자 electrotransfer16에 대 한 강력한 기술 이다. Electroporation에 의해 생활 설치류에 유전자 배달 신경 생물학 분야17,,1819,20,21에 자주 사용 되었습니다. 다른 많은 기관에 그것의 잠재적인 응용 프로그램 광범위 하 게 탐험 하지는. 우리의 지식, 우리의 여기 설명 된 방법은 방광 urothelium electroporation에 의해 성공적인 유전자 배달의 첫 번째 보고서입니다. 그것은 아 데 노 바이러스/lentivirus 기반 감염 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, electroporation 메서드, 더 안전한, 쉽고 저렴 비 바이러스 성 유전자 벡터 사용 되 고 특정 기관 사이트에 비보에 플라스 미드 DNA의 납품은 비교적 간단 하기 때문에 채택 하는. 둘째, 그것은 종종 바이러스 벡터22납품과 관련 된 바람직하지 않은 호스트 면역 응답을 피 한다. 셋째, 방광, 경우 그것은 일반적으로 차단 하는 urothelial 세포에 바이러스 바인딩 glycosaminoglycan 레이어의 화학적 전처리에 대 한 필요성을 부정 합니다.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 도관 법, 세 정, 및 플라스 미드 주입. 카 테 터 삽입을 수행할 때 요도 나 방광 벽을 통해 피어스 하지 않습니다 보장 하기 위해 필요한 여분 배려 및 부드러운 처리 및 주사기 연결/제거. 완전히 외부 커버에 충분 한 윤활제를 적용 테의 표면도 필수적 이다. 실패의 또 다른 원인 때문에 전기 전도도 줄어 헹 구 고 플라스 미드 주입 하는 동안 방광에 공기 방울의 소개입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 이러한 단계를 수행할 때 항상 테에 어떤 액체를 떠나 하는 것이 좋습니다.
우리 젊은 (2 개월) 및 이전 (1 년) 쥐 사이 배달 효율에 차이 관찰 하지 않았다 때문에 우리의 프로토콜은 모든 나이의 성인 쥐에 대 한 작동 합니다. 여러 가지 요인 플라스 미드 배달 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 낮은 금액 수 있습니다 충분히 다루지 방광의 내부 표면으로 주입에 대 한 최소 볼륨으로 플라스 미드의 20 µ L이 좋습니다. 일반적으로 플라스 미드 볼륨 및 농도 증가 더 높은 침투 하지만 추가 이점이 없습니다 넘어 60 µ L. 더 많은 전기 펄스를 주는 볼륨에 대 한 관찰 되었다 사용할 수 있고 해야한다 전극 가진 방광의 다른 표면 영역을만 지는 전달 효율 향상에 가장 큰 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에서 설명 electroporation 매개 변수 때문에 더 높은 전압 세포 죽음을 유도 하는 경향이 조직의 무결성을 유지 하면서 urothelial 세포의 permeabilization를 허용 하도록 설정 됩니다. 그것은 추가 최적화에 대 한 이러한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. 마우스-마우스 변형 및 연구원의 처리 효율성을 크게 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 목표에 따라 각 특정 실험에 대 한 최고의 매개 변수를 결정 하는 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 예를 들어 암 개시와 클론 성장 모델링, 낮은 침투를 원하는 수 있습니다.
원칙으로 서 증거-의-우리의 전달 방법에 대 한, GFP 식 36 h 이르면 electroporation, 후 방광에 구상 될 수 있다 하 고 적어도 2 주 동안 유지할 수 있습니다. 이 새로운 방법으로 신속 하 고 저렴 하 게 유전자 overexpression 또는 다운 레 귤 레이 션 및 게놈 편집과 마우스 방광을 DNA 플라스 미드를 제공할 수는 지금. 그것은 소설 autochthonous 방광 암 모델 건물 뿐만 아니라 방광 개발을 연구 하 고 질병, 새로운도 연다.
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Disclosures
저자는 경쟁 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 교수 빈 첸, 닥터 유 장, 및 Kendy Hoang electroporation 시스템을 설정 하는 방법에 대 한 감사. 이 작품은 Z.A.W.에 산타 크루즈 암 혜택 그룹 및 NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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