Summary
Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.
Abstract
Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) son extremadamente valiosos en revelar nuevos biológicos penetraciones en los mecanismos de iniciación y progresión de enfermedades como el cáncer. Ratones transgénicos y condicional knockout se han utilizado con frecuencia para la sobreexpresión del gen o la ablación de tejidos específicos o tipos en vivo. Sin embargo, generación de modelos de línea germinal del ratón puede ser lentas y costosas. Los avances recientes en gene de la edición de tecnologías y la factibilidad de entrega de plásmidos de ADN por infección viral han permitido la rápida generación de germline no autóctonas ratón cáncer modelos para varios órganos. La vejiga es un órgano que ha sido difícil para vectores virales acceder, debido a la presencia de una capa de glicosaminoglicanos cubriendo el urotelio. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmidos de ADN en el ratón vesical urotelio en vivo. A través de la instilación intravesical de plásmido de DNA pCAG-GFP y electroporación de vejiga quirúrgico expuesta, mostramos que el plásmido de ADN puede ser entregado específicamente en las células uroteliales de vejiga de expresión transitoria. Nuestro método proporciona una manera rápida y conveniente para la sobreexpresión y knockdown de genes en la vejiga de ratón y puede aplicarse a la construcción de GEMMs de cáncer de vejiga y otras enfermedades urológicas.
Introduction
Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) han estado jugando un papel esencial en la expansión de nuestro conocimiento sobre el desarrollo animal, gene funciones en vivoy los mecanismos de progresión de la enfermedad1,2. Del germline GEMMs tradicionalmente se desarrollan de dos formas. La primera es la creación de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear del plásmido de ADN seguida por el trasplante de cigotos en las hembras seudopreñadas. El otro es la generación de ratones knock-out/knock-in por la recombinación homóloga en células madre embrionarias y el desarrollo de quimeras. Condicional knockout de genes en un tipo específico de tejido o células de interés consiste en la cría de alelos genéticamente con Cre y flox para varias generaciones. Todo el proceso puede ser costoso y desperdiciador de tiempo, especialmente si el objetivo es atacar múltiples genes tejido específica. Recientemente, se han aplicado tecnologías de edición de gene como clusters regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) a varios órganos de los ratones para inducir alteraciones genéticas específicas de tejido para el cáncer autóctono modelado3, 4,5,6,7 o mutaciones de la enfermedad correcta en situ8,9. En estos estudios, la entrega de los vectores de gRNA generalmente se logra a través de infección adenoviral o lentivirales del órgano o hidrodinámica inyección en la vena de la cola. La relativa facilidad de la entrega de los componentes CRISPR para el pulmón y el hígado ha mejorado la comodidad y eficiencia de cáncer en estos órganos en comparación con los modelos tradicionales de ratón basado en Cre-Lox.
El urotelio de la vejiga es donde se originan la mayoría los tumores de vejiga. La entrega de vectores de DNA en el urotelio de la vejiga para terapia de modelado o gen del cáncer se ve entorpecida por una capa de glicosaminoglicanos de la superficie urotelial apical, que actúa como una barrera para la adherencia del virus infeccioso10,11. Varios agentes pretratamiento Syn3 como dodecil-β-d-maltoside se han utilizado para interrumpir esta barrera y mejorar adenovirus Infección eficiencia12,13,14. No se ha divulgado si virus adeno-asociados (AAVs) efectivamente pueden infectar la vejiga. En general, un método basado no sería deseable. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmido de ADN en el urotelio de ratón a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Porque nuestro enfoque no implica pretratamiento químico de la capa de glicosaminoglicanos o producción del virus, significativamente simplifica la entrega de plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratón y debe facilitar varios estudios en vivo de enfermedades de la vejiga.
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Protocol
Todos los procedimientos aquí descritos se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California Santa Cruz.
1. plásmido y preparación de herramientas
- Para cada vejiga transfectar, preparar al menos 20 μl del plásmido de ADN (1 μg/μl).
- Añadir 1 μl de azul de tripano a 20 μl de solución de plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipeta para mezclar bien.
- Autoclave de todo quirúrgico instrumentos y esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y guantes con etanol al 70% con frecuencia o utilizar un esterilizador de bolas de cristal cuando realice los pasos siguientes para mantener condiciones estériles.
2. anestesia Animal
- Utilice un sistema de anestesia superior tabla para anestesiar el animal con isoflurano. Encienda el tanque de O2 y ajustar el flujómetro de oxígeno de 1 L/min.
- Colocar un ratón C57BL/6J femenino adulto en la cámara de inducción. Encender y ajustar el vaporizador de isoflurano al 3% para la inducción. El ratón debe estar en anestesia en 2 minutos administrar analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea al quitar el ratón de la cámara de inducción para la analgesia preventiva.
Nota: En el presente Protocolo, ratones femeninos se utilizan, como son más fáciles de trabajar con durante la cateterización de la uretra. El protocolo también funciona para ratones machos, pero se necesita mucho cuidado al realizar el paso 3. - Aplicar pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad. Coloque el ratón anestesiado hacia arriba sobre una almohada con la nariz en el cono de nariz. Gire el interruptor de circuito de aire para dejar isoflurano a través del cono de nariz.
- Sujetar la cabeza y el cono de la nariz con cinta adhesiva. Ajustar el vaporizador de isoflurano al 2% para mantenimiento.
- Sujetar las extremidades con cinta adhesiva. Realizar pruebas del pellizco del dedo del pie para asegurarse de que el animal está en anestesia profunda y luego afeitarse la zona abdominal.
3. orina agotamiento y lavado de vejiga
- Aplique lubricante a la sonda (24G, longitud de 2,11 cm, diámetro externo de 0,045 cm) y asegúrese de que su superficie externa está cubierta totalmente.
- Inserte el catéter en la abertura de la uretra y empuje lentamente hasta llegar a la vejiga, momento en el que la orina debe salir a través del catéter. Presione suavemente el abdomen para ayudar a la disminución de la orina.
- Comprobar si el catéter se inserta correctamente en la vejiga observando automático orina salida. Evite puncionar la pared de la uretra y la vejiga y aplique lubricante varias veces si es necesario.
- Descartar la orina con una pipeta en un vaso de residuos.
- Pipetear 80 μl de tampón fosfato salino (PBS) en el extremo externo del catéter, con el otro extremo en la vejiga. Cuidadosamente coloque una jeringa de 1 mL a la sonda. Empuje suavemente la jeringa para inyectar el PBS de la vejiga. Deje algunos PBS en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.
- Quite la jeringa. Esperar para que PBS drenar fuera de la vejiga. Presione suavemente el abdomen para evacuar a PBS.
- Descartar el PBS en el catéter con una pipeta en el vaso de residuos.
- Repita dos veces más PBS lavado (pasos 3.4-3.6).
Nota: Es fundamental trabajar suavemente durante estos pasos de lavado. Sangre en el catéter o el fracaso de automático hacia fuera-flujo de líquido indica generalmente la uretra se perfora a través. También es importante evitar la introducción de burbujas de aire, ya que reducirá la eficacia de la electroporación.
4. plásmido entrega
- Etanol al 70% se aplica al abdomen de ratón y utilizar un bisturí para hacer una incisión vertical de 1 cm para abrir la piel abdominal sobre la vejiga.
- Pipeta de al menos 20 μl del plásmido más solución de azul de tripano en el extremo externo del catéter y conecte la jeringa.
- Inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa. Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.
- Agarrar el orificio uretral externo con unas pinzas y retire el catéter y la jeringa. Utilice una cuerda para apretar el orificio uretral externo. Hacer dos lazos con la cadena y luego atar con dos nudos.
Nota: Estrechamiento de la uretra es importante para la prevención de retroflujo de líquido de plásmido. - Encienda el generador de electroporación con los siguientes parámetros: 33V, 50 ms tiempo de trabajo y 950 ms tiempo.
- Mantenga la vejiga con las pinzas y pellizcar la vejiga con dos electrodos. Empuje el pedal de pie para llevar a cabo la electroporación.
Nota: Los impulsos eléctricos se establecen se produzca 5 veces con intervalos cortos después de cada pulsación del pedal. El ratón puede twitch en este proceso. Empujar el pedal más de una vez puede aumentar la eficiencia de la entrega, pero demasiados impulsos eléctricos pueden dañar la integridad del tejido del urothelium.- Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto va a generar una chispa.
5. recuperación
- La sutura la abertura abdominal y piel con sutura quirúrgica estéril y clips. Aplicar yodo en la herida.
- Eliminar el animal en el sistema de isoflurano. Administrar el analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor post-surgical.
- Mantener el animal en la almohada y volver a la jaula casera después de la recuperación completa. Compruebe el animal al menos una vez al día para la movilidad normal, beber y la alimentación comportamientos y no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado y luego retire los clips. Administrar las inyecciones subsecuentes de buprenorfina analgésico si el animal muestra síntomas de dolor tales como reducir la preparación, mayor agresividad y vocalización.
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Representative Results
Para demostrar el éxito de la entrega del gene en el urotelio de la vejiga, se utilizó el plásmido de15 pCAG-GFP para la electroporación. 20 μl de solución de azul de tripano y plásmido fue inyectado a través de la uretra y se administraron 5 pulsos eléctricos. Después de 48 h, diseca la vejiga de ratón y observaron manchas de fluorescencia de GFP bajo el microscopio de fluorescencia de la disección, mientras que un negativo control de vejiga que no se someten a electroporación no mostraron ninguna señal GFP (figura 1A). Cuando realizamos la tinción de inmunofluorescencia de los tejidos de la vejiga seccionada con citoqueratina (CK) 5, CK18, y anticuerpos GFP, encontramos que la GFP estaba presente en paraguas, intermedio y las células basales de la señal, pero no en el músculo de la capa (figura 1B), lo que indica buena especificidad de la entrega del plásmido en el urotelio. Aproximadamente el 15% de las células uroteliales son GFP+, y tal carácter clonal debe ser ideal para modelado desde tumores generalmente inician desde las células individuales de cáncer.
Figura 1: entrega exitosa de plásmido pCAG-GFP en el urotelio de la vejiga ratón. (A) comparación de una vejiga que experimentó la electroporación (derecha) a una vejiga de control negativo (izquierda) mostrando que la electroporación con éxito dado que la vejiga vuelta verde. Inmunofluorescencia (B) la coloración de los tejidos de la vejiga seccionado mostrando el patrón de expresión del mosaico de células GFP+ en paraguas (CK18+), intermedia (CK5+CK18+) y basal (CK5+) capas urotelial. Barra de escala en A corresponde a 1 mm y en el B a 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La electroporación aumenta la permeabilidad de la membrana de la célula y es una poderosa tecnología para gene i16. Entrega del gene en roedores vivos por la electroporación se ha utilizado con frecuencia en Neurobiología campos17,18,19,20,21. Sus posibles aplicaciones en muchos otros órganos no se han explorado extensivamente. A nuestro conocimiento, nuestro método descrito aquí es el primer informe de entrega de la exitosa gene por electroporación al urotelio de la vejiga. Que ofrece varias ventajas a los métodos de infección basada en adenovirus/lentivirus. En primer lugar, el método de electroporación es más fácil, más seguro y más barato adoptar porque se utilizan vectores genéticos no virales y la entrega de plásmidos de ADN en sitios específicos órgano en vivo es relativamente sencilla. En segundo lugar, evita las inmunorespuestas del anfitrión indeseables que a menudo están asociadas con la entrega por virus vectores22. En tercer lugar, en el caso de la vejiga, niega la necesidad de pretratamiento químico de la capa de glicosaminoglicanos, que normalmente bloquea la Unión del virus a las células uroteliales.
Los pasos más críticos de este protocolo son la cateterización, enjuague e inyección de plásmidos. Cuidado y manejo cuidadoso son necesarios para asegurar que el catéter no perforar a través de la uretra o en la pared de la vejiga al realizar la inserción y montaje y desmontaje de la jeringa. Aplique suficiente lubricante para cubrir totalmente la superficie del catéter también es esencial. Otra causa probable de falla es la introducción de burbujas de aire en la vejiga durante la inyección del enjuague y plásmidos, ya que disminuirá la conductividad eléctrica. Para evitar esto, recomendamos siempre dejando un poco de líquido en el catéter al realizar esos pasos.
Nuestro protocolo debe trabajar para ratones adultos de cualquier edad, porque no observamos una diferencia en la eficiencia de entrega entre los más jóvenes (2 meses) y mayores (1 año) ratones. Varios factores pueden influir en eficiencia de entrega de plásmido. Recomendamos 20 μl del plásmido como el mínimo volumen de inyección menor cantidad suficiente no puede cubrir la superficie interna de la vejiga. Aumento de volumen de plásmido y concentración generalmente produce mayor penetración, pero no se observó ningún beneficio adicional para los volúmenes más allá de 60 μL. dando más impulsos eléctricos y contacto con diferentes superficies de la vejiga con electrodos tendrán la mayor impacto en la mejora de la eficiencia de entrega. Los parámetros de la electroporación se describe en este protocolo se establece en permitir permeabilización de células uroteliales preservando la integridad del tejido, ya que un voltaje más alto tiende a inducir la muerte celular. Es posible modificar estos parámetros para la optimización de otros. Variaciones de ratón a ratón y el manejo del investigador pueden afectar grandemente la eficacia. Dependiendo de la meta del proyecto, se recomienda realizar ensayos para determinar los mejores parámetros para cada experimento específico. Por ejemplo, en modelado de iniciación de cáncer y crecimiento clonal, puede desear una menor penetración.
Como prueba-de-principio para nuestro método, expresión de GFP se puede visualizar en la vejiga tan pronto como 36 h después de la electroporación y puede persistir durante al menos dos semanas. Con este nuevo método, ahora es posible ofrecer plásmidos de ADN a la vejiga de ratón rápida y a bajo costo para la sobreexpresión del gen o regulación y la edición del genoma. Abre nuevas vías para estudiar el desarrollo de la vejiga y las enfermedades, así como construir modelos de cáncer de vejiga autóctonas novela.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos profesor Bin Chen, Dr. Yue Zhang y Kendy Hoang ayuda con la configuración del sistema de electroporación. Este trabajo fue financiado por becas del NIH y beneficio grupo de cáncer de Santa Cruz a Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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