Summary
Vi beskriver en roman metode til levering af DNA plasmid til urothelial celler af musen blære i vivo gennem urinrørs-kateteration og elektroporation. Det tilbyder en hurtig og bekvem måde til at generere autokton musemodeller af blære sygdomme.
Abstract
Gensplejsede musemodeller (GEMMs) er yderst værdifuldt i afslørende roman biologiske indsigt i indledningen og progression mekanismerne i menneskelige sygdomme som kræft. Transgene og betinget knockout mus har været hyppigt anvendt til gen overekspression eller ablation i specifikke væv eller celler typer in vivo. Imidlertid kan generere kønscelleoverførsel musemodeller være tidskrævende og dyrt. De seneste fremskridt i gen redigering teknologier og muligheden for at levere DNA plasmider ved virusinfektion har aktiveret hurtige generation af ikke-kønscelleoverførsel autokton musemodeller kræft til flere organer. Blæren er et organ, der har været svært for virale vektorer adgang til, på grund af tilstedeværelsen af en glykosaminoglykan lag, der dækker urothelium. Her, vi beskriver en ny metode udviklet i laboratoriet for effektiv levering af DNA plasmider i mus blære urothelium in vivo. Gennem intravesikal instillation af pCAG-NGL DNA plasmid og elektroporation af kirurgisk udsatte blære viser vi, at DNA plasmid kan leveres specielt i blæren urothelial celler for forbigående udtryk. Vores metode giver en hurtig og bekvem måde for overekspression og knockdown af gener i mus blæren, og kan anvendes til at opbygge GEMMs af blærekræft og andre urologiske sygdomme.
Introduction
Gensplejsede musemodeller (GEMMs) har spillet en væsentlig rolle i at udvide vores viden om dyrenes udvikling, genet funktioner i vivoog mekanismer af sygdom progression1,2. Genom GEMMs er traditionelt udviklet på to måder. Først er oprettelse af Transgene mus af pronuclear injektion af DNA plasmid efterfulgt af transplantation af zygotes i pseudopregnant kvinder. Den anden er generation af knock-out/knock-i mus af homologe rekombination i embryonale stamceller og udviklingen af kimærer. Betinget knockout af gener i specifikke vævs- eller type af interesse omfatter opdræt af gensplejsede alleler med Cre og flox steder i flere generationer. Hele processen kan være dyrt og tidskrævende, især hvis målet er at målrette flere gener væv-specifikt. For nylig, gen-redigering teknologier såsom grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) har været anvendt til flere organer af mus til at fremkalde væv-specifikke genetiske ændringer for autokton kræft modellering3, 4,5,6,7 eller korrekte sygdom mutationer i situ8,9. I disse undersøgelser, blev leveringen af gRNA vektorer normalt opnået gennem adenoviral eller lentiviral infektion af orgel eller hydrodynamiske hale-vene injektion. Den relative lethed levering af CRISPR komponenter til lunge og lever har stærkt forbedret den bekvemmelighed og effektivitet af kræft modellering i disse organer, i forhold til de traditionelle Cre-Lox baseret musemodeller.
Blære urothelium er, hvor de fleste blære tumorer stammer. Levering af DNA vektorer til blære urothelium for kræft modellering eller gen terapi er hæmmet af en glykosaminoglykan lag på den apikale urothelial overflade, der fungerer som en barriere for fastholdelse af smitsomme virus10,11. Flere forbehandling agenter såsom Syn3 og dodecyl-β-d-maltoside har været brugt til at forstyrre denne barriere og forbedre adenovirus infektion effektivitet12,13,14. Om adeno-associeret virus (AAVs) effektivt kan inficere blæren er ikke blevet rapporteret. Samlet set ville en ikke-virale baseret leveringsmetode være ønskeligt. Her, vi beskriver en ny metode udviklet i laboratoriet for effektiv DNA plasmid levering til mus urothelium gennem urinrørs-kateteration og elektroporation. Fordi vores tilgang ikke indebærer kemisk forbehandling af glykosaminoglykan lag eller virus produktion, det betydeligt forenkler leveringen af DNA plasmider i mus blære urothelium, og bør lette forskellige i vivo undersøgelser blære sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der beskrives her blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer og forordninger fra de institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of California Santa Cruz.
1. plasmid og værktøjer forberedelse
- For hver blære transfect, forberede mindst 20 µL DNA plasmid (1 µg/µL).
- Tilføje 1 µL af Trypan blå til de 20 µL plasmid løsning i 1,5 mL microcentrifuge rør. Pipette til bland godt.
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter og sterilisere arbejdsområdet med 70% ethanol. Spray kirurgiske instrumenter og handsker med 70% ethanol ofte eller bruge et glas perle sterilizer når du udfører følgende trin til at vedligeholde sterile forhold.
2. anaesthetizing dyr
- Bruge en tabel top anæstesi system til bedøver dyr med isofluran. Tænd O2 tank og justere ilt flowmåler til 1 L/min.
- Placer en voksen kvinde C57BL/6J mus i salen, induktion. Aktivere og justere isofluran vaporizer til 3% for induktion. Musen bør være i anæstesi inden for 2 min. administrere buprenorphin smertestillende (0,1 mg/kg) subkutant med fjernelse af musen fra induktion salen for forebyggende analgesi.
Bemærk: I denne protokol, hunmus bruges, da de er nemmere at arbejde med under urinrøret kateterisation. Protokollen ligeledes anlæg for mandlige mus, men ekstra forsigtighed er nødvendig, når du udfører trin 3. - Anvende oftalmologiske salve for øjnene af dyret til at forhindre tørhed. Placer bedøvet musen opad på en varmepude med sin næse i næsen kegle. Sluk for air circuit / for at lade isofluran gå gennem næsen kegle.
- Dy hovedet og næsen kegle med dobbeltklæbende tape. Justere isofluran vaporizer til 2% for vedligeholdelse.
- Dy lemmer med dobbeltklæbende tape. Udføre tå-knivspids test for at sikre, at dyret er i dyb anæstesi og derefter barbere det abdominale område.
3. urin udtynding og blære skylning
- Anvende smøremiddel til kateter (24G, længde af 2.11 cm, ydre diameter af 0,045 cm) og sikre, at dens ydre overflade er fuldt dækket.
- Indsæt kateteret i urinrøret åbning og langsomt skubbe det, indtil den når blæren, på hvilket tidspunkt skal urinen flyde ud gennem kateteret. Tryk forsigtigt på maven til at hjælpe urin udtynding.
- Kontrollere hvis kateteret er indsat korrekt i blæren ved at observere automatisk urin ud flow. Undgå piercing urinrøret og blæren væggen, og anvende glidecreme flere gange, hvis det er nødvendigt.
- Kassér urin med en pipette til en affald bægerglas.
- Der afpipetteres 80 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i den ydre ende af kateteret, med anden enden stadig i blæren. Forsigtigt lægger en 1 mL sprøjte på kateteret. Skub forsigtigt sprøjte til at injicere PBS ind i blæren. Efterlad nogle PBS i kateter at undgå at oprette luftbobler i blæren.
- Fjern sprøjten. Vente på PBS til løbe ud af blæren. Tryk forsigtigt på maven til at evakuere PBS.
- Kassér PBS i kateter med en pipette til affald bægerglasset.
- Gentag PBS vask (trin 3,4-3.6) til to gange mere.
Bemærk: Det er vigtigt at arbejde forsigtigt under disse vaske trin. Blod i kateteret eller manglende automatisk ud flow af væske normalt angiver urinrøret er gennemboret gennem. Det er også vigtigt at undgå at indføre luftbobler, som de vil falde elektroporation effektivitet.
4. plasmid levering
- Gælde mus maven 70% ethanol og bruger en skalpel til at lave et lodret snit på 1 cm at åbne abdominal huden over blæren.
- Afpipetteres mindst 20 µL plasmid plus Trypan blå løsning i den ydre ende af kateteret, og vedhæfte sprøjten.
- Injicere plasmid løsningen ind i blæren. Hvis blæren bliver blå, er injektion vellykket. Efterlad nogle væske i kateter at undgå at oprette luftbobler i blæren.
- Grab den eksterne urethrae åbning ved hjælp af pincet, og fjern derefter kateter og sprøjte. Bruge en streng til at stramme den eksterne urethrae åbning. Gøre to sløjfer med strengen og derefter binde med to knaster.
Bemærk: Stramning af den urethral er vigtigt for at forhindre tilbagestrømning af plasmid væske. - Drej på elektroporation generator med følgende parametre: 33V, 50 ms arbejdstid og 950 ms tidsinterval.
- Hold blæren med pincet og klemme blæren med to elektroder. Tryk på pedalen til at udføre elektroporation.
Bemærk: De elektriske impulser er indstillet til at forekomme 5 gange med korte mellemrum efter hver pedal skubbe. Musen kan spjæt i denne proces. Skubbe fodpedalen mere end én gang kan øge levering effektivitet, men også mange elektriske impulser kan skade væv integritet af urothelium.- Undgå enhver kontakt mellem pincet og elektroder, som dette vil generere en gnist.
5. genvinding
- Sutur abdominal og hud åbning med steril kirurgisk sutur og clips. Anvende jod på såret.
- Fjerne dyret fra isofluran system. Administrere buprenorphin smertestillende (0,1 mg/kg) subkutant for at lindre post-operative smerter.
- Holde dyret på den hede afrivningsblok og returnere det til hjem buret efter fuld helbredelse. Kontrollere dyr mindst én gang dagligt for normale mobilitet, drikke og fodring adfærd og ingen tegn på infektion, indtil indsnittet er helet og derefter fjerne klippene. Administrere efterfølgende injektioner af buprenorphin smertestillende, hvis dyret viser smerter symptom som reduceret grooming, øget aggressivitet og vocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til at påvise succes af genet levering i blære urothelium, brugte vi pCAG-NGL15 plasmid for elektroporation. 20 µL plasmid og Trypan blå løsning var injiceres gennem urinrøret og 5 elektriske impulser blev administreret. Efter 48 h, vi dissekeret mus blæren og observeret pletter af normal god landbrugspraksis fluorescens under en dissektion fluorescens mikroskop, der henviser til, at en negativ styre blæren, der ikke undergår elektroporation viste ingen normal god landbrugspraksis signal (figur 1A). Når vi udførte immunofluorescens farvning af sektioneret blæren væv med cytokeratin (CK) 5, CK18, og normal god landbrugspraksis antistoffer, fandt vi at normal god landbrugspraksis signal var til stede i paraply, mellemliggende, og basal celler, men ikke i musklen lag (figur 1B), der angiver god specificiteten af plasmid levering i urothelium. Omkring 15% af urothelial celler er normal god landbrugspraksis+, og så klonede karakter bør være ideel til kræft modellering da tumorer normalt starte fra individuelle celler.
Figur 1: succesfuld levering af pCAG-NGL plasmid til musen blære urothelium. (A) en sammenligning af en blære, der undergik elektroporation (højre) til en negativ kontrol blære (til venstre) viser at elektroporation med held aktiveret blæren grøn. (B) immunofluorescens farvning af sektioneret blæren væv viser mosaik udtryk mønster af normal god landbrugspraksis+ celler i paraply (CK18+), mellemliggende (CK5+CK18+), og basal (CK5+) urothelial lag. Skalalinjen i A svarer til 1 mm, og i B til 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporation øger cellens membran permeabilitet og er en kraftfuld teknologi til gen electrotransfer16. Gen levering i levende gnavere af elektroporation har været hyppigt anvendt i neurobiologi felter17,18,19,20,21. Dens potentielle anvendelser i mange andre organer ikke er blevet grundigt udforsket. Til vores viden er vores metode beskrevet her den første rapport af vellykket gen levering af elektroporation til blære urothelium. Det giver flere fordele til adenovirus/lentivirus-baserede infektion metoder. Først, elektroporation metoden er lettere, sikrere og billigere at vedtage fordi ikke-virale genetiske vektorer bruges og levering af DNA plasmider til specifikke orgel websteder i vivo er relativt ligetil. For det andet, man undgår uønskede vært immunrespons, der er ofte forbundet med levering af virus vektorer22. For det tredje for blære negerer det behovet for kemisk forbehandling af glykosaminoglykan lag, som normalt blokerer virus binding til urothelial celler.
De mest kritiske trin i denne protokol er kateterisation, skylning og plasmid injektion. Ekstra forsigtig og blid håndtering er nødvendige for at sikre, at kateteret ikke punkteres gennem urinrøret eller blærevæggen når du udfører indsættelse og vedhæfter/fjerne sprøjten. Anvende passende smøremiddel til at fuldt ud dække den ydre overflade af kateteret er også væsentlige. En anden sandsynlig årsag til svigt er indførelsen af luftbobler i blæren under skylning og plasmid injektion, da det vil mindske elektrisk ledningsevne. For at undgå dette anbefaler vi altid forlader nogle væske i kateteret, når du udfører disse trin.
Vores protokol bør arbejde for voksne mus i enhver alder, fordi vi ikke har overholdt en forskel på levering effektivitet yngre (2 måneder) og ældre (1 år) mus. Flere faktorer kan påvirke plasmid levering effektivitet. Vi anbefaler 20 µL plasmid som den minimale mængde til injektion som lavere beløb ikke kan tilstrækkeligt dækker indersiden af blæren. Stigende plasmid volumen og koncentration generelt giver højere penetration, men ikke yderligere fordele blev observeret for mængder ud over 60 µL. giver flere elektriske impulser og rørende forskellige overfladearealer af blæren med elektroder vil have den største indvirkning på forbedrer effektiviteten af levering. Elektroporation parametre i denne protokol er indstillet til at tillade permeabilization af urothelial celler samtidig bevare vævet intakt, da højere spænding tendens til at fremkalde celledød. Det er muligt at justere parametrene for yderligere optimering. Mus til mus variationer og håndtering af forskeren kan påvirke effektivitet betydeligt. Afhængigt af projektets mål anbefaler vi udfører forsøg for at bestemme de bedste parametre for hver specifik eksperiment. For eksempel i modellering kræft indledning og klonede vækst, kan en lavere dækningsgrad ønske.
Som en proof-of-principle for vores leveringsmetode, normal god landbrugspraksis udtryk kan visualiseres i blæren så tidligt som 36 h efter elektroporation, og kan vare ved i mindst to uger. Med denne nye metode er det nu muligt at levere DNA plasmider til musen blæren hurtigt og billigt for gen overekspression eller ned-regulering og genom-redigering. Det åbner nye muligheder for at studere blære udvikling og sygdomme, samt opbygning af romanen autokton blære cancer modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takke Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang og Kendy Hoang hjælp til opsætning af elektroporation system. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Santa Cruz kræft fordel gruppe og NIH til Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
