Summary
マウス膀胱の生体内で尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによる尿路上皮細胞への DNA のプラスミッドの配信手法について述べる.膀胱疾患の土着のマウス ・ モデルを生成するための迅速かつ便利な方法を提供しています。
Abstract
遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、癌などの人間の病気の開始そして進行のメカニズムを生物学的知見を明らかに非常に貴重です。遺伝子発現形質転換および条件付きノックアウト マウスが頻繁に使用されているまたは特定のティッシュかセルでアブレーション タイプの生体。ただし、生殖マウス モデルの生成は、時間がかかり、高価にすることができます。遺伝子編集技術及びウイルス感染によってプラスミド DNA を提供することの実現可能性の最近の進歩は、いくつかの臓器の非生殖土着マウス癌モデルの急速な生成を有効にしています。膀胱は、ウイルスベクター尿路を覆うグリコサミノグリカン層の存在のために、アクセスするは難しいされている器官です。ここでは、マウス膀胱尿路上皮の体内に DNA プラスミドの効率的な配信のためのラボで開発された手法について述べる.PCAG GFP プラスミドの膀胱内注入および外科的露出膀胱のエレクトロポレーション、膀胱尿路上皮細胞一過性発現のために具体的には DNA のプラスミッドを配信できることを示す.本手法は過剰発現とマウス膀胱における遺伝子のノックダウンのため迅速かつ便利な方法を提供します、膀胱がんや他の泌尿器科疾患の GEMMs を構築に適用することができます。
Introduction
遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) は、動物の開発、遺伝子機能生体内、および疾患進行1,2メカニズムに関する知識の拡大に重要な役割を演奏されています。生殖 GEMMs は伝統的に 2 つの方法で開発されています。最初の偽妊娠女性に受精卵移植による続く DNA のプラスミッドの前核注入によるトランスジェニック マウスの作成です。他のアウト/ノックアウト ・ ノックイン マウス胚性幹細胞での相同組み換えによる生成とキメラの開発です。興味の特定の組織や細胞の種類の遺伝子のノックアウト条件付きにはには、複数世代の Cre、flox のサイトと遺伝子組み換え遺伝子の繁殖が含まれます。全体のプロセスが高価な目標は、組織に複数の遺伝子を対象とする場合は特に、時間のかかることができます。最近では、クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの遺伝子編集技術はモデリング3、土着の癌組織特異遺伝子変異を誘導するマウスの複数の器官に適用されています。 4,5,6,7または8,9その場で正しい病気の突然変異。これらの研究では、gRNA ベクトル配信通常器官または流体の尾静脈注射のアデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染によって達成されました。利便性と癌の伝統的な Cre Lox 基づくマウス モデルと比較してこれらの器官のモデリングの効率、肺と肝臓への CRISPR コンポーネントの配信の相対的な容易さが大幅に向上します。
膀胱尿路上皮はほとんど膀胱腫瘍が発生します。膀胱尿路上皮癌モデリングや遺伝子治療への DNA ベクターの配信は、ウイルス感染の10、11の付着のための障壁として機能する頂尿路上皮表面にグリコサミノグリカン層によって妨げられています。Syn3 などドデシル-β-d-maltoside いくつかの前処理剤は、この障壁を破壊し、アデノ ウイルス感染効率12,13,14を高めるために使用されています。アデノ随伴ウイルス (通気) することができます効果的に膀胱に感染するかどうかは報告されていません。全体的にみて、非ウイルス性に基づいて配信方法が望ましいでしょう。ここでは、尿道カテーテル法, エレクトロポレーションによるマウス尿路への効率的な DNA プラスミド配信のラボで開発手法について述べる.我々 のアプローチは、グリコサミノグリカン レイヤーまたはウイルス産生の化学的前処理を含まない、それ自体が大幅 DNA プラスミドのマウス膀胱尿路への導入を簡略化し、様々 な体内調査を促進する必要があります。膀胱疾患。
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Protocol
ガイドラインと規制機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学サンタクルスからに従ってここで説明したすべての手順を行った。
1 プラスミドとツールの準備
- それぞれの膀胱を使って、DNA のプラスミッド (1 μ g/μ L) の少なくとも 20 μ L を準備します。
- 1.5 mL 容マイクロ チューブにおけるプラスミド溶液 20 μ L にトリパン ブルーの 1 μ L を追加します。よく混ぜてピペット。
- オートクレーブすべて手術機器および 70% のエタノールでワークスペースを滅菌します。スプレー手術器具や手袋の 70% エタノール頻繁または無菌状態を維持するために次の手順を実行するときにガラス ビーズ滅菌器を使用します。
2. 麻酔動物
- イソフルランと動物を麻酔するのにテーブル トップ麻酔システムを使用します。O2タンクをオンにし、1 L/分の酸素流量計を調整します。
- 誘導室に大人の女性 c57bl/6 j マウスを配置します。オンにし、誘導のための 3% にイソフルラン気化器を調整します。マウスは、先制鎮痛法の誘導室からマウスの除去時に皮下麻酔 2 分管理ブプレノルフィン鎮痛剤 (0.1 mg/kg) 以内でなければなりません。
注: このプロトコルでメスのマウスとして使用されます、尿道カテーテル留置中に操作しやすくしています。雄マウスのプロトコルも動作しますが、ステップ 3 を実行するときに余分な注意が必要です。 - 乾燥を防ぐためには、動物の目に眼軟膏を適用します。鼻の円錐形の鼻と加熱パッドの上を向いてハイパーカプニアのマウスを置きます。イソフルラン鼻の円錐形を通過させる空気回路のスイッチをオンにします。
- 頭と粘着テープで鼻の円錐形を抑制します。メンテナンスのための 2% にイソフルラン気化器を調整します。
- 粘着テープで手足を拘束します。動物は深い麻酔で、その後の腹部領域を剃るようにつま先ピンチ テストを実行します。
3. 尿の枯渇と膀胱洗浄
- (24 G、2.11 cm の長さ、0.045 cm の外径) カテーテルに潤滑剤を適用し、その外表面が完全に覆われていることを確認します。
- 尿道開口部にカテーテルを挿入し、その時点で尿をカテーテルを通じて流出、膀胱に達するまでゆっくりと差し込みます。尿枯渇のため腹部を優しく押します。
- かどうか、カテーテルが正しく挿入されて、膀胱に自動尿流出を観察することによって確認してください。尿道と膀胱壁の穿孔を回避し、必要な場合は、潤滑剤を複数回適用。
- 廃棄物ビーカーにピペットで尿を破棄します。
- まだ膀胱内のもう一方の端をカテーテルの外側の端にリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 80 μ L をピペットします。慎重に 1 mL 注射器をカテーテルに接続します。PBS を膀胱内に注入する注射器を軽く押します。カテーテルを膀胱内に空気の泡を作成するを避けるためにいくつかの PBS を残します。
- 注射器を削除します。膀胱から排出する PBS を待ちます。PBS を避難する腹部を優しく押します。
- 廃棄物のビーカーにピペットでカテーテルで PBS を破棄します。
- さらに 2 回の PBS (ステップ 3.4 3.6) を洗浄を繰り返します。
注意: 洗濯手順中に軽く動作するように重要です。カテーテルまたは自動の障害で血液流出液を尿道を貫通は通常を示します。エレクトロポレーション効率が低下するにも、気泡を導入することを避けるために重要です。
4. プラスミド配信
- 70% エタノールをマウスの腹腔に適用し、膀胱の上腹部の皮膚に 1 cm の縦切開をするメスを使用します。
- 、カテーテルの外側の端に少なくとも 20 μ L のプラスミド プラス トリパン ブルー溶液をピペット、注射器を取り付けます。
- 膀胱内にプラスミド溶液を注入します。膀胱が青に変わったら、注入は成功します。カテーテルを膀胱内に空気の泡を作成するを避けるためにいくつかの液体を残します。
- ピンセットを使用して外部の尿道口をつかむ、カテーテルと注射器を取り外します。文字列を使用して、外部の尿道口を締めます。文字列に 2 つのループを作るし、2 つのノットで結びます。
注: は、尿道の締付プラスミド液体の逆流を防止するために重要です。 - 次のパラメーターでエレクトロポレーション ジェネレーターをオンに: 33 v 系、50 ms の稼働時間、および 950 ms 間隔時間。
- ピンセットで膀胱を押し、2 つの電極と膀胱をピンチします。フットペダル、エレクトロポレーションを実行するを押してください。
注: 各ペダル プッシュ後 5 回短い間隔で発生する電気パルスが設定されます。マウスは、このプロセスでけいれんがあります。配信の効率を増やすことができます足のペダルを 2 回以上押すが、あまりにも多くの電気パルスは尿路の組織の整合性を損なうことができます。- 火花が生成されます、ピンセットと電極との間の接触を避けてください。
5. 回復
- 滅菌手術用縫合糸やクリップの出店を腹部、皮膚を縫合します。傷にヨウ素を適用します。
- イソフルラン システムから動物を削除します。手術後の痛みを軽減するため皮下にブプレノルフィン鎮痛剤 (0.1 mg/kg) を管理します。
- 加熱パッドで動物を飼うし、完全復旧後自宅のケージにそれを返します。通常の機動性、飲酒や摂食行動と感染の兆候切開が癒されるし、クリップを削除するまでに、少なくとも一度毎日動物を確認します。動物の痛みの症状を表示は、グルーミング、増加攻撃性と発声を削減など、ブプレノルフィン鎮痛薬の後の注射を管理します。
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Representative Results
膀胱尿路上皮への遺伝子導入の成功を示すためには、エレクトロポレーションに pCAG GFP15プラスミドを使用しました。尿道を通って注入されたプラスミドのトリパン ブルー溶液 20 μ L と 5 の電気パルスを投与します。48 時間後は、マウス膀胱を解剖し、負の制御 (図 1 a) GFP シグナルを示さなかったエレクトロポレーションを受けていない膀胱に対し解離蛍光顕微鏡下で GFP 蛍光のパッチを観察しました。サイトケラチン (CK) 5、CK18、断面化された膀胱組織の免疫蛍光染色を行った場合、GFP 抗体、我々 は GFP は信号の中間、傘で現在、基底細胞が、筋肉ではなく層 (図 1 b) を発見尿路にプラスミド配信の良い特異性を示します。尿路上皮細胞の約 15% は GFP+、およびそのようなクローンの性質は癌腫瘍は通常個々 のセルから開始以来のモデリングに最適なはず。
図 1: pCAG GFP プラスミドのマウス膀胱尿路上皮への配信成功。(右) (左)、エレクトロポレーションになって正常に膀胱が緑を示すネガティブ コントロール膀胱にエレクトロポレーションを施行した膀胱の (A) の比較。(B) 蛍光抗体法の傘に GFP+セルのモザイク表現パターンを示す断面膀胱組織の染色 (CK18+)、中間 (CK5+CK18+)、基底 (CK5+) 尿路上皮層。スケール バーでは50 μ m に 1 mm とbに対応この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
エレクトロポレーションは細胞膜透過性を高め、遺伝子電子伝達系16のための強力な技術です。電気穿孔法による生活を齧歯動物への遺伝子導入は神経生物学分野17,18,19,20,21によく使用されています。他の多くの器官の潜在的な応用は広範囲にわたって検討されていません。私たちの知る限り、ここで説明した手法は膀胱尿路上皮に電気穿孔法による正常な遺伝子デリバリーの最初の報告です。アデノ ウイルス、レンチ ウイルスによる感染方法にいくつかの利点を提供しています。まず、エレクトロポレーション法は、安全、簡単かつ遺伝的ウイルスベクターが使用され、特定の臓器サイト体内に DNA プラスミドの配信は比較的簡単なために採用するより安いです。第二に、それはウイルスのベクトルの22によって配信に関連付けられて多くの場合望ましくないホストの免疫反応を回避できます。第三に、膀胱の場合通常尿路上皮細胞にウイルスの結合をブロックするグリコサミノグリカン層の化学的前処理の必要性が否定されます。
このプロトコルの最も重要なステップは、カテーテル検査、洗浄、およびプラスミッド挿入。カテーテルが挿入を実行するとき、尿道や膀胱壁を貫通していないことを確保する必要が余分なケアと穏やかなハンドリングと注射器の取付・取外し。完全に外側をカバーする十分な潤滑剤を適用、カテーテルの表面も不可欠です。障害の別の考えられる原因は、電気伝導度が低下するので、洗浄とプラスミドの射出時膀胱内に空気の泡の紹介です。これを防ぐには、これらの手順を実行するときに、カテーテルでいくつかの液体を常に残してお勧めします。
若い (2 ヶ月) と古い (1 年) マウスの配信の効率の違いは見られなかったので、我々 のプロトコルはあらゆる年齢の大人のマウスのはずです。いくつかの要因は、プラスミド配信の効率に影響を与えます。低い量が膀胱の内側の表面が十分にカバーしないと 20 μ L 注入の最小限のボリュームとしてプラスミドをお勧めします。プラスミドの量と濃度を一般的に増加利回りより高い浸透が 60 μ L. 以上の電気パルスを与えるを超えてボリュームの付加的な利益が認められず、電極を用いた膀胱の別の表面部分に触れるが、配送効率の向上の最大のインパクト。このプロトコルで記述されているエレクトロポレーション パラメーターより高い電圧は、細胞死を誘導する傾向があるので、組織の整合性を維持しながら尿路上皮細胞の透過を許可するように設定されます。さらに最適化のためのこれらのパラメーターを微調整することが可能です。マウス-マウスの変化と研究者の処理大幅効率に影響することができます。プロジェクトの目的に応じて、各特定の実験に最適なパラメーターを決定するための試験を実行することをお勧めします。たとえば、癌の開始そしてクローナル成長をモデリング、低い浸透を必要があります。
証拠-の-原則として配信手法を提案、GFP 発現は穿孔後 36 時間早ければ膀胱で視覚化することし、少なくとも 2 週間保持できます。この新しい方法で、DNA プラスミドをマウス膀胱遺伝子過剰発現またはダウン規制とゲノム編集の高速かつ安価に提供することが可能です今。それは小説の土着膀胱癌モデルの構築し同様、膀胱の発達と病気、勉強のための新しい道を開きます。
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Disclosures
著者は競合する関心を宣言しません。
Acknowledgments
エレクトロポレーション システムのセットアップのヘルプ、箱陳教授、博士越張とケンディ ホアンに感謝します。この作品は、Z.A.W. にサンタ ・ クルスがん給付グループと NIH からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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