Summary
Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.
Abstract
Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) sont extrêmement précieux en révélant de nouveaux aperçus biologiques sur les mécanismes de déclenchement et la progression des maladies humaines comme le cancer. L’ablation des tissus spécifiques ou d’un cellule types in vivoou souris transgéniques et conditionnel ont été fréquemment utilisés pour la surexpression du gène. Cependant, la génération de modèles de souris de lignée germinale peut être lente et coûteuse. Des avancées récentes gène édition de technologies et la faisabilité de délivrer des plasmides d’ADN par infection virale ont permis la génération rapide des modèles de cancer de souris autochtone non germinale pour plusieurs organes. La vessie est un organe qui a été difficile pour les vecteurs viraux accéder, en raison de la présence d’une couche de glycosaminoglycanes couvrant l’urothélium. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour une prestation efficiente des plasmides d’ADN dans la souris vessie urothélium in vivo. L’instillation intravésicale de plasmides d’ADN pCAG-GFP et électroporation de vessie chirurgicalement exposée, nous montrons que le plasmide d’ADN peut être livré plus précisément dans les cellules urothéliales de vessie pour expression transitoire. Notre méthode fournit un moyen rapide et pratique pour la surexpression et inactivation de gènes dans la vessie de souris et peut être appliqué à la construction de négociants de cancer de la vessie et d’autres maladies urologiques.
Introduction
Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) jouent un rôle essentiel dans l’expansion de nos connaissances sur le développement animal, fonctions gène in vivoet mécanismes de la progression de la maladie1,2. Gregory de la lignée germinale sont traditionnellement développés de deux façons. La première est la création de souris transgéniques par injection pronucléaire de plasmides d’ADN suivie par la transplantation des zygotes dans les femelles pseudo-gravides. L’autre est la génération de souris knock-out/knock-in par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires et le développement des chimères. Masquage conditionnel des gènes chez le type spécifique de tissus ou de cellules d’intérêt consiste à l’élevage des allèles génétiquement avec Cre et flox sites depuis plusieurs générations. L’ensemble du processus peut être long et coûteux, surtout si l’objectif est de cibler des gènes multiples tissu-spécifique. Récemment, édition de gène des technologies telles que les répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) ont été appliquées à plusieurs organes des souris pour provoquer des altérations génétiques tissu-spécifique du cancer autochtone modélisation3, 4,5,6,7 ou maladie correcte des mutations in situ8,9. Dans ces études, la livraison des vecteurs gRNA est habituellement réalisée par infection adénovirale ou des gènes de l’organe ou l’injection hydrodynamique de queue veineuse. La relative facilité de livraison des composants CRISPR pour le poumon et le foie a grandement amélioré la commodité et l’efficacité du cancer modélisation dans ces organes par rapport à des modèles de souris Cre-Lox basés traditionnels.
L’urothélium de vessie est d'où sont originaires la plupart des tumeurs de la vessie. La livraison des vecteurs d’ADN à l’urothélium vessie pour le traitement de modélisation ou de gène du cancer est entravée par une couche de glycosaminoglycanes sur la surface apicale urothéliales, qui agit comme une barrière pour l’adhérence des virus infectieux10,11. Plusieurs agents de prétraitement tels que Syn3 et dodécyl-β-d-maltoside ont été utilisés pour perturber cette barrière et améliorer les adénovirus infection efficacité12,13,14. Si les virus adéno-associés (AAVs) peuvent infecter efficacement la vessie n’a été signalé. Dans l’ensemble, une méthode de livraison basée non viraux serait souhaitable. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour la prestation efficace de plasmide d’ADN à l’urothélium de souris par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Parce que notre approche n’implique pas de prétraitement chimique de la couche de glycosaminoglycanes ou la production de virus, il a considérablement simplifie la livraison de plasmides d’ADN à l’urothélium de vessie de souris et devrait faciliter diverses des études in vivo des maladies de la vessie.
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Protocol
Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées selon les directives et les règlements de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.
1. le plasmide et préparation des outils
- Pour chaque vessie à transfecter, préparer au moins 20 µL de plasmides d’ADN (1 µg/µL).
- Ajouter 1 µL de bleu Trypan dans les 20 µL de solution de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Pipette pour bien mélanger.
- Autoclave tout surgical instruments et stériliser l’espace de travail avec l’éthanol à 70 %. Vaporiser les instruments chirurgicaux et des gants d’éthanol à 70 % fréquemment ou utiliser un stérilisateur de perle de verre lorsque vous effectuez les étapes suivantes pour maintenir des conditions stériles.
2. anesthésier l’Animal
- Utilisent un système d’anesthésie top table à anesthésier l’animal à l’isoflurane. Le réservoir de2 O et régler le débitmètre oxygène à 1 L/min.
- Placez une souris de C57BL/6J femelle adulte dans la chambre de l’induction. Allumer et régler le vaporisateur isoflurane à 3 % pour l’induction. La souris doit être en anesthésie dans 2 min. administrer buprénorphine analgésique (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée après le retrait de la souris de la salle d’induction pour l’analgésie préventive.
Remarque : Dans le présent protocole, les souris femelles sont utilisés, car ils sont plus faciles à manipuler au cours du cathétérisme de l’urètre. Le protocole fonctionne également pour les souris mâles, mais il faut redoubler de prudence lorsque vous effectuez l’étape 3. - Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement. Placez votre souris anesthésiée vers le haut sur un coussin chauffant avec son nez dans le cône de nez. Tournez l’interrupteur de circuit d’air pour laisser l’isoflurane passent par le cône de nez.
- Retenir la tête et le cône de nez avec du ruban adhésif. Ajuster le vaporisateur isoflurane à 2 % pour l’entretien.
- Retenir les branches avec du ruban adhésif. Effectuer des tests d’orteil-pincée pour s’assurer que l’animal soit en anesthésie profonde et ensuite se raser la zone abdominale.
3. urines appauvrissement et rinçage de vessie
- Appliquer du lubrifiant sur le cathéter (24G, longueur de 2,11 cm, diamètre extérieur de 0,045 cm) et faire en sorte que sa surface extérieure est entièrement couvert.
- Introduire le cathéter dans l’ouverture de l’urètre et pousser doucement jusqu'à ce qu’il atteigne la vessie, date à laquelle l’urine devrait sortir dans le cathéter. Appuyez doucement sur l’abdomen pour aider l’appauvrissement de l’urine.
- Vérifiez si le cathéter est correctement inséré dans la vessie par l’observation automatique urine hors-flux. Éviter la perforation de la paroi de l’urètre et la vessie et appliquer du lubrifiant plusieurs fois si nécessaire.
- Jeter l’urine avec une pipette dans un bécher de déchets.
- Pipetter 80 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans l’extrémité du cathéter, avec l’autre extrémité reste dans la vessie. Fixer attentivement une seringue de 1 mL au cathéter. Poussez doucement la seringue pour injecter le PBS dans la vessie. Laissez quelques PBS dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.
- Retirer la seringue. Attendez que PBS s’écouler hors de la vessie. Appuyez doucement sur l’abdomen pour évacuer les PBS.
- Jeter le PBS dans le cathéter avec une pipette dans le bécher de déchets.
- Répétez les PBS de lavage (étapes 3,4-3,6) pour deux fois plus.
Remarque : Il est indispensable de travailler doucement au cours de ces étapes de lavage. Sang dans le cathéter ou l’échec d’automatique hors-flux du liquide indique habituellement que l’urètre est transpercée. Il est également important d’éviter l’introduction de bulles d’air, puisqu’ils diminuerait l’efficacité de l’électroporation.
4. plasmide livraison
- Appliquer l’éthanol à 70 % à l’abdomen de la souris et utiliser un scalpel pour pratiquer une incision verticale de 1 cm pour ouvrir la peau abdominale au-dessus de la vessie.
- Pipetter, au moins 20 µL de solution de bleu de Trypan plus de plasmide dans l’extrémité du cathéter et connecter la seringue.
- Injecter la solution de plasmide dans la vessie. Si la vessie devient bleue, l’injection est réussie. Laisser peu de liquide dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.
- Prenez l’orifice urétral externe à l’aide de pinces à épiler et puis retirer le cathéter et la seringue. Utilisez une corde pour serrer l’orifice urétral externe. Faites deux boucles avec la chaîne et puis lier avec deux noeuds.
Remarque : Resserrement de l’urètre est important pour empêcher le reflux du liquide de plasmide. - Mettre en marche le générateur d’électroporation avec les paramètres suivants : 33V, 50 ms de temps de travail et Mme 950 intervalle de temps.
- Tenez la vessie avec des pincettes et pincer la vessie avec deux électrodes. Poussez la pédale pour effectuer l’électroporation.
Remarque : Les impulsions électriques sont configurées produisant 5 fois à intervalles courts après chaque pédale poussoir. La souris peut se contracter dans ce processus. En poussant la pédale plusieurs fois peut accroître l’efficacité de la livraison, mais trop d’impulsions électriques peuvent endommager l’intégrité des tissus de l’urothélium.- Évitez tout contact entre les pinces et les électrodes, car cela va générer une étincelle.
5. le recouvrement
- L’ouverture abdominale et de la peau avec stériles pour sutures chirurgicales et agrafes de suture. Appliquer l’iode sur la plaie.
- Enlever l’animal du système isoflurane. Administrer un analgésique de buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire.
- Garder l’animal sur le coussin chauffant et renvoyez-le à la cage après récupération complète. Vérifier l’animal au moins une fois par jour pour la mobilité normale et d’abreuvement des comportements et aucun signe d’infection jusqu'à ce que l’incision est guérie et puis retirez les clips. Administrer les injections ultérieures de buprénorphine analgésique si l’animal affiche symptôme douleur tels que la diminution de toilettage, augmente l’agressivité et vocalisation.
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Representative Results
Pour démontrer le succès de la livraison de gène dans la vessie urothélium, nous avons utilisé le plasmide de15 pCAG-GFP électroporation. 20 µL de plasmides et de solution de bleu de Trypan est injecté à travers l’urètre et 5 impulsions électriques ont été administrées. Après 48 h, nous disséqué la vessie de souris et observé des patchs de fluorescence GFP sous le microscope de fluorescence de dissection, alors qu’un négatif contrôler la vessie qui n’a pas subi d’électroporation n’affiche aucun signal de GFP (Figure 1 a). Lorsque nous avons effectué immunofluorescence souillant des tissus de la vessie sectionnés avec cytokératines (CK) 5, CK18, et anticorps GFP, nous avons trouvé que la GFP était présent en parapluie, intermédiaire et des cellules basales de signaux, mais pas dans le muscle de la couche (Figure 1 b), indiquant la bonne spécificité vecteurs de plasmide dans l’urothélium. Environ 15 % des cellules urothéliales sont GFP+, et telle nature clonale devrait être idéal pour le cancer car les tumeurs habituellement lancer de cellules individuelles de modélisation.
Figure 1 : mise en œuvre réussie du plasmide pCAG-GFP à la souris la vessie urothélium. (A) Comparaison de la vessie qui a subi une électroporation (à droite) à une vessie de contrôle négatif (à gauche) montrant qu’électroporation tourné avec succès la vessie au vert. Immunofluorescence (B) la coloration des tissus sectionnés vessie montrant la mosaïque de l’expression des cellules GFP+ dans umbrella (CK18+), intermédiaire (CK5+CK18+) et basale (CK5+) couches urothéliales. Echelle a correspond à 1 mm et b à 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Électroporation améliore la perméabilité de la membrane cellulaire et est une technologie puissante pour le gène Electrotransfert16. Livraison de gène dans la vie des rongeurs par électroporation a été fréquemment utilisé en neurobiologie champs17,18,19,20,21. Ses applications potentielles dans de nombreux autres organes n’ont pas été explorées intensivement. À notre connaissance, notre méthode décrite ici est le premier rapport de la livraison de gène réussie par électroporation pour l’urothélium de vessie. Il offre plusieurs avantages pour les méthodes de l’infection à adénovirus/lentivirus-basé. Tout d’abord, la méthode d’électroporation est plus facile, plus sûre et moins cher d’adopter car les vecteurs non viraux de génétiques sont utilisés et la fourniture de plasmides d’ADN aux organes particuliers sites in vivo est relativement simple. Deuxièmement, elle évite les réponses immunitaires des hôtes indésirables qui sont souvent associés à la livraison par virus vecteurs22. En troisième lieu, dans le cas de la vessie, il nie la nécessité d’un prétraitement chimique de la couche de glycosaminoglycanes, qui bloque normalement contraignante du virus aux cellules urothéliales.
Les étapes plus critiques dans le présent protocole sont le cathétérisme, le rinçage et l’injection de plasmides. Redoublez de prudence et de la manipulation douce sont nécessaires pour s’assurer que le cathéter ne pas percer à travers l’urètre ou la paroi de la vessie lors de l’exécution d’insertion et de mettre en place/enlever la seringue. Appliquer du lubrifiant adéquat pour recouvrir entièrement l’extérieur surface du cathéter est également essentielle. Une autre cause probable de l’échec est l’introduction de bulles d’air dans la vessie pendant l’injection de rinçage et le plasmide, puisqu’elle va diminuer la conductivité électrique. Pour éviter cela, nous vous recommandons de toujours laissant peu de liquide dans le cathéter lors de l’exécution de ces étapes.
Notre protocole devrait fonctionner pour des souris adultes de tout âge, car nous n’avons pas observé une différence dans l’efficacité de la livraison entre jeunes (2 mois) et les plus âgés (1 an) souris. Plusieurs facteurs peuvent influencer l’efficacité de livraison de plasmide. Nous recommandons 20 µL du plasmide comme le volume minimal pour injection comme montant inférieur ne peut pas suffisamment compte de la surface interne de la vessie. Augmentation de volume de plasmide et concentration généralement les rendements pénétration plus élevée, mais aucun avantage supplémentaire a été observée pour les volumes au-delà de 60 µL. donnant des impulsions électriques plus et toucher des surfaces différentes de la vessie avec électrodes aura la plus d’impact sur l’amélioration de l’efficacité de livraison. Les paramètres d’électroporation décrites dans le présent protocole est défini pour autoriser la perméabilisation de cellules urothéliales tout en préservant l’intégrité des tissus, car une tension plus élevée tend à induire la mort cellulaire. Il est possible de modifier ces paramètres pour l’optimisation supplémentaire. Souris-à des variations et la manipulation du chercheur peuvent affecter grandement l’efficacité. Selon l’objectif du projet, nous vous recommandons d’effectuer des essais pour déterminer les meilleurs paramètres pour chaque expérience spécifique. Par exemple, pour modéliser la croissance clonale et déclenchement du cancer, une réduction de la pénétration peut être souhaitable.
Comme une preuve de principe de notre méthode de livraison, expression de la GFP peut être visualisée dans la vessie aussi tôt que 36 h après électroporation et peut persister pendant au moins deux semaines. Avec cette nouvelle méthode, il est maintenant possible de livrer des plasmides d’ADN à la vessie de souris rapide et à moindre coût pour la surexpression du gène ou de régulation à la baisse et de modification du génome. Il ouvre de nouvelles voies pour étudier le développement de la vessie et les maladies, mais aussi de construire des modèles de cancer de vessie autochtone roman.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le professeur Bin Chen, m. Yue Zhang et Kendy Hoang pour aide à la mise en place du système d’électroporation. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Santa Cruz Cancer avantage Group et le NIH à Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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