Summary
Мы опишем новый метод для доставки плазмида ДНК в клетки мыши мочевого пузыря в естественных условиях через катетеризация уретры и электропорации urothelial. Она предлагает быстрый и удобный способ для генерации автохтонные мыши модели заболеваний мочевого пузыря.
Abstract
Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются чрезвычайно ценными в раскрытии Роман биологических проницательности в инициации и прогрессии механизмы заболеваний человека, таких как рак. Трансгенные и условного нокаут мышей часто использовались для гиперэкспрессия генов или абляции в определенных тканях или ячейка типы в естественных условиях. Однако создавая микрофлорой мыши модели может быть длительным и дорогостоящим. Последние достижения в гене редактирования технологии и возможности доставки ДНК плазмиды вирусной инфекции позволили быстрого поколения не микрофлорой автохтонные мыши рака модели для нескольких органов. Мочевого пузыря представляет собой орган, который был трудным для вирусных векторов для доступа благодаря наличию Глюкозаминогликан слой, покрывающий Уротелий. Здесь мы опишем новый метод разработан в лаборатории для эффективной доставки ДНК плазмиды в мыши мочевого пузыря Уротелий в vivo. Через внутрипузырной инстилляции плазмидной ДНК pCAG-GFP и электропорации хирургически подвергаются пузыря мы покажем, что плазмида ДНК могут быть доставлены специально в urothelial клетки мочевого пузыря для переходных выражения. Наш метод обеспечивает быстрый и удобный способ для гиперэкспрессия и сногсшибательно генов в мочевом пузыре мыши и может применяться для строительства GEMMs рака мочевого пузыря и других урологических заболеваний.
Introduction
Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) играют важную роль в расширении наших знаний о развития животных, Джин функций в естественных условияхи механизмы болезнь прогрессии1,2. GEMMs микрофлорой традиционно разрабатываются двумя способами. Во-первых, создание трансгенных мышей pronuclear инъекции плазмидной ДНК, после трансплантации зигот в pseudopregnant самок. Другой — поколение стук out/стучите в мышей, гомологичная рекомбинация в эмбриональных стволовых клеток и развитие химер. Условное нокаут генов в определенный тип ткани или клетки интерес включает разведения генетически аллели с КРР и flox сайтов для нескольких поколений. Весь процесс может быть дорогостоящим и трудоемким, особенно если цель ткани специально для нескольких генов. Недавно ген редактирования технологий, таких как кластеризованные регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) были применены к несколько органов мышей, чтобы вызвать генетические изменения ткани конкретных автохтонные рака, моделирование3, 4,5,6,7 или мутации правильный болезнью в situ8,9. В этих исследованиях доставки gRNA векторов обычно достигается через аденовирусных или лентивирусные инфекции органа или гидродинамические инъекции хвост Вену. Относительная легкость доставки ТРИФОСФАТЫ компонентов в легких и печени позволило значительно улучшить удобство и эффективность моделирования в этих органах, по сравнению с традиционными моделями мыши Cre-Lox основе раком.
Уротелий мочевого пузыря является, откуда поступает большинство опухолей мочевого пузыря. Глюкозаминогликан слой на поверхности апикальной urothelial, который действует как барьер для присоединения инфекционных вирусов10,11препятствует доставки ДНК векторов Уротелий мочевого пузыря для моделирования или генной терапии рака. Чтобы сорвать этот барьер и повышения аденовирусной инфекции эффективность12,,1314были использованы несколько предварительной обработки агентов, таких как Syn3 и додецил β-d-maltoside. Ли аденоассоциированный вирусов (AAVs) можно эффективно заразить мочевого пузыря не сообщалось. В целом желательно метод-вирусной основе доставки. Здесь мы опишем новый метод разработан в лаборатории для эффективной доставки плазмида ДНК Уротелий мыши через катетеризация уретры и электропорации. Потому что наш подход не предполагает химической предварительной Глюкозаминогликан слоя или вирус производства, он значительно упрощает доставку ДНК плазмиды в мыши Уротелий мочевого пузыря и должно способствовать различных в vivo исследований заболевания мочевого пузыря.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь процедуры выполнялись в соответствии с руководящими принципами и положениями от институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Калифорнийского университета Санта-Крус.
1. плазмиды и инструменты подготовки
- Для каждого пузыря transfect, подготовить по крайней мере 20 мкл плазмидной ДНК (1 мкг/мкл).
- 1 мкл Трипановый синий, с тем чтобы 20 мкл раствора плазмида в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Пипетка для хорошо перемешайте.
- Автоклав всех хирургических инструментов и стерилизовать рабочей области с 70% этиловом спирте. Spray хирургических инструментов и перчатки с 70% этанол часто или использовать стерилизатор шарик стекла при выполнении следующих шагов для поддержания стерильных условий.
2. анестезировать животных
- Используйте систему Топ анестезии таблицы чтобы анестезировать животное с изофлюрановая. Включите танк O2 и отрегулировать расходомера кислорода до 1 Л/мин.
- Место взрослого женского C57BL/6J мышь в зале индукции. Включить и настроить изофлюрановая испарителя до 3% для индукции. Мышь должна быть в анестезии в течение 2 мин администрирование бупренорфин обезболивающее (0,1 мг/кг) подкожно после удаления мыши от индукции камеры вытеснением анальгезии.
Примечание: В настоящем Протоколе, самок мышей используются, поскольку они легче работать с при катетеризации мочеиспускательного канала. Протокол также работает для мышей-самцов, но осторожность необходима при выполнении шага 3. - Применить глазной мази в глаза животного, чтобы предотвратить сухость. Место анестезированные мышь вверх на грелку с его носом в носовой конус. Переключатель цепи воздуха, чтобы пройти через носовой конус изофлюрановая.
- Удержать голову и носовой конус с клейкой лентой. Отрегулируйте изофлюрановая испарителя до 2% для обслуживания.
- Останови конечностей клейкой лентой. Выполните тесты мыс щепотка чтобы убедиться, что животное находится в глубокой анестезии и затем побрить брюшной области.
3. мочи истощения и промывка мочевого пузыря
- Смазать катетера (24G, длина 2.11 см, диаметр 0,045 см) и убедитесь, что его внешняя поверхность полностью покрыта.
- Вставить катетер в отверстие мочеиспускательного канала и медленно толкать его, пока он не достигнет мочевого пузыря, в котором время должна вытекать моча через катетер. Аккуратно нажмите на живот, чтобы помочь мочи истощения.
- Проверьте, если катетер вводится правильно в мочевой пузырь, наблюдая автоматический мочу потока на выходе. Избегайте пирсинг стенку уретры и мочевого пузыря и смазать смазкой несколько раз, если это необходимо.
- Отказаться от мочи с пипеткой в отходов стакан.
- Пипетка 80 мкл-фосфатный буфер (PBS) в наружный конец катетера, с другой конец еще в мочевом пузыре. Шприц 1 мл тщательно приложите катетер. Аккуратно вставьте шприц впрыснуть PBS в мочевом пузыре. Оставьте несколько PBS в катетер, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в мочевом пузыре.
- Удалите шприц. Ждать для PBS для слива из мочевого пузыря. Аккуратно нажмите живот эвакуировать PBS.
- Выбросите PBS в катетер с пипеткой в отходов стакан.
- Повторите PBS, мойки (шаги 3.4-3.6) для еще два раза.
Примечание: Важно, аккуратно работать во время стирки действия. Кровь в катетер или провал Автоматическая выгрузка жидкости обычно указывает мочеиспускательного канала является пронзили через. Также важно избегать введения пузырьки воздуха, как они будут снизить эффективность электропорации.
4. плазмида доставки
- Применить 70% этанола в брюшную полость мыши и использовать скальпель сделать вертикальный разрез 1 см, чтобы открыть брюшной кожи над мочевого пузыря.
- Пипетка по меньшей мере 20 мкл плазмида плюс Трипановый синий раствор в наружный конец катетера и прикрепите шприц.
- Inject плазмида решение в мочевом пузыре. Если мочевого пузыря становится синим, инъекции является успешной. Оставьте некоторые жидкости в катетер, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в мочевом пузыре.
- Grab внешние отверстия уретры с помощью пинцета и затем удалите катетер и шприц. Используете строку, чтобы затянуть внешние отверстия уретры. Сделать две петли со строкой, а затем связать с двух узлов.
Примечание: Ужесточение уретры имеет важное значение для предотвращения обратного потока жидкости плазмиды. - Включите электропорации генератор со следующими параметрами: 33V, 50 мс, рабочее время и время интервала 950 МС.
- Держите мочевого пузыря с помощью пинцета и щепотку мочевого пузыря с двумя электродами. Нажмите педаль для выполнения электропорации.
Примечание: Электрические импульсы устанавливаются происходят 5 раз с короткими интервалами после каждого нажатия педали газа. Мышь может судорога в этом процессе. Несколько раз нажав педаль может повысить эффективность доставки, но слишком много электрических импульсов может повредить ткани целостность Уротелий.- Избегайте любого контакта между пинцет и электродов, как это будет создавать искры.
5. Восстановление
- Шовные брюшной и кожи Открытие с стерильные хирургические шовные и клипы. Примените йода на рану.
- Удалите из системы изофлюрановая животное. Администрировать бупренорфин обезболивающее (0,1 мг/кг) подкожно для облегчения послеоперационные боли.
- Держать животное на грелку и вернуть его домой клетку после полного восстановления. Проверьте животное по крайней мере один раз в день для нормальной подвижности, пить и кормления поведения и никаких признаков инфекции пока разрез исцелил и затем удалить клипы. Администрировать последующие инъекции бупренорфина анальгетик, если животное показывает болевой симптом, такие, как снижение груминг, увеличена агрессивность и вокализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать успех доставки генов в Уротелий мочевого пузыря, мы использовали плазмиду15 pCAG-GFP для электропорации. 20 мкл плазмиды и Трипановый синий решение было впрыснуто через уретру и вводили 5 электрические импульсы. После 48 ч мы расчлененный мыши мочевого пузыря и отмечает патчи GFP флуоресценции под микроскопом флуоресценции рассечение, тогда как отрицательный контроль мочевого пузыря, которая не претерпела электропорация, показали отсутствие сигнала GFP (Рисунок 1A). Когда мы проводили, иммунофлюоресценции окрашивания тканей секционного мочевого пузыря с Цитокератины (CK) 5, CK18, и антитела GFP, мы обнаружили, что GFP сигнал присутствует в зонт, промежуточный, и базальных клеток, но не в мышце слоя (рис. 1B), указанием хорошо специфика плазмида доставки в Уротелий. Приблизительно 15% из urothelial клеток являются GFP+, и такие клоновых природа должна быть идеально подходит для моделирования, поскольку опухоли обычно инициировать из отдельных клеток рака.
Рисунок 1: успешная доставка плазмида pCAG-GFP для мыши мочевого пузыря Уротелий. (A) сравнение мочевого пузыря, который подвергся электропорации (справа), чтобы отрицательный контроль мочевого пузыря (слева) показывающ что электропорации успешно превратили мочевого пузыря зеленый. Иммунофлюоресценции (B) окрашивания тканей секционного мочевого пузыря, показаны мозаичной картины выражения гена GFP+ клеток в зонтик (CK18+), промежуточном (CK5+CK18+) и базальных (CK5+) urothelial слои. Линейки в A соответствует до 1 мм и B 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электропорация повышает проницаемость клеточной мембраны и — это мощная технология для гена electrotransfer16. Джин доставки в жизни грызунов путем электропорации часто используются в нейробиологии поля17,18,19,,2021. Ее потенциал применения во многих других органах широко не изучены. Насколько нам известно наш метод, описанный здесь является первый доклад об успешных гена доставки путем электропорации Уротелий мочевого пузыря. Она предлагает несколько преимуществ методов на основе аденовирус/человека инфекции. Во-первых метод электропорации, проще, безопаснее и дешевле принять потому что используются-вирусных векторов генетических и доставки ДНК плазмиды конкретного органа сайтов в естественных условиях является относительно простым. Во-вторых это позволяет избежать нежелательных принимающей иммунных реакций, которые часто связаны с доставкой вирусных векторов22. В-третьих в случае мочевого пузыря, он отрицает необходимость химической предварительной Глюкозаминогликан слоя, который обычно блокирует вирус привязки к urothelial клеткам.
Наиболее важные шаги в этом протоколе являются катетеризации, полоскания и плазмиды инъекции. Дополнительный уход и нежный обработки необходимы для обеспечения что катетер не проткнуть стенку мочевого пузыря или мочеиспускательного канала при выполнении вставки и прикрепление/удаление шприца. Смазать достаточное для полного покрытия Внешняя поверхность катетера также имеет важное значение. Другой вероятной причиной отказа является введение воздушных пузырьков в мочевой пузырь во время промывки и плазмиды инъекции, так как это уменьшит электрической проводимости. Чтобы предотвратить это, мы рекомендуем всегда оставляя некоторые жидкости в катетер при выполнении этих шагов.
Наш протокол должен работать для взрослых мышей любого возраста, потому что мы не наблюдали разница в эффективности доставки молодых (2 месяца) и пожилых (1 год) мышах. Несколько факторов могут влиять эффективности доставки плазмиды. Мы рекомендуем 20 мкл плазмида как минимальный объем для инъекций как меньшую сумму не могут достаточно покрытия внутренней поверхности мочевого пузыря. Увеличивая объем плазмиды и концентрации обычно дает более высокие проникновение, но никаких дополнительных преимуществ было отмечено для томов за пределами 60 мкл. давая больше электрические импульсы и трогательно разные площади поверхности мочевого пузыря с электродами будет иметь наибольшее влияние на повышение эффективности доставки. Электропорация параметры, описанные в настоящем Протоколе установлен разрешить permeabilization urothelial клеток при сохранении целостности тканей, поскольку более высокие напряжения, как правило, вызывают гибель клеток. Это позволяет настроить эти параметры для дальнейшей оптимизации. Вариации на мышь и обработку исследователь может значительно влияют на эффективность. В зависимости от цели проекта рекомендуется выполнять исследования, чтобы определить наилучшие параметры для каждого конкретного эксперимента. Например в моделировании начала рака и клоновых роста, Нижняя проникновения может быть пожеланным.
Как доказательство из принцип для нашего метода доставки экспрессия гена GFP могут быть визуализированы в мочевом пузыре 36 h в кратчайшие сроки после электропорация и может сохраняться в течение по крайней мере две недели. С этим новым методом это теперь возможно доставить мочевого пузыря мыши быстро и недорого гиперэкспрессия генов или вниз регулирование и изменения генома ДНК плазмиды. Она открывает новые возможности для изучения развития мочевого пузыря и заболеваниях, а так же строительство Роман автохтонные мочевого пузыря рак модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим профессор Бен Чэнь, д-р Чжан Юэ и Кенди Hoang за помощь в настройке системы электропорации. Эта работа была поддержана от грантов от Санта-Крус рак пособие группы и низ Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
