Summary
Vi beskriver en ny metode for levering av DNA plasmider inn i urothelial celler av musen blæren i vivo gjennom urinrøret catheterization og electroporation. Det tilbyr en rask og enkel måte for autochtonous musen modeller av blæren sykdommer.
Abstract
Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) er svært verdifull i avslørende romanen biologiske innsikt i initiering og progresjon mekanismer av menneskelige sykdommer som kreft. Transgene og betinget knockout mus er ofte brukt for gene overuttrykte eller ablasjon i bestemte vev eller cellen typer i vivo. Men kan germline musen modeller være tidkrevende og kostbare. Siste fremskritt i genet teknologier og muligheten for å levere DNA plasmider ved virusinfeksjon har aktivert rask generasjonen non-germline autochtonous musen kreft modeller for flere organer. Blæren er et organ som har vært vanskelig for viral vektorer til av et glycosaminoglycan lag som dekker urothelium. Her beskriver vi en ny metode utviklet i laboratoriet for effektiv levering av DNA plasmider i musen blæren urothelium i vivo. Gjennom intravesical instillasjon av pCAG-GFP DNA plasmider og electroporation av kirurgisk eksponert blæren viser vi at DNA plasmider leveres spesielt i blæren urothelial celler for forbigående uttrykk. Vår metode gir en rask og enkel måte for overuttrykte og knockdown av gener i musen blæren, og kan brukes til å bygge GEMMs for blærekreft og andre Urologiske sykdommer.
Introduction
Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) har spilt en viktig rolle i å utvide vår kunnskap om animalske utvikling, gene funksjoner i vivoog mekanismer for sykdom progresjon1,2. Germline GEMMs er tradisjonelt utviklet på to måter. Først er etableringen av transgene mus ved pronuclear injeksjon av DNA plasmider etterfulgt av transplantasjon av zygotes i pseudopregnant kvinner. Den andre er generasjonen av knock-out/knock-i mus av homologe rekombinasjon i embryonale stamceller og utvikling av chimeras. Betinget knockout av gener i bestemte vev eller celle type interesse innebærer oppdrett av genmodifiserte alleler med grobunn og flox i flere generasjoner. Hele prosessen kan være dyrt og tidkrevende, særlig hvis målet er å målrette flere gener vev-spesielt. Nylig, gen-redigering teknologier som gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) er brukt på flere organer av mus å indusere vev-spesifikke genetiske endringer for autochtonous kreft modellering3, 4,5,6,7 eller riktig sykdom mutasjoner i situ8,9. I disse studiene, var levering av gRNA vektorer vanligvis oppnås gjennom adenoviral eller lentiviral infeksjoner av orgel eller etter halen blodåre injeksjon. Det er relative enkelt for levering av CRISPR komponenter til lunge og lever har kraftig forbedret bekvemmeligheten og effektiviteten av kreft modellering i disse organene sammenlignet med de tradisjonelle grobunn-Lox basert musen modellene.
Blæren urothelium er der de fleste blæren svulster stammer. Levering av DNA vektorer til blære urothelium for kreft modellering eller gene terapi er hindret av et glycosaminoglycan på apikale urothelial overflaten, som fungerer som en barriere for tilslutning smittsomme virus10,11. Flere forbehandling agenter som Syn3 og dodecyl-β-d-maltoside har blitt brukt til å avbryte denne barrieren og forbedre adenovirus, infeksjon, effektivitet,12,,13,,14. Om adeno-assosiert virus (AAVs) effektivt kan infisere blæren er ikke rapportert. Overall, en ikke-viral basert leveringsmetode ville være ønskelig. Her beskriver vi en ny metode utviklet i laboratoriet for effektiv DNA plasmider levering til musen urothelium gjennom urinrøret catheterization og electroporation. Fordi vår tilnærming ikke innebærer kjemisk forbehandling av glycosaminoglycan laget eller virus produksjon, det betydelig forenkler levering av DNA plasmider i musen blæren urothelium, og skal lette ulike i vivo studier blæren sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet her ble utført i henhold til retningslinjer og regler fra institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av UC Santa Cruz.
1. plasmider og verktøy forberedelse
- For hver blæren til transfect, forberede minst 20 µL av DNA plasmider (1 µg/µL).
- Legge til 1 µL Trypan blå 20 µL av plasmider løsning i et 1,5 mL microcentrifuge rør. Pipetter til blandingen.
- Autoclave alle kirurgiske instrumenter og sterilisere arbeidsområdet med 70% etanol. Spray Kirurgiske instrumenter og hansker med 70% etanol ofte eller bruke et glass bead sterilisere når følgende fremgangsmåte for å opprettholde sterile forhold.
2. anaesthetizing dyr
- Bruke en tabell topp anestesi system til å bedøve dyret med isoflurane. Slå på O2 tank og justere oksygen flowmeter til 1 L/min.
- Plass en voksen kvinne C57BL/6J musen i induksjon kammeret. Aktivere og justere isoflurane vaporizer 3% for induksjon. Musen skal være i anestesi innen 2 min. administrere buprenorfin smertestillende (0,1 mg/kg) subcutaneously ved fjerning av musen fra induksjon kammer for preemptive analgesi.
Merk: I denne protokollen, kvinnelige mus brukes som de er enklere å arbeide med under urinrøret catheterization. Protokollen fungerer også for mannlige mus, men ekstra forsiktig er nødvendig når utføre trinn 3. - Ophthalmica salve gjelde øynene til dyret å hindre tørrhet. Plass anaesthetized musen vendt opp på en heten pute med nesen sin i nesen kjegle. Slå luft krets for å la isoflurane gå gjennom nesen kjegle.
- Holde hodet og nesen kjegle med teip. Justere isoflurane vaporizer til 2% for vedlikehold.
- Holde beina med teip. Utføre tå-klype tester dyret er i dyp anestesi og deretter barbere mageområdet.
3. urin uttømming og blæren skylling
- Smøremiddel gjelder kateter (24G, lengden på 2.11 cm, ytre diameter på 0.045 cm) og sikre at ytre overflaten er helt dekket.
- Kateter inn i urinrøret åpning og sakte skyve den til den når blæren, da urinen skal flyte ut gjennom kateter. Trykk forsiktig magen å urin uttømming.
- Sjekk Hvis kateter er satt riktig inn blæren ved å observere automatisk urin ut flyt. Unngå piercing urinrøret og blæren veggen, og bruke smøremiddel flere ganger om nødvendig.
- Kast urinen med en pipette i et avfall beger.
- Pipetter 80 µL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) i den ytre enden av kateter, med den andre enden i blæren. Nøye fest 1 mL sprøyte kateter. Skyv forsiktig sprøyten å injisere PBS i blæren. La noen PBS i kateter å unngå å skape luftbobler i blæren.
- Fjerne sprøyten. Vente på PBS renne ut av blæren. Trykk forsiktig magen til å evakuere PBS.
- Kast PBS i kateter med en pipette i avfall begeret.
- Gjenta PBS vask (trinn 3.4-3.6) for to ganger.
Merk: Det er viktig å arbeide forsiktig under følgende vask. I kateter eller svikt i automatisk ut blodstrøm væske angir vanligvis urinrøret er gjennomboret gjennom. Det er også viktig å unngå å innføre luftbobler, som de vil redusere electroporation effektivitet.
4. plasmider levering
- 70% etanol gjelder mus magen og bruke skalpell lage en loddrett innsnitt av 1 cm til åpne abdominal huden over blæren.
- Pipetter minst 20 µL av plasmider pluss Trypan blå løsning i den ytre enden av kateter, og feste sprøyten.
- Injisere plasmider løsningen i blæren. Hvis blæren blir blå, er injeksjon vellykket. La noen væske i kateter å unngå å skape luftbobler i blæren.
- Grab eksterne urethral munnstykket ved hjelp av pinsett, og deretter fjerne kateter og sprøyten. Bruke en streng for å stramme eksterne urethral munnstykket. Gjøre to løkker med strengen og deretter slips med to knop.
Merk: Innstramming av den urethral er viktig for å hindre tilbakestrømning av plasmider. - Slå på electroporation generator med følgende parametere: 33V, 50 ms arbeidstid og 950 ms intervalltiden.
- Hold blæren med pinsett og knip blæren med to elektroder. Skyv fotpedal utføre electroporation.
Merk: De elektriske pulser er satt til å skje 5 ganger med korte intervaller etter hver pedal push. Musen kan nappe i denne prosessen. Skyve fotpedalen flere ganger kan effektivisere levering, men for mange elektriske pulser kan skade vev integriteten til urothelium.- Unngå kontakt mellom pinsett og elektrodene, som dette vil generere en gnist.
5. gjenoppretting
- Sutur mage og hud åpningen med sterilt kirurgisk Sutur og klipp. Bruke jod på såret.
- Fjerne dyret fra isoflurane systemet. Administrere buprenorfin smertestillende (0,1 mg/kg) subcutaneously for å lindre etter kirurgiske smerte.
- Holde dyr på oppvarming pad og returnere det til hjem buret etter full gjenoppretting. Sjekk dyret minst én gang daglig for normale mobilitet, drikking og fôring atferd og ingen tegn til infeksjon til snittet blir helbredet, og fjern deretter klippene. Administrere påfølgende injeksjoner av buprenorfin smertestillende hvis dyret viser smerte symptom som redusert grooming, økt aggressivitet, og vocalization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere suksess gen levering i blæren urothelium, brukte vi pCAG-GFP15 plasmider for electroporation. 20 µL av plasmider og Trypan blå løsning ble injisert gjennom urinrøret og 5 elektriske pulser ble administrert. Etter 48 timer, vi dissekert musen blæren og observert flekker av GFP fluorescens under disseksjon fluorescens mikroskop, mens en negativ kontrollerer blæren som ikke gjennomførte electroporation viste ingen GFP signal (figur 1A). Når vi utført immunofluorescence farging av appa blæren vev med cytokeratin (CK) 5, CK18, og GFP antistoffer, fant vi at GFP signalet var tilstede i paraply, middels, og basal celler, men ikke i muskelen lag (figur 1B), angir god spesifisitet av plasmider leveres til urothelium. Ca 15% av de urothelial cellene er GFP+slik klonal Art bør være ideell for kreft modellering siden svulster vanligvis starte fra enkeltceller.
Figur 1: vellykket levering av pCAG-GFP plasmider til musen blæren urothelium. (A) sammenligning av en blære som gjennomgikk electroporation (høyre) til en negativ kontroll blæren (til venstre) viser at electroporation ble slått blæren grønne. (B) Immunofluorescence farging av appa blæren vev viser mosaikk uttrykksmønster GFP+ celler i paraply (CK18+), middels (CK5+CK18+), og basal (CK5+) urothelial lag. Skala bar i tilsvarer 1 mm, og B 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electroporation forbedrer cellemembranen permeabilitet og er en kraftig teknologi for gene electrotransfer16. Gen levering i levende gnagere av electroporation er ofte brukt i nevrobiologi felt17,18,19,20,21. Dens potensielle anvendelser i mange andre organer har ikke vært mye utforsket. Vi vet er våre metoden beskrevet her den første rapporten om vellykket gen levering av electroporation til blære urothelium. Det tilbyr flere fordeler til adenovirus/lentivirus-baserte infeksjon metoder. Først er electroporation metoden lettere, tryggere og billigere å vedta fordi ikke-viral genetiske vektorer brukes og levering av DNA plasmider til bestemte organ nettsteder i vivo er relativt enkelt. Andre, unngår uønskede vert immunreaksjoner som ofte er knyttet til leveringen av virus vektorer22. Tredje i blæren negerer det behovet for kjemisk forbehandling av glycosaminoglycan laget, som normalt blokkerer virus binding til urothelial celler.
De viktigste trinnene i denne protokollen er catheterization, skylling og plasmider injeksjon. Ekstra forsiktighet og skånsom er nødvendig for å sikre at kateter ikke pierce gjennom urinrøret eller blæren veggen når innsetting og feste/fjerne sprøyten. Bruke tilstrekkelig smøremiddel for å fullt ut dekke den ytre overflaten av kateter er også viktig. En annen sannsynlig årsak til svikt er innføringen av luftbobler i blæren under skylling og plasmider injeksjon, siden det vil redusere elektrisk ledningsevne. For å forhindre dette, anbefaler vi alltid forlate noen væske i kateter når du utfører disse trinnene.
Våre protokollen burde arbeide for voksne mus i alle aldre, fordi vi ikke observerer forskjell i levering effektivitet yngre (2 måneder) og eldre (1 år) mus. Flere faktorer kan påvirke plasmider levering effektivitet. Vi anbefaler 20 µL av plasmider som minimal volumet for injeksjon som lavere beløp ikke kan tilstrekkelig dekke overflatebehandling av blæren. Økende plasmider volum og konsentrasjon generelt gir høyere penetrasjon, men ingen ekstra fordel ble observert volumer utover 60 µL. gi flere elektriske pulser og berøre forskjellige flater av blæren med elektroder vil ha den størst innvirkning på å forbedre levering effektivitet. Parameterne electroporation beskrevet i denne protokollen er satt til Tillat permeabilization urothelial celler samtidig bevare vev integritet, siden høyere spenning tendens til å indusere celledød. Det er mulig å justere disse parameterne for ytterligere optimalisering. Musen til mus varianter og håndtering av forskeren kan påvirke effektiviteten betraktelig. Avhengig av målet med prosjektet anbefaler vi utføre studier for å bestemme de beste parameterne for hver bestemt eksperiment. For eksempel i modellering kreft initiering og klonal vekst, kan en lavere gjennomtrenging være ønsket.
Som bevis-av-prinsipp for våre leveringsmåte, GFP uttrykk kan visualiseres i blæren så tidlig som 36 h etter electroporation, og kan vedvare i minst to uker. Med denne nye metoden er det nå mulig å levere DNA plasmider til musen blæren rask og rimelig for gene overuttrykte eller ned-regulering og genom redigering. Den åpner nye muligheter for blæren utvikling og sykdommer, samt bygge romanen autochtonous blære kreft modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesse.
Acknowledgments
Vi takker Professor Bin Chen og Dr. Yue Zhang Kendy Hoang for hjelp med electroporation systemet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Santa Cruz kreft nytte gruppe og NIH til Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Xue, W., et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature. , (2014).
- Sanchez-Rivera, F. J., et al. Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing. Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).
- Romero, R., et al. Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis. Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).
- Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium. Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).
- Lilly, J. D., Parsons, C. L. Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier. Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).
- Yamashita, M., et al. Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer. Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).
- Engler, H., et al. Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents. Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation. J Vis Exp. (43), (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. Immune responses to lentiviral vectors. Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).
